Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Summary

Provided is a protocol for developing a real-time recombinase polymerase amplification assay to quantify initial concentration of DNA samples using either a thermal cycler or a microscope and stage heater. Also described is the development of an internal positive control. Scripts are provided for processing raw real-time fluorescence data.

Abstract

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to quantify DNA sample concentration using a standard curve. In this manuscript, a detailed protocol for developing and implementing a real-time quantitative recombinase polymerase amplification assay (qRPA assay) is provided. Using HIV-1 DNA quantification as an example, the assembly of real-time RPA reactions, the design of an internal positive control (IPC) sequence, and co-amplification of the IPC and target of interest are all described. Instructions and data processing scripts for the construction of a standard curve using data from multiple experiments are provided, which may be used to predict the concentration of unknown samples or assess the performance of the assay. Finally, an alternative method for collecting real-time fluorescence data with a microscope and a stage heater as a step towards developing a point-of-care qRPA assay is described. The protocol and scripts provided may be used for the development of a qRPA assay for any DNA target of interest.

Introduction

Kantitatif nükleik asit amplifikasyon çevre, gıda kaynaklı ve su patojenlere tespiti için hem de klinik teşhis için önemli bir tekniktir. Gerçek zamanlı nicel polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR), HİV-1 virüs yük testi, bakteriyel patojenlerin saptanması, ve bir çok diğer organizmalar ¹ taranması için, örneğin nükleik asitlerin, duyarlı, spesifik, ve nicel tespiti için altın standart yöntemdir ^{– 3.} Gerçek zamanlı qPCR sırasında primerler döngülerinde patojen DNA'yı çoğaltmak ve bir flüoresan sinyal her bir döngüde numunede büyütülmüş DNA miktarı ile orantılı olduğundan oluşturulur. Patojen DNA'ya ait, bilinmeyen bir konsantrasyonunu ihtiva eden bir numune standart örneklerinin ilk DNA konsantrasyonuna ve flüoresan sinyal belirli bir eşiğe ulaştığı zaman (yani, çevrim eşiği, veya _{C, T)} ile ilgilidir, bir standart eğri kullanılarak ölçülebilir.

<p class=Gerçek zamanlı qPCR bu rekombinaz polimeraz amplifikasyonu (ECP) olarak sonuçlar, alternatif izotermal amplifikasyon teknikleri almak için pahalı termal döngü cihaz ve birkaç saat gerektirirken, çünkü "jove_content"> ⁴ geliştirilmiştir. Bu platformlar genellikle daha hızlı sonuç sağlar ve daha az pahalı, basit ekipmanla gerçekleştirilebilir bir alt, bir sıcaklık, bir nükleik asitleri amplifiye. Nokta-bakım uygulamaları için özellikle çekici dakika içinde DNA güçlendirir RPA, düşük büyütme sıcaklığı (37 ° C) gerektirir, ve kirliliklerin ^5,6 varlığında aktif kalır. ^{12 –} RPA tahlilleri biothreat maddeler ^7'nin gıda ^maddesi analizi, patojenin tespit edilmesi, kanser ilaç tarama ve saptama da dahil olmak üzere, geniş bir uygulama yelpazesi için geliştirilmiştir. Bununla birlikte, nükleik asitlerin ölçümü için RPA kullanımı ^13,14 sınırlıdır.

Bir önceki çalışmada, bu sho olduwn gerçek-zamanlı kantitatif RPA (qRPA) ¹⁵ mümkündür. Burada daha ayrıntılı bir protokol bir standart eğri, QPCR kullanılarak miktar tayini için benzer bir yöntemi kullanarak bilinmeyen örnekleri ölçmek için gerçek zamanlı kantitatif RPA ile sağlanır. Bu protokol düzgün çalışıp sistemi sağlamak için bir iç pozitif kontrol (IPC) geliştirmek için nasıl yanı sıra, bir proof-of-concept olarak, HIV-1 DNA tespiti için termal döngü bir RPA reaksiyonu gerçekleştirmek açıklamaktadır. Eğitim verileri kullanarak standart bir eğri oluşturmak için bir termal döngü veya mikroskop ve veri analizi kullanılarak veri toplama da ayrıntılı. Son olarak, özel bir komut dosyası ile standart eğri kullanılarak bilinmeyen örnekleri ölçülmesi için bir yöntem gösterilmiştir. Bu qRPA tekniği bilinmeyen konsantrasyonları ile numunelerin miktarının sağlayan ve geleneksel gerçek zamanlı qPCR üzerinden pek çok avantajı vardır.

Protocol

1. Program Gerçek zamanlı qRPA Reaksiyonlar Termal Döngü

1. Termal döngü yazılımı yeni bir protokol oluşturmak.
   1. 1 dakika için 39 ° C: bir ön inkübasyon adımı yerleştirin.
   2. İkinci adım ekleyin: 39 ° C plaka okuma ardından 20 sn.
   3. Son olarak, ikinci bir adım tekrarlar 59 kez daha "GO" takın.
   4. Protokolü kaydedin.
2. Yazılımın "plaka editörü" sekmesinde yeni bir plaka oluşturun. RPA reaksiyonlarının yerlere gelen plaka üzerinde kuyular seçin (burada, kullanım kuyuları A1, A4 A8, B1, B4 ve-B8).
   NOT: Bu veri analizi özel bir komut dosyası kullanılarak yapılır gibi kuyulara (örneğin, "Standart", "NTC") örnek tipi, belirtilen olup olmadığını önemli değildir.
   1. Sadece HIV-1 DNA içeren deneyler için, tüm kuyuları için "HEX" floroforu seçin. HİV-1 DNA ve bir iç pozitif co içeren deneyler içinntrol, "HEX" ve tüm kuyuları için "FAM" fluorophores hem seçin. Plaka kaydedin.

