Yöntem makalesi

Lepr

9.2K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/52632

⸱

11 Mayıs 2015

 ,  , 
1School of Biomedical Sciences, The University of Queensland

Bu makalede

Özet

Burada, tip 2 diyabetin fare modelinden adacıkların izolasyonu için bir protokol, Leprdb ve 2 foton mikroskobu kullanan sağlam adacıklardan insülin sekresyonunun ölçümü için bir canlı hücre testinin ayrıntılarını sunuyoruz.

Özet

Tip 2 diyabet 2013 yılında 382 milyon kişiyi etkileyen kronik bir hastalıktır, ve, son 2 yıl boyunca. 2035 1 ile 592.000.000 açıkça 2 kurulmuştur tip 2 diyabette beta hücre disfonksiyonu rolünü artması bekleniyor. Araştırma ilerleme pankreas adacık izolasyonu için yöntemler gerektirmiştir. Adacık izolasyon protokolü yabani tip ve diyabetik Lepr db (db / db) fareler, hem izole adacıklar verim ve kalitesini artırmak için bazı değişikliklerle, hisseleri burada diğer gruplardan protokolleri ile birçok ortak adımlar sundu. Bir canlı hücre 2-foton görüntüleme yöntemi, daha sonra adacıklara olan insülin salgılanmasının kontrol araştırmak için kullanılabileceğini sunulmuştur.

Giriş

hastalıkta p-hücresi işlev bozukluğu rolü yaygın 3,4 kabul edilmiştir. Böyle MIN6 ve INS-1 gibi hücre hatları beta hücre davranış biyolojisinin anlaşılmasında yararlı araçlardır. Bununla birlikte, insülin salgılanmasının fizyolojik kontrol Langerhans adacıklarında içinde yer alır. Bu adacıklar sıkıca paketlenmiş beta hücreleri binlerce yanı sıra kan damarları ve diğer endokrin hücre tiplerini içerir. Adacık içinde bu ortam insülin salgılanmasını etkiler ve diyabette önemli olması muhtemeldir. Bu nedenle, insülin sekresyonunun fizyolojik kontrol ve hastalığın patofizyolojisi anlamak için, sağlam adacıklar çalışma gereklidir.

Adacık izolasyonu

Tip 2 diyabetli hastaların özellikle insan adacıklarında Canlı insan adacık ve elde etmek güçtür. Buna ek olarak, insan adacıklar deneysel moleküler manipülasyon için kısıtlı imkanları vardır. Araştırmacılar bu nedenle kullanılan adresHayvanlar ve tip 2 diyabet hayvan modellerinden sağlar. Böyle bir hastalık modeli, db / db faredir. Bu modeller yakından insan hastalığı 5,6 paralellikler bir fenotip ilerlemesi ile tip 2 diyabete kendiliğinden mutasyon olduğunu. diyabetik db / db farelerde adacık izolasyonu için burada sunulan protokol daha iyi verim, saflaştırma ve gelişmiş adacık hayatta kalmak için bazı iyileştirmeler ile diğer gruplarla ortak birçok adım vardır.

2 foton görüntüleme

Burada anlatılan canlı hücre 2-foton tahlil sayısını ölçmek ve 7 ve yabani tip diyabetik 8,9 adacıklar birçok hücrelerinden insülin tek içeren granüllerin özelliklerini değerlendirmek için araştırmacılar sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

NOT: Tüm mevcut deneyler (Queensland Üniversitesi, Anatomik Biosciences Etik Kurul tarafından onaylanan) University of Queensland yerel hayvan etiği prosedürlere göre yapılmıştır.