2. HIV-1 qRPA Deney için hazırlanın

1. QPCR için olarak belirlenen pipet, pipet uçları, vortexer ve mini santrifüj içeren bir belirlenen preamplıfikasyon çalışma alanında RPA reaksiyonları birleştirin. RPA büyüklük kadar on emir tarafından tek bir DNA kopyasını yükseltmek olabilir (veriler gösterilmemiştir), işlemek ve belirli bir amplifikasyon sonrası bölgede post-yükseltilmiş DNA ürünleri içeren tüplerde atmayın.
   1. Tüm preamplıfikasyon reaktifler ve sonrası amplifikasyon ürünleri arasındaki teması önleyin. Önce ve tüm deneyler sonrası ön-amplifikasyon çalışma alanları ve% 50 çamaşır suyu ile ekipman püskürtün. Aşırı çamaşır suyu silip bir kağıt havlu kullanın.
2. Satınalma ileri primer dizisi 5'-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG, G-3 've primer dizisi 5'-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TT tersTicari DNA sentezcileri T GTT TTT G-3 '. Prob dizisi 5'TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC Satınalma [SIMA / HEX] GC [THF] C [dT-BHQ1] GTA CCC CCC CCC, AAT C -3 'ticari kaynaklardan. Kullanımdan önce 10 uM'lik bir konsantrasyonda alikolar içinde 4 ° C de, tüm primerler ve problar saklayın.
   NOT: qRPA tahlili özel bir HIV-1 dizisi güçlendirir. Bu kanıt-of-concept deneyi için, Sutton ve ark., Hedef dizisi ¹⁶ ihtiva tarafından açıklanan plazmid PHIV-IRES- eYFPΔEnvΔVifΔVpr kullanın. QRPA deneyler için, plazmid pH 8.0'da 10 mM Tris, 0.1 mM EDTA içeren bir tampon içinde ul başına 1, 10, 10 ^2, 10 ^3, 10 ⁴ kopyasını ihtiva eden çözeltiler içinde, 4 ° C'de muhafaza edildi ve 1 ng / ul insan genomik taşıyıcı DNA (360.486). Bu taşıyıcı madde, DNA konsantrasyonunun, HIV-1 tan ¹⁷ için kullanılan ticari bir serum DNA ekstraksiyon kiti elde edilen DNA konsantrasyonu eşdeğerdir. Bunlar HIV-1qRPA reaksiyonlarında şablonlar bir standart eğri oluşturmak için seyreltme kullanılmıştır.

3. HİV-1 qRPA Standart Eğri monte

1. Adım 2.1.1 de açıklandığı gibi qRPA reaksiyonları monte etmeden önce, preamplıfikasyon çalışma alanını hazırlamak. 4 ° C 'de depolama 96 oyuklu bir soğuk blok yerleştirin.
2. 12 reaksiyonlar için reaktif hazırlanması:
   1. Magnezyum asetat, rehidrasyon tampon ve ön-amplifikasyon çalışma alanına 12 RPA tepki pelet taşıyın.
   2. Magnezyum asetat ve oda sıcaklığında rehidrasyon tampon çözülme.
   3. Kısım mikrosantrifüj tüpüne magnezyum asetat 32.5 ul (reaksiyon başına 2.5 ul).
   4. Bir 13x ana karışımı hazırlayın. Ana karışım için ayrı bir mikrosantrfuj tübüne rehidrasyon tamponu 383,5 ul (reaksiyon başına 29.5 ul) eklenir. Ana karışımına nükleaz serbest su 41.6 ul (reaksiyon başına 3.2 ul) ekleyin. Ana karışımı karıştırın.
   5. Magnezyum -asetasit dön-20 ° C 'de depolama te ve rehidrasyon tamponu.
   6. Photobleaching en aza indirmek için aşırı ışığa maruz kaçınarak, preamplıfikasyon alanına buzdolabından astar ve prob alikotları taşıyın.
   7. Ileri 10 mcM her 27.3 ul ekleyin ve ana karışımı astar (reaksiyon başına astar başına 2,1 ul) ters.
   8. Ana karışımına 10 uM HEX-işaretli HIV-1 DNA prob 7.8 ul (reaksiyon başına 0.6 ul) ekleyin.
   9. Primerler İade ve depolama soruşturma.
3. Bölüm 1.2'de tarif edilen plaka düzeni Eşleşen, 2 alçak 8 oyuklu bir PCR tüpü şeritlerin 5 kadar sağ boruların her birinde en sol tüplerin her 1 enzim tanesi içinde 1 enzim pelet yerleştirin.
4. Dikkatle her tüp için yeni bir pipet kullanarak ve pelet tamamen çözülene kadar yavaşça ucu ile ana karışımı ve pelet karıştırarak, bir enzim pelet içeren her tüp ana karışımı 37.5 ul ekleyin. Kabarcık Formatı önlemek için hafifçe karıştırınüzerine, ve reaksiyon hacmi kaybını önlemek için dikkatli bir ucu çıkarın.
5. Tüm enzim topakları ana karışımı ile Rehidrate sonra, 4 ° C depolama 96-de soğuk blok almak. Ana karışımı soğuk soğuk blokta PCR tüp şeritler yerleştirin.
6. Master karışımı soğurken, Bölüm 1 'de tarif protokol ve plaka ile termal döngü yazılımı yükleyin.
7. PCR tüpleri biraz daha geniş olması şeffaf plastik mikro-mühür yapıştırıcı 2 şeritler kesin ve 2 düz PCR tüp şerit kapaklarını almak.
8. (Mikrolitre başına HIV-1 plazmidi, 0, 1, 10 ^1, 10 ^2, 10 ^3, 10 veya ⁴ kopyasını ihtiva eden) depolama 6 şablon alikotları al.
9. Bu şablon konsantrasyonu için belirlenen boruların her şablonun 10 ul ekle. Yavaşça ana karışımı ve şablonu karıştırmak için ucu ile çözüm karıştırarak, her tüp için yeni bir pipet kullanın. M doğru konuma şablon eklemek için emin olunBölüm 1.2'de açıklanan plaka düzeni atch.
10. Mikrosantrifiijde için PCR tüp şerit adaptörü yerinde olduğundan emin olun.
11. Bir qRPA katalizörü içeren, bir tüp yerleştirilir, her boru kapağına magnezyum asetat 2.5 ul koyun.
12. Yavaşça tam kapalı değildir ve ayrılabilir şekilde PCR tüpleri üzerine kapak yerleştirin. magnezyum asetat kapaklı uygun ve yukarıda açıkça görünür olacaktır.
13. PCR tüp tutucu her tarafına kapaklı her PCR tüpü bandı takın. RPA reaksiyonu başlatarak, kapakların dışında ve RPA reaksiyonu içine magnezyum asetat dönmeye minifuge kapağını kapatın. Tüm kabarcıklar ortadan kaldırır ve bütün sıvı, her bir tüp (10 sn) altında toplanır kadar santrifüjleyin.
14. Hızla PCR tüp şeritler kaldırmak ve qRPA reaksiyonları durdurmak için soğuk blok onları geri.
15. Dikkatle aerosol oluşumunu önlemek için kapakları kaldırmak ve kesim her PCR tüp şerit mühüraçık mikro-mühür film adettir.
16. Hızla termal döngü yürümek ve plaka düzeni (kuyular, A1-B8) eşleşen yerlerde termal döngü içine iki PCR tüp şeritler yükleyin. , Termal döngü kapağını kapatın "Başlat Çalıştır" a tıklayın ve deney için bir dosya adı belirlemek.
    NOT: Üretici inkübasyondan 5 dakika sonra numune ajite önermesine rağmen, bu aşama, bu özel deney için gerekli değildir ve göz ardı edilebilir.
17. Çalışma tamamlandıktan sonra, ham floresan verilerini görüntülemek için "Ayarlar", "Baseline Ayarı," "Hayır Baseline Çıkarma" seçeneğini seçin. Seçerek bir elektronik tablo programına veri ihracat "Export", "Excel tüm Veri Sayfaları verin." Bir dosya zeyilname ile "Niceleme Amplifikasyon Sonuçlar" ham gerçek zamanlı floresan verilerini içeren oluşturulur.

4. İç Pozitif Kontrol geliştirin

1. Hedef numunede bulunan olası bir türden gelen bir DNA dizisi seçin. dizisi hedef dizisinin üretimi tercih edilir, böylece hedef amplikonun daha uzun olması gerekir.
   NOT: Bu organizma kanında bulunabilir pek mümkün değildir ve başka bir proje laboratuarda mevcut olduğu için, bu deneyde Cryptosporidium parvum, bağırsak paraziti için, IPC dizisinin oluşturulması için şablon olarak hizmet etmek üzere seçildi. IPC dizisini oluşturmak için, ayıklayın ve C DNA arındırmak Parvum ookisti olarak başka bir yerde ¹⁸ nitelendirdi.
2. Ileri Satınalma (5'-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G / ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3 ') ve ters (5'CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G / TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3 ') ticari kaynaklardan primerler. Bu tahlilde kullanılan IPC PCR primerleri, Şekil 1 'de gösterilen ve IPC şablon D etme bir bölge içerirlerUA (örneğin, Şekil 1 'de mor C. Parvum) hedef organizmaya etme ve bir bölge (örneğin, HIV-1, Şekil 1' de mavi).
3. Astar ve IPC şablon DNA kullanılarak PCR gerçekleştirin.
   1. Polimeraz hariç, üreticinin talimatlarına uygun olarak Phusion Yüksek Sadakat DNA Polimeraz kiti reaktifler kullanılarak 50 ul PCR reaksiyonları, bir araya getirin. DNA şablonu ve Phusion Tampon HF 2 ul kullanın.
   2. 98 ° C, 62 ° C 'de 30 saniye ve 72 ° C'de 30 saniye, 15 saniye 40 döngü, ardından 98 ° C'de 60 saniye, ardından 98 ° C'de sıcak bir başlangıç, sonra her bir reaksiyon için Phusion polimeraz ekleme 5 dakika boyunca 72 ° C'de son uzatma ile soğutuldu. Isıl çevrimden sonra, 4 ° C'de örnekleri tutun.
   3. % 2 TAE agaroz jeli üzerinde jel elektroforez ile örnekleri analiz ve özü ve mikro santrifüj protokolü ile birlikte göre QIAquick Jel Özütleme Kiti kullanılarak DNA'nın saflaştırılmasıkiti.
4. QRPA kullanılarak amplifiye etme kabiliyetleri IPC aday koruyucu.
   1. Bölüm 3'te tarif edildiği gibi IPC (5'-TAG AGG TGA CAA GAA ATA ATA ACA CAG GAC [FAM] t [THF] t [dT BHQ1 özgü HİV-1 primeri, bir FAM etiketli sonda kullanılarak, qRPA tepkileri hazırlanması ] 0 GGT TTT GTA ATT GGA A -3 '), ve toplam 10, 10 ^2, 10 ^3, kopya tüm konsantrasyonlarını test reaksiyon başına her IPC adayı, 10 ^4, veya 10 ⁵ kopya.
   2. En tutarlı yükseltir ve en düşük sınırı-of-algılama vardır IPC aday seçin.
5. IPC DNA optimal konsantrasyonunu belirlemek için, HIV-1 ve IPC eş yükseltmek.
   1. Rehidrasyon tamponu 29.5 ul ileri primer [10 uM] olarak RPA 2.1 ul, RPA 2.1 ul primer [10 uM] tersine, HİV-1, HEX, 0.6 ul: Bölüm 3 benzer şekilde, her biri 50 ml'lik bir reaksiyon içinde aşağıdaki kombine -etiketli prob [10 uM], 10 ulHİV-1, değişen konsantrasyonlarda DNA, magnezyum asetat, 2.5 ul, 1 enzim pelet. Bunun yerine IPC FAM-işaretli prob [10 mcM] 0.6 ul ve IPC DNA 2.6 ul ekleyin, adım 3.2.4 yapıldığı gibi nükleaz ücretsiz su 3.2 ul ekleyerek. QRPA tek başına IPC DNA (floresans sinyali üretimi miktarı olan örneklerde üretilen floresan ile üretilen daha büyük olan en düşük konsantrasyon olarak tanımlanmıştır LOD ile gerçekleştirildiğinde limit arasında algılama (LOD) IPC konsantrasyonunu kullanma bir hedef DNA).
   2. Bölüm 1.1'de tarif edilen protokol kullanılarak inkübe edin.
   3. IPC her numunede yükseltmek yoksa, yüksek büyüklükte bir IPC konsantrasyonu bir sipariş ile deney tekrarlanarak düşünün. HİV-1 deneyi IPC en uygun DNA konsantrasyonu, 10,000 kopya / ml. Ya IPC veya HIV-1 DNA amplifikasyonu varsa örnekleri geçerli kabul edilir olsa da, ideal olarak IPC için tespit amplifikasyon arzetmektedirHer reaksiyon.