1. Adacık İzolasyonu

  1. Reaktif hazırlama
    1. Enzim karışımı
      1. Pankreas sindirimi için Liberase® ve kollajenaz tip IV'ün bir karışımının kullanılması. (Termolisin düşük) Liberase® TL DMEM, 26 ml (Dulbecco Modified Eagle Medium) ile 5 mg 1 vial seyreltilir.
      2. , 5 mM HEPES ile takviye edilmiş 0.5 mg / ml'lik bir konsantrasyonda, Hank tamponu içinde kolajenaz tip IV Hazırlama 0.5mM CaCl2, 0.1 mg / ml DNase ve 1 mg / ml sığır serumu albümini.
      3. Örneğin, (hacim olarak) 1 Tl 1 mi kolajenaz Liberase® 4 ml: 4 bir oranda Liberase® TL ve kolajenaz çözüm karıştırın. -20 ° C de, her ve mağaza 2.5mL enzimlerin karışımı kısım.
        NOT: Doku inkübasyon süreleri venzim partiler arasında biraz (30 sn 1 dk farkı) lanarak. Bu nedenle, bir parti deneyi gerekebilir.
    2. RPMI İzolasyon Medya
      1. Oda sıcaklığında 1 L su RPMI 1640 tozu bir şişe eritilir ve 2 g NaHCOs 3, 4.02 g HEPES tamamlar.
      2. Manyetik bir karıştırıcı ile karıştırın, büyük bir konik bir şişe içinde, RPMI yalıtım ortamı birleştirin NaOH ile pH 7.4'e ayarlayın, filtre ile sterilize edildi ve 4 ° C 'de muhafaza edin.
    3. RPMI Kültür Medya
    4. % 10 fetal sığır serumu ve 1% antibiyotikler (örneğin, penisilin, 100 U / ml, 100 ug streptomisin / ml) ile, RPMI kültür ortamı kullanın.
  2. Adacık İzolasyonu ve Kültürleme
    1. Hayvan Kurban
      1. Yerel kurumun etik prosedürlerine göre servikal dislokasyon veya CO 2 boğulma tarafından fareler Kurban. % 70 etanol ile iyice fare vücut püskürtün.
    2. Pankreas Perfüzyon
      1. Uyanal karın cilt ve periton yoluyla se 2 uzun kesimler V şeklinde kanadı yapmak. Tüm karın boşluğu ortaya çıkarmak için cildi yukarı kapağı çekin, bağırsak kenara koymak ve koledok ortaya çıkarmak için katlanmış bir kağıt mendil ile yerinde karaciğer tutmak (Şekil 1 ve 2). Hayvan koyun cerrah ve uzak cerrah gelen kuyruk doğru kafa böylece.
      2. Duodenum (Şekil 1) girmesini enjekte enzimleri engellemek için duodenum duvarında ampulla bir damar kelepçe uygulayın.
        NOT: enjekte enzimler pankreatik kanal içine gidin ve (kelepçe) üzerinden enjeksiyon yerinde pankreas veya reflü serpmek ya da (kelepçenin altında) duodenuma gidecek olup olmadığını o belirler gibi bu önemli bir adımdır.
      3. Ortak hepatik kanal ve sistik kanal (Şekil 1) kavşağı yakınında 31 G iğne ile koledok cannulate ve ikinci enjeksiyon için odayı terk inci eğere pankreas ilk kez serpmek için başarısız olur. Yavaş yavaş (over ~ 10 sn) fare koledok içine yaklaşık 2 ml soğuk enzim karışımı enjekte edilir.
        NOT: kelepçe doğru pozisyonda ise pankreas hızla perfüze edilecektir.
      4. İğne koledok içinde olduğunu, ancak pankreas serpmek edemez (yani. Sabitlenmiş üzerinde ise karaciğer biraz uzak kelepçe yukarı taşımak ya da kenetlenmiş altında ise karaciğere biraz aşağı hareket ettirin) kelepçe konumunu ayarlayın.
        NOT: İğne bazen çevredeki kapsül yerine kanalın lümenine gider. Yararlı bir işareti koledok enjekte kanalının genişlemesi olduğu içinde iğne olup olmadığını kontrol edin. Pankreas serpmek için başarısız olursa, alternatif enzim karışımı beklenen düşük verim ile pankreasın birden fazla enjekte edilebilir olduğunu. Pankreasın (splenik lob) sol sitenin perfüzyon adacık verimi maksimizasyonu açısından önemlidir.
      5. Pankreas p sonraerfused, hızlı bir şekilde, pankreas kaldırmak bir viyal (~ 20 mi, cam) içine koymak ve bir 37 ° C su banyosu içinde yaklaşık 19 dakika inkübe edilir.
        NOT: İnkübasyon süresi fare zorlanma ve yaşa bağlı olarak biraz değişebilir.
      6. İnkübasyon süresinden sonra, ~ soğuk yalıtım ortam 20 ml ekleyerek sindirim işlemi durdurun. Pankreas bozabilir ve steril bir 50 ml tüp içine normal bir kurutma eleği (1 mm gözenek çapı) üzerinden dökün iyice çalkalayınız. Fren kapalı olan 4 ° C'de 1 dakika boyunca 400 xg'de izolasyon medya ve santrifüj tüpü kontör.
      7. Yine izolasyon ortamı pelet çözülür ve daha sonra fren kapalı olarak 4 ° C 'de 1 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj, iki adet 15 ml'lik tüplere aktarın. Aspirasyon süpernatant sonra, vorteks veya yukarı ve aşağı pipetleme tüp başına yoğunluk gradyan hücre ayırma ortamı 6 ml (Histopaque 1077 çözelti) ile iyice iki pelet karıştırın. Daha sonra hafifçe üstüne tüpün yanına yalıtım ortam ~ 6 ml ilaveFren kapalı olarak 4 ° C 'de 15 dakika boyunca 100 x g'de yoğunluk gradyanlı ayrıştırma ortamı ve santrifüjlenir.
      8. Üst (izolasyon ortamı) içinde süpernatant 3 ayrı yemekler, orta ve alt (yoğunluk gradyan hücre ayırma ortamı) katmanı toplayın. Bir mikroskop altında bir pipet kullanarak, bu 3 yemekler adacıklar seçmenize.
        NOT: orta tabaka adacıklarının çoğunu içerir. Adacıklar boyutu ~ 50 mikron 500 kompakt yapıları (Şekil 3) olarak kabul edilmektedir. Biz WT farelerinde ~ 200 adacıklar ve db / db farelerinde 300- <100 adacıklar elde.
    3. Adacık Kültürleme
      1. Adacıklar, 37 ° C'de,% 5 ile enzim sindiriminden 6ml RPMI kültür ortamı (10 mM glukoz) ile 25 cm'lik bir petri tabağına 40 adacıklar kültürü grupları kurtarmak için /% 95 canlı önce 2 gün CO2 / O 2 cell 2-foton görüntüleme. Günlük kültür ortamı değiştirin.