5. Birden Deneyler bir standart Curve Bina

1. Bölüm 3.13 açıklandığı gibi, her deney bir elektronik tablo programı ihraç edilmiştir için veri sağlamak.
2. Açık ve komut "JoVE_qRPA_standard_curve.m" çalıştırın. Tüm girişler, otomatik olarak komut penceresinde istenir. Betik başlatılır sonra, kullanıcı otomatik olarak "veri dosyalarının sayısı" tayin istenir standart eğri oluşturmak için kullanılır.
3. Komut penceresinde, dosya sayısı girin standart eğri ve basın oluşturmak için kullanılacak yazın.
4. Komut penceresinde örneklerin sayısını ve (her girişten sonra enter tuşuna basarak) Her eğitim dosyasındaki çoğaltır sayısını yazın.
   Not: Bölüm 1.2'de tarif edilen plaka taslağına, farklı konsantrasyonları ile 6 örnekler ve her bir örnek 2 kopya) vardı.
5. Komut penceresini en DN yazın,Girin (log10 kopya olarak) standart eğri oluşturmak ve basın için kullanılan bir konsantrasyon (Bölüm 1.2'de açıklanan plaka düzeni için, en düşük şablon konsantrasyonu '1' log10 kopya olduğunu).
6. Komut penceresinde Tipi (log10 kopya olarak), her standart arasındaki konsantrasyon farkı enter tuşuna basın (Bölüm 1.2'de açıklanan plaka düzeni için, konsantrasyon aralığı '1' log10 kopya olduğunu).
7. İstendiğinde sonra, komut penceresinde "Yamaç eşiği" yazın ve enter tuşuna basın.
8. Komut penceresinde, "Numara (z) pozitif eşik için arka plan üzerinde standart sapmalar" yazın ve enter tuşuna basın. 1-5 z aralığı için tipik değerler.
9. Belirtin veriler termal döngü ('1') kullanılarak toplanmıştır olsun, * .tiff mikroskop görüntüleri ('2'), ya da * numara '1', '2 yazarak .jpg mikroskop görüntüleri (' 3 '),' veya 'den 3' ve psalamura girin.
10. Yeni bir IPC eşiği ayarlamak için veya sorulduğunda, sırasıyla 'n' ya 'y' yazarak eşiği için varsayılan değeri kullanmak için seçin.
11. Sonraki, standart eğri oluşturmak için kullanılan elektronik tablo dosyalarının her birini seçin.
    NOT: Komut dosyası otomatik HEX ve FAM floresan verilerini ithal edecek; Her reaksiyon (floresan sinyalleri HEX veya FAM kanalları için eşik aşıldı mı, yani) geçerli olup olmadığını belirlemek; üstel, doğrusal r ² katsayısı belirlemek ve ikinci dereceden polinom uyum; arsa standart eğri oluşturmak için kullanılan her bir örnek için "döngüsü eşik karşı log10 kopya"; ve yine giriş parametreleri tüm yeniden girmesini gerektirmeden doğrulama deneyleri için standart eğri yeniden inşa etmek için gerekli değişkenleri içeren bir elektronik tablo dosyası oluşturun.

6. Deney Doğrulama ve kullanma Bilinmeyen Numune QuantificationStandart Eğri

1. Bilinen konsantrasyonlarda örnekleri kullanılarak testin hassasiyetini ve doğruluğunu tahmin veya bilinmeyen konsantrasyonlarda örnekleri ölçmek için kullanmak komut "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m" kullanın.
   NOT: Daha önce yayınlanan araştırma üstel uyum en iyi r-kare katsayısı ¹⁸ olduğunu ortaya koymuştur Çünkü, bu komut, standart eğri için bir üstel uyum kullanır. Uyum farklı bir tür arzu edildiği takdirde, komut de bu doğrultuda modifiye edilebilir.
   1. Açık ve komut "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m" çalıştırın. Betik başlatılır sonra, kullanıcı otomatik olarak komut penceresine tüm girişleri girmesi istenir.
   2. Enter '1' bilinen örnek konsantrasyonları ile bir standart eğri kullanarak bir tahlil doğrulamak ya da girmek için '2' bilinmeyen örnekleri ölçmek için.
   3. İstendiğinde, ya kayıtlı bir standart eğri seçmek veya th girerek yeni bir inşaotomatik komut penceresinde İstenen e bilgileri (Bölüm 5 den "JoVE_qRPA_standard_curve.m" komut dosyası için gerekli olan aynı bilgileri).
   4. Deneylerin numarasını yazın (yani, elektronik tablo dosyaları) doğrulama / ölçümü için analiz.

Bir Floresan Mikroskop ve Isıtmalı Chip kullanma Veri Toplama 7. Hazırlık

1. Floresan mikroskop yerinde bir sahne ısıtıcı ve 1-Kanal Hassas Yüksek Stabilite sıcaklık kontrolörü vardır emin olun.
2. Floresan mikroskop olun heyecanlandırmak ve her fluorofordan floresan toplamak için bir filtre küp vardır. Heyecan ve bir GFP filtresi (uyarılma kan basıncı 470/40 nm, emisyon BP 520/50 nm) ile IPC DNA amplifikasyonu esnasında üretilen FAM floresanı toplar. Heyecan ve HEX filtre (uyarım BP 530/30 nm, emisyon BP 575/40 nm) HIV-1 DNA amplifikasyonu esnasında üretilen HEX floresan toplar.
3. Termal döngü veri toplama çoğaltmak için bir otomatik algoritma oluşturmak için mikroskop script düzenleme yazılımı kullanın.
   1. İlk çekim kapatmak için "Ayarlar" adımı yerleştirin. Sonraki 60 saniyeye pozu ayarlamak için bir "Poz" adım ekleyin. 1 dakika ön inkübasyon dönemi uygulayan 60 sn gecikme, yürütmek için bir "Yapış" takın. GFP filtresi çalışma grubu değiştirmek için bir "ayarlama" adım ekleyin. 200 msn maruz ayarlamak için başka bir "Poz" adımı yerleştirin. GFP veya HEX filtre küpleri kullanarak tüm riskler, 200 msn olarak ayarlanır.
   2. "Poz" aşamasından sonra, bir "Ek Bileşen" ekleyin ve görüntü alınacak olan kamera belirtin. Bir kullanıcı tanımlı geçici bir klasöre görüntü kaydetmek için deklanşöre ve "Resmi Kaydet" adımı kapatmak için başka bir "ayarlama" adımı kullanın.
   3. Başka bir "ayarlama" adımı ve th kullanarak HEX filtre küp Sonraki anahtarıtr ", Snap" 200 msn, bir bir "Pozlama" ekleyin ve "Resmi Kaydet" adımı.
   4. Yerine 60 (yakın çekim 20 sn bir başlangıç ​​gecikme ile bu işlemi 59 kez tekrarlayın 20 sn, GFP filtre küp anahtarı, 200 milisaniye ayarlanmış pozlama bekleyin, çıtçıt, yakın deklanşör, HEX filtre küp geçiş, set maruz kalma, tasarruf 200 msn) oturtun.
4. QRPA reaksiyonları yapacak bir çip oluşturun.
   1. Mikroskop kullanılarak deneyler için, dosya JoVE_qRPA_base.ai% 100 güç,% 10 hızına ayarlanmış bir lazer kesici kullanılarak 1/8 "kalın siyah akrilik levhadan bir 40 x 15 mm'lik dikdörtgen temel kesmek için kullanılır.
   2. Sıra 1.5 mm kalınlığında şeffaf akrilik bir levha ise 5 mm çapında yuvarlak bir delik kesim 10 x 10 mm kare oluşan reaksiyonu kesmek için dosyayı JoVE_qRPA_well.ai kullanın.
   3. Superglue jel kullanarak tek bir tabana üç kuyu kadar takın.
   4. Kuru gecede.