2. Canlı Hücre 2-Foton Görüntüleme

  1. Reaktif Hazırlama
    1. Ekstraselüler Tampon
      1. 140 mM NaCI, 5 mM KCI, 2.5 mM CaCI2, 1 mM MgCI2, 5 mM NaHCO 3 ve 10 mM HEPES ile 2-foton deneyi için, sodyum açısından zengin hücre-dışı tamponu hazırlayın.
    2. Ekstraselüler Boya
      1. 2-foton deneyi için -20 ° C'de hücre dışı tamponu, kısım küçük tüplere ve deposunda hazır SRB 8 mM hazırlar. 0.8 mM bir çalışma konsantrasyonunu elde etmek için taze dışı tamponu stok SRB 01:10 sulandırınız.
  2. foton Görüntüleme
    1. İlk olarak, 30 dakika boyunca 3 mM glikoz hücre dışı tamponu içinde 2 günlük bir kültür adacıklar önceden inkübe edin.
      NOT: Biz kültüründe 2 ile 5 gün arasında adacıklar kullanın.
    2. Sonra, mikroskop sahnede monte termo-kontrol odasının üzerine cam slayt yerleştirin. Çözümün sızmasını önlemek için gres kullanın.
    3. Extracell 500 ul odasına KapakFarklı glukoz konsantrasyonları (3 mM, 6 mM, 15 mM ve 20 mM glukoz) ile 0.8 mM SRB ihtiva nitlerin tamponu.
    4. Sonra, odanın ortasına ön İnkübe adacık yerleştirmek ve kemirgen adacıklar halinde, insülin immün çoğu hücreleri beta hücreleri olduğunu göstermektedir nerede, adacık haline 3-4 hücre katmanları odaklanın.
      NOT: SRB hızla adacık tüm hücre zarı açıklayacağım ve adacık görüntüye hazırdır.
    5. (Örn., Scanimage 11). Bir 60X immersiyon yağı hedefi (NA 1.42) ve görüntüleme yazılımı ile 2-foton mikroskop kullanın 4 tipik bir mikroskopi düzenlemesini göstermektedir Şekil. Floresan ile bir zar 880 nm'de femtosaniye lazer darbeleri ile heyecanlı geçirgenliği olmayan floresan dışı işaretleyici olarak SRB kullanarak görüntü ekzositik olaylar, 550-650 nm'de. Stimülasyon adacık yanıtları kaydedin.
    6. Küçük bir floresan nokta aniden görünüşü tek ekzositik olayları tespit (çözünürlük 10 piksel /1 m) ve ilgi bir bölge (~ 0.78 mikron 2) üzerinde floresan sinyal hızlı yükselen faz onaylayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Adacık verimi ve arıtma