8. Veri Toplama ve Analysis bir floresan mikroskop kullanılarak

1. Otomatik veri toplama komut JoVE_AxioVision_Script.ziscript yükleyerek veri toplama için mikroskop hazırlayın.
   1. 48 ° C'ye sahne ısıtıcı ayarlayın ve yaklaşık 20 dakika sahne ısıtıcı tepki çip ısıtın. 48 ° C'lik bir sıcaklık ayarı de reaksiyonda 39 ° C'lik bir sıcaklığı muhafaza (veriler gösterilmemiştir).
   2. 10X, 0.45 NA amacı kullanarak, tepkime iyi ile yerine GFP filtre iç kenarı üzerine odaklanır. akrilik kenarları lazer kesim sonrası otofloresan ve kolayca görüntülenebilir. Tüm veriler toplanır kadar odaklanarak sonra, mikroskop sahne yüksekliğini ayarlamak yok.
2. Aşama 4.5.1 tarif edildiği gibi belirli bir ön amplifikasyon çalışma alanında qRPA ana karışımı bir araya getirin. Her numune için, bir mikrosantrifüj tüpü içinde bir enzim pelet, ana karışımı, ve HIV-1 DNA örneğinin karıştırın. İlk reaksiyonunun magnezyum asetat 2.5 ul eklen, ve kısa bir süre için girdap.
3. Hızla floresan mikroskop qRPA örneği içeren mikrosantrifüj tüp taşıma.
   1. Dikkatle iyi kabarcıkları yaratmadan reaksiyona giren RPA reaksiyonu 30 ul pipetle. Buharlaşmayı önlemek için RPA reaksiyonu üzerinden PCR dereceli mineral yağ damla yerleştirin.
   2. Iyi, sadece merkezi değil, oto-floresan akrilik kenarları herhangi bir görüntü özen, mikroskop objektif altında iyi doğrudan yerleştirin. Iyi konumlandırılmış sonra komut FAM filtresi küp ve HEX filtre, küp, her 20 saniyede bir kullanarak bir JPEG görüntü kullanılarak bir JPEG görüntü oluşturur 7. otomatik komut dosyasını çalıştırın.
4. Komut dosyası tamamlandıktan sonra, ek örnekler çalıştırmadan önce geçici depolama klasörünün dışına bu görüntüleri aktarmak.
   1. 2 klasör oluşturun: 1 Her fluorofor (yani, 'HEX' ve 'FAM') için. Aynı ana klasörde her iki klasörleri saklayın. Her fluorofor olarakklasör, numune (örneğin, 0, 10, vs.), bu DNA, kopya sayısı ile işaretlenmiş bir klasör oluşturur.
   2. 'HEX' klasöründe gelen alt klasör içine öneki 'HEX' ile tüm dosyaları aktarın. 'FAM' klasöründe gelen alt klasör içine öneki 'GFP' ile tüm dosyaları aktarın.
5. 0, 10, 10 ^2, 10 ⁴ 10 ^3, 10 ^5, HIV-1 DNA kopyası ile qRPA reaksiyonları için tekrar Bölümler 8.2-8.4.
6. Bir deneyde tüm qRPA örnekleri için veri toplama sonra, komut dosyası tarafından istendiğinde, ". JoVE_real_time_intensity_to_excel.m" komut dosyası yüklemek sırayla alt klasörler her konsantrasyon için görüntüleri içeren 2 Fluorofor klasörleri içeren ana klasörü seçin.
   NOT: script otomatik HEX floresan verileri bir sayfa nam kaydedilir hangi ana dizinde bir elektronik tablo dosyası oluşturured 'HEX' ve FAM floresan verileri 'FAM' adlı bir tabaka kaydedilir. Her sayfasında, çevrim numarası B sütununda listelenen ve şablon konsantrasyonlarını artırmak için gerçek zamanlı floresan veri sütunları vb C, D, verilmiştir. Her gerçek zamanlı flüoresan sıfır noktası o zaman noktasında yakalanan görüntü ortalama floresan yoğunluğu.
7. Hücreler B2 çizmek için elektronik tablo programı varsayılan scatter plot işlevini kullanın: 'HEX' ve 'FAM' yaprak H61 gerçek zamanlı floresan görselleştirmek ve Şekil 2A, 2B, 3A, 3B ve bu benzer araziler oluşturmak için.
   Not: Aşama 8.6 üretilen tablo, aynı zamanda komut "JoVE_qRPA_standard_curve.m" ve "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m" kullanılabilmektedir.

Representative Results

Discussion

İstendiğinde MATLAB algoritması kullanarak anlamlı ölçüm verileri elde etmek için, kullanıcı uygun giriş değerlerini seçmeniz gerekir. Bölüm 5 ve 6 her komut başlatılması sonra, tüm giriş değişkenleri otomatik olarak komut penceresinde İstenen ve çıkışlar otomatik olarak oluşturulur. Bölüm 5.7 kullanıcı bir yamaç eşiğini seçmesi istenir. yamaç eşik değeri uyum korelasyon katsayısı (r ²⁾ karesini etkiler. Bir termal döngü ihraç ham floresan verileri kullanırken, 2.0 ve 5.0 arasındaki değerler yüksek r ² katsayısı elde etmek eğilimindedir. Bölüm 5.8 kullanıcı pozitif eşiğini ayarlamak için arka plan üzerinde standart sapma sayısını belirlemeniz gerekir. Pozitif veya negatif bir örnek puan için, komut otomatik olarak TES ihraç ham floresan verilerini kullanarak her bir numune için maksimum ve minimum floresan arasındaki fark Δ _örneği belirlerl cycler. Tüm hedefsiz kontrol örnekleri için ortalama fark Δ _{arka plan} ve standart sapma σ _{arka plan} hesaplar. Δ Δ _{örnek arka plan} üzerinde σ _arka × z daha fazla ise bir numune pozitif kabul edilir. Bölüm 5.10 varsayılan kullanıcı eşiği kullanabilir veya yeni bir eşiği belirlemek için karar verir. Kullanıcı yeni eşiğini ayarlamak istediğinde, deneysel olarak bir HİV-1, DNA mevcut olmadan 3 deneyler, her biri 12 RPA reaksiyonları yapılarak yeni eşiği belirlenir. Bu deneylerde, artı 3 standart sapma ile ilgili floresan yoğunluğu ortalama artışa eşik ayarlayın. Bölüm 6 tamamladıktan sonra, komut JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m otomatik (log10 kopya olarak) her qRPA reaksiyonu için tahmini DNA konsantrasyonu döndürür. Komut herhangi bir HIV-1 DNA örneğinde mevcut olduğunu belirlerse, tahmin edilen konsantrasyon ya da "Ne olarak listelenirİç pozitif kontrol için floresan sinyal bağlı olarak geçersiz HIV gatif "veya", "(σ _arka + Δ _arka × z) eşiği aştı. Kullanıcı bilinen örnek konsantrasyonları standart eğri doğrulama ise, komut dosyası da Tablo 1 benzer bir ek tablo dönecektir.

Doğru ölçümünü sağlayan bir gerçek zamanlı RPA test geliştirmek için, deneysel tutarlılık önemlidir. Örneğin, standart eğrinin ve doğrulama deneyleri için aynı primer ve prob alikotları kullanır. Ayrıca deneyler arasında, 4 ° C 'de, primer ve prob alikotları depolamak yerine -20 ° C ile donma-erime döngülerinden kaçınmak. Standart eğri ve doğrulama deneyleri için kullanılan şablon alikotları aynı şekilde saklanır. Aynı partiden RPA enzim pelet ve reaktifler üretici tavsiyelerine göre kullanılır. Son olarak, becaRPA tam büyütme oranını kontrol etmek gerçek 'döngüleri' yoksun kullanmak, kullanıcı adımlar standardizasyon kesinlikle şarttır. Reaksiyonları montaj, kullanıcı her zaman her adımda yaklaşık aynı süreyi harcama, aynı sırayla, aynı adımları izlemeniz gerekir. Reaksiyonlar her zaman yeni bir pipet ucu ile hafifçe karıştırılmış olması ve kabarcıklar her zaman giderilmelidir. Amplifikasyon önce reaksiyonlar tutarlı bir sıcaklıkta tutulmalıdır, ve termal döngü veya mikroskop yazılımı her zaman ölçümü etkileyebilecek sub-optimal sıcaklıklarda herhangi yükselmesini önlemek tepkileri yüklemeden önce hazırlanmış olmalıdır. İlk reaksiyon koşullarında herhangi bir değişiklik deneysel sonuçlarda tutarsızlık yol açabilir.

Veri toplamak için bir mikroskop kullanılarak, ilave değişkenler, flüoresan yoğunluğundaki varyasyonu en aza indirmek için kontrol edilmelidir. Bütün reaksiyonlar aşama ısıtıcıda, aynı bölgede yerleştirilmiş ve microsco olmalıdırpe her numune için kuyunun aynı bölgede odaklanmış olması gerekir. Bu uygulamalar takip bile, bir mikroskop toplanan floresan verileri nedeniyle doğal uyarma ışık tekrarlanan maruz kalma sonucu RPA reaksiyonlar, reaksiyon odaları içinde kabarcık oluşumu, ya photobleaching sırasında oluşturan yerel parlak noktalar değişkenlik gösterebilir. Bu değişkenlerin etkileri temel değişkenliği, tepe ve düşük değerleri göstermektedir mikroskobu (Şekil 4A ve 4B) üzerinde toplanan floresan verileri belirgindir. Bu özellikler, termal döngü (Şekil 3A ve 3B) üzerinde toplanır floresan verilerinden yoktur. Sonuçta, mikroskop veri toplama, sadece proof-of-prensibi amaçlıdır ve son tahlil daha hassas geometri ve bu değişkenleri en aza indirir yazılım kontrolü ile alan çalıştırılabilen floresan okuyucu uygulanacaktır.

Bir başka önemliqRPA tahlil geliştirme sürecinin yönü veri işleme tutarlılık olduğunu. yöntemler bölümünde tarif edilen protokol, bir termal döngü cihazı ve mikroskop toplanan (bir tablo dosyası halinde) ham floresans verilerini işlemek için komut kullanır. Standart eğri oluşturmak için kullanılan tüm deneyler aynı biçimlendirilmiş olması gerekir. Veri toplamak için bir termal döngü kullanırken, aynı plaka düzeni kullanılmalıdır, ve RPA reaksiyonları içermeyen kuyulardan elde edilen veriler ihraç olmamalıdır. Veri toplamak için bir mikroskop kullanılarak zaman, veri formatı otomatik termal döngü ihraç verilerin biçimini eşleşmelidir. D61, E2: hücrelerinde D2 olmalıdır şablon konsantrasyonları artırmak için C61 ve veri Örneğin, hedefsiz kontrol veri hücreleri C2 olması gereken bir deneyde her bir konsantrasyonu birden fazla kez tekrar varsa E61, vb ^2. çoğaltma seyreltme serisi yüksek konsantrasyona kadar bir hedef kontrolü (NTC) soldan sağa doğru sipariş edilir ve1 ^st hemen sağındaki sütunlarda kayıtlı seyreltme serisi çoğaltmak. Örneğin, 2 ile Bölüm 1.2'de kullanılan plaka taslağına seyreltme serisi, her numunenin 1 deney için floresan veri hücreleri C2 kaydedilmelidir, her bir örnek için çoğaltır: H61 ve floresan verileri her bir numune 2 suret halinde için seyreltme serisi hücreleri I2 kaydedilmiş olması gerekir: N61. Bölüm 1.2'de kullanılan plaka düzeni için, bu bir elektronik tabloya termal döngü yazılımı veri dışa aktarırken biçimlendirme varsayılan.