Normal bir vahşi tip fare, yaklaşık 200 adacık beklenmektedir. Sağlıklı adacıklar yuvarlak, parlak bir görünüm ve pürüzsüz bir sınır var. Bir altında sindirilmiş toplu az adacıklar ve asiner hücre ekli adacıklar (Şekil 3) sahipken aşırı sindirilmiş izolasyon toplu genellikle küçük ve bulanık adacıklar vardır. Daha iyi glisemik fareler 100'ün altında (saydam bir görünüme sahip daha küçük adacıklar var kötü glisemik farelere kıyasla (300 adacık kada...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

adacık izolasyonu en kritik faktör pankreasın ilk perfüzyon ise; Bir altında oldukça düşük adacık verim pankreas sonuçları perfüze. Diğer faktörler de bu sindirim zaman ve kısmen perfüzyon seviyesinin telafi olabilir çalkalama düzeyi gibi izolasyon kalitesini etkiler. Örneğin, tam olarak perfüze pankreas hafifçe çalkalama sırasında bir küçük pankreas daha çalkalanarak ~ 20 dakika sindirim gerektirebilir sindirilmiş aksine, 18 dakika, 30 saniye ~ 37 ° C'de inkübe edilmesi gerekecektir. Bizim ellerde iki sindirim enzi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, rekabet eden hiçbir mali çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu çalışma, Avustralya Araştırma Konseyi Hibe DP110100642 (PT'ye) ve Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi Hibeleri APP1002520 ve APP1059426 (PT ve HYG'ye) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Liferaz TL 5 mgRoche-5401020001
Kollajenaz tip IV-1gGibco-Life Technologies17104-019
Histopaque 1077 500 mlSigma Aldrich10771
RPMI 1640 Orta (10x) 1LSigma AldrichR1383izolasyon ortamı hazırlamak için
RPMI 1640 (1x) 500 mlGibco-Life Technologies21870-076Kültürlü besiyeri hazırlamak için
Penisilin-Streptomisin 100 mlGibco-Life Technologies15140-122kültürlü besiyeri hazırlamak için 
Fetal sığır serumu 500 mlGibco-Life Technologies10099-141kültürlenmiş ortam hazırlamak için
DMEM (Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı)Gibco-Life Technologies11966-025liberaz
Metamorf programınıMolecular Devices, ABD2-foton görüntülerini analiz etmek için
seyreltmek için

Kaynaklar

  1. Guariguata, L., et al. Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035. Diabetes Research and Clinical Practice. 103, 137-149 (2014).
  2. Ashcroft, F. M., Rorsman, P. Diabetes mellitus and the beta cell: The last ten years. Cell. 148, 1160-1171 (2012).
  3. Weir, G. C., Bonner-Weir, S. Five stages of evolving beta-cell dysfunction during progression to diabetes. Diabetes. 53, S16-S21 (2004).
  4. Kjorholt, C., Akerfeldt, M. C., Biden, T. J., Laybutt, D. R. Chronic hyperglycemia, independent of plasma lipid levels, is sufficient for the loss of beta-cell differentiation and secretory function in the db/db mouse model of diabetes. Diabetes. 54, 2755-2763 (2005).
  5. Wang, Y. W., et al. Spontaneous type 2 diabetic rodent models. Journal of Diabetes Research. , (2013).
  6. Hummel, K. P., Dickie, M. M., Coleman, D. L. Diabetes a new mutation in mouse. Science. 153, 1127-1128 (1966).
  7. Do, O. H., Low, J. T., Gaisano, H. Y., Thorn, P. The secretory deficit in islets from db/db mice is mainly due to a loss of responding beta cells. Diabetologia. 57, 1400-1409 (2014).
  8. Low, J. T., et al. Glucose principally regulates insulin secretion in mouse islets by controlling the numbers of granule fusion events per cell. Diabetologia. 56, 2629-2637 (2013).
  9. Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet. Science. 297, 1349-1352 (2002).
  10. Low, J. T., et al. Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature. Diabetologia. 57, 1655-1663 (2014).
  11. Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomedical Engineering Online. 2, 13(2003).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Lepr db Fare ModeliEnzim Kar m Haz rlamaYo unluk Gradyan Santrif jasyonuki Foton Mikroskobuns lin Salg lama AnaliziSRB Boya EtiketlemesiGlikoz Stim lasyon Yan t

İlgili makaleler