HIV-1 qRPA deneyler sağlanan Temsilcisi veriler RPA bilinmeyen örneklerde nükleik asit konsantrasyonunun ölçümü için kullanılan olabilir kanıtı-of-concept desteğini göstermektedir. Klinik yararlı HIV-1 viral yük testleri büyüklüğü en az 4 siparişler bir klinik yelpazede, 0.5 log10 kopya hassasiyet ve en az 200 kopya ^19,20 sınırı-of-algılama var. Tanımlanan HIV-1 DNA testi, bu cr uyguniteria ve Tablo 1 'de gösterildiği gibi, düşük konsantrasyonlarda, en doğrudur. Bu nedenle, bir ters transkriptaz aşamasının dahil edilmesi ile, bu sonuçlar, bir HIV-1 RT-RPA deney HIV-1 virüs yükünü ölçmek için bir potansiyele sahip olabileceğini düşündürmektedir Klinik örnekler. Algoritma parametreleri ayarlayarak, bir qRPA tahlili geliştirirken ayar klinik ihtiyaçlara bağlı olarak hassasiyet ve lineer dinamik aralık olabilir. 6 (pozitif örnekler için eşiğini belirleyen bir parametre) z ayar düşük ve yüksek duyarlılık ve doğruluk etkileyebilir ki göstermektedir Hedef konsantrasyonları. Bundan başka, bu şekilde amplifikasyonun hızının düşürülmesi, daha düşük bir sıcaklıkta kuluçkaya tepkileri ya da daha az magnezyum asetat kullanılarak miktar çözünürlük ve doğruluğunu arttırmak mümkün olabilir.

Kavram qRPA Analizin bu kanıtı, HIV-1 DNA ihtiva eden örneklerinin konsantrasyonunu ölçmek için kullanılabilir. Bu ma tarif qRPA deneyinuscript, gerçek zamanlı RPA reaksiyonları araya geliştirmek ve bir IPC ekran ve bilinmeyen örnekleri ölçmek için kullanılan bir standart eğri oluşturmak için ham floresan verilerin nasıl işleneceğini ayrıntılı talimatlar içerir. Ayrıntılı talimatlar birlikte bu protokol örnekleri, çok çeşitli DNA konsantrasyonu ölçmek için adapte edilmiş olabilir.

Materials

qRPA Assay
HIV-1 forward primer	Integrated DNA Technologies	custom DNA oligos	5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3’ 
HIV-1 reverse primer	Integrated DNA Technologies	custom DNA oligos	5’-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G-3’ 
HIV-1 probe	BioSearch Technologies 	custom DNA oligos	5’- TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA/HEX] GC [THF] C [dT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C -3’ 
IPC probe	BioSearch Technologies 	custom DNA oligos	5’-AGG TAG TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [dT-BHQ1] GGT TTT GTA ATT GGA A -3’
RPA exo reagents (pellets, rehydration buffer, magnesium acetate	TwistDx	TwistAmp exo
PCR tube strips	BioRad	TLS0801
PCR flat cap tube strips	BioRad	TCS0803
Micro-seal adhesive	BioRad	558/MJ 
HIV-1 target (pHIV-IRES- eYFPΔEnvΔVifΔVpr)			custom plasmid, see: Segall, H. I., Yoo, E. & Sutton, R. E. Characterization and detection of artificial replication-competent lentivirus of altered host range. Molecular Therapy 8, 118–129, doi:10.1016/S1525-0016(03)00134-5 (2003).
Human male genomic DNA	Applied Biosystems	360486
96 well cold-block	Cole Parmer	EW-36700-48
Thermal cycler	BioRad	CFX96
MiniFuge	VWR	93000-196
Vortex	VWR	58816-121
Tris buffer 1.0 M, pH 8.0	EMD Millipore	648314
EDTA 0.5 M, pH 8.0	Promega	V4321
Nuclease free water	Ambion	AM9937
IPC Development
Cryptosporidium parvum IPC template	Waterborne Inc	P102C	It is also possible to order a double stranded synthetic target from IDT if the user is unequipped to work with C. parvum (a BSL-2 infectious agent). PCR and RPA primers for C. parvum were designed using GenBank accession number AF115377.1
PCR long forward primer	Integrated DNA Technologies	custom DNA oligos	5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G/ ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3’
PCR long reverse primer	Integrated DNA Technologies	custom DNA oligos	5’- CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G/ TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3’
Phusion High-Fidelty DNA Polymerase	New England Biolabs	M0530S
Qiaquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
TAE 10X buffer	EMD Millipore	574797
Agarose	Sigma Aldrich	A9539
Microscope Experiments
Upright fluorescence microscope	Zeiss	Zeiss Imager.J1
Stage heater	Bioscience Tools	TC-GSH
1-Channel Precision High Stability Temperature Controller	Bioscience Tools	TC-1100S
FAM/GFP filter cube	Zeiss	filter set 38 (000000-1031-346)	excitation BP 470/40 nm, emission BP 520/50 nm
HEX filter cube	Chroma	49014	excitation BP 530/30 nm, emission BP 575/40 nm
Laser cutter	Engraver's Network	VLS3.60
1/8" black acrylic	McMaster Carr	8505K113
1.5 mm clear acrylic	McMaster Carr	PD-72268940 
Super glue	Office Depot	Duro super glue 
PCR grade mineral oil	Sigma Aldrich	M8662-5VL
Data Analysis
Microsoft Excel	Microsoft
MATLAB	MATLAB
MATLAB script: "JoVE_qRPA_standard_curve.m”	Included in SI
MATLAB script: "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m”	Included in SI
MATLAB script: "JoVE_real_time_intensity_to_excel.m”	Included in SI
Adobe Illustrator	Adobe
JoVE_qRPA_well.ai	Included in SI
JoVE_qRPA_base.ai	Included in SI
AxioVision software	Zeiss
JoVE_AxioVision_Script.ziscript	Included in SI