Basit Poliakrilamid-tabanlı Sertlik bağımlı Hücre Yanıtların Çalışmaları multiwell Sertlik Deneyi

Summary

Burada, poliakrilamid jellerin çok kuyulu plaka formatında hızlı, verimli ve ucuz bir şekilde hazırlanmasını sağlayan bir yöntem açıklanmaktadır. Yöntem herhangi bir özel ekipman gerektirmez ve herhangi bir araştırma laboratuvarı tarafından kolayca benimsenebilir. Sertliğe bağlı hücre tepkilerini anlamaya odaklanan araştırmalarda özellikle yararlı olacaktır.

Abstract

Şu anda, in vitro hücre araştırmalarının çoğu sert doku kültürü polistiren (~ 1 GPa) üzerinde gerçekleştirilirken, vücuttaki çoğu hücre elastik ve çok daha yumuşak (0.1 – 100 kPa) bir matrise bağlıdır. Bu tür sertlik uyumsuzluğu hücre tepkilerini büyük ölçüde etkilediğinden, hücre substratları olarak hizmet etmek için geniş bir sertlik aralığını kapsayan hidrojel malzemelerin geliştirilmesine büyük bir ilgi vardır. Ucuz olan ve vücuttaki tüm yumuşak dokuların sertlik aralığını kaplayan poliakrilamid jeller, birçok araştırma grubu için tercih edilen hidrojeldir. Bununla birlikte, poliakrilamid jel hazırlığı uzun, sıkıcıdır ve yalnızca küçük partiler için uygundur. Burada, jeller için yapısal bir destek olarak kalıcı esnek bir plastik film kullanarak, poliakrilamid jellerin çok kuyulu bir plaka formatında hazırlanmasını sağlayan bir testi açıklıyoruz. Teknik, mevcut yöntemlerden daha hızlı, daha verimli ve daha az maliyetlidir ve başka türlü mevcut olmayan özel boyutlarda jellerin hazırlanmasına izin verir. Herhangi bir özel ekipman gerektirmediğinden, yöntem herhangi bir araştırma laboratuvarı tarafından kolayca benimsenebilir ve sertliğe bağlı hücre tepkilerini anlamaya odaklanan araştırmalarda özellikle yararlı olacaktır.

Introduction

Vücutta en dokular ~ 1 GPa arasında bir elastisite modülüne sahiptir 0.1 kPa ila yumuşak kıkırdağın 100 kPa beyin, ancak, in vitro hücre araştırmalarında en doku kültür polistiren (TCP) üzerinde gerçekleştirilmiştir arasında değişen bir Young modülüne sahip yumuşak viskoelastik malzemelerdir . ¹ Bu sertlik uyumsuzluğu ölçüde hücreler çevrelerine cevap şeklini etkiler. Araştırma artan vücut, ^2,3 kök hücreler de dahil olmak üzere. Bunun sonucunda ⁴ farklı hücre tiplerinin kaderi üzerinde tabaka sertlik etkisi açıklık böylece adanmış, birden hidrojeller sertlik-bağımlı hücre anlaşılmasına yardım için geliştirilmiştir Yüzey sertliği hücre kaderi üzerinde önemli bir etkiye sahip olduğunu kanıtlar büyürken poliakrilamidin (PA), ^5-7 polietilen glikol (PEG), ^8,9 polidimetilsiloksan (PDMS), ¹⁰ ve aljinat içeren biyoloji. ^11, en ​​çalışmalar yürütülmektedir s az sayıda küçük ölçekliörnekleri şunlardır:. Hücre tipleri veya çevresel koşullar nadir bir dizi için substrat sertlik etkisi sistematik, çok boyutlu çalışmalar. ¹²

Çok ümit vaat eden yüksek verimli hidrojel teknolojisi PEG-bazlı microarrays, sertlik microrods çapı ve yüksekliği ile modüle edilen agaroz hidrojel mikro, ¹⁴ ya da mikro ve nano çubuklar üretim için ¹³ mikroakışkan cihazlar da dahil olmak üzere, geliştirilmiştir. ¹⁵ Ancak , teknolojileri, yüzeyler sofistike ve laboratuvarların sınırlı sayıda mevcuttur hazırlamak. Sertliği modüle hücre yanıtları kapsayan pek çok araştırma uygulanması, aynı zamanda Young'ın modülü, yani 0.3 fizyolojik olarak uygun bir aralığı gösteren sadece ucuz ve basit değildir, poliakrilamid (PA) jelleri kullanan -. 300 kPa ^16-22 Ancak, PA imalatı için yöntem Mevcut Hücre kültürü için jeller, emek yoğun ve dolayısıyla hazırlık vardırKüçük gruplar halinde ared. Hücre alt-tabakalar olarak PA jellerin hazırlanması ile ilgili zorluklardan bazıları jeller hazırlanacak olması şartı kaynaklanmaktadır: 1) oksijen yokluğunda tam polimerizasyona olanak sağlamak için, 2), düz ve pürüzsüz bir yüzeye sahip tek tip hücre olanak sağlamak üzere eki ve yayma, ve 3) kalıcı yüzen önlemek için hücre kültürü çanak altına yapıştırılmıştır.

Çeşitli gruplar, büyük gruplar halinde hücre kültürü için PA jeller üretmek için çalıştılar. Semler ve diğ., Bir delikli zımba ile daha sonra "kesme" ve 96 oyuklu plakalara yerleştirildi PA jeller hazırlanmış kalın levhalar. ²³ Bununla birlikte, bu yöntem, katı jeller, örneğin,> 1 kPa bir Young modülü de, yumuşak, çünkü sınırlıdır jeller, kesmek zor, ve kolayca zarar "yapışkan" bulunmaktadır. MIH ve diğ., Jeller, doğrudan bir cam alt oyuklu bir plaka içinde polimerize edilmesini sağlar, daha gelişmiş bir teknik geliştirdi. 6 Bu fonksiyonlaşmış cam alt tabak içine jel çözümleri dökme ve özel coverglass dizi ile "sandviç" tarafından jeller oluşturarak elde edildi. ⁶ olsa çok umut verici, hafif kenar etkileri hala bu teknikle gözlendi. Ayrıca, teknik, birçok laboratuvarlar yanı sıra pahalı cam alt çukurlu plakalara hemen erişilebilir bir özel tasarlanmış bir dizi gerektirir.

Bu kağıt kolayca herhangi bir laboratuar tarafından kabul edilebilir bir multiwell plaka PA jeller araya için basit ve ucuz bir şekilde anlatılmaktadır. Itici PA jeller olan bir hidrofobik on, ve kovalent birikmesi üzerine PA jel bağlayan hidrofil bir on, - Burada, esnek bir plastik destek iki tarafı sahip olan kullanılır. PA jel yaprak esnek plastik bir desteğe tespit sürekli yatırılır ve sonra, herhangi bir kalınlığı ya da sertlik jeller kullanım ve arzu edilen herhangi bir şekil olarak kesilmesi mümkün kılar. Bu yakloach bir PA bağlayıcı çözelti ile, cam lamelleri ya da pahalı cam alt çukurlu plakaların kuyu ya aksi takdirde piyasada mevcut değil boyutlarda özel plastik 'lamelleri' üreten, aynı zamanda cam yüzeyler-tedavi öncesi gerekliliğini ortadan kaldırır sadece sıkıcı ve zaman alıcı bir adım. Son olarak, tek tip PA jeli yaprak büyük partiler halinde hazırlandı ve birkaç ay süreyle de hidratlanmamış saklanabilir.

Özetle, burada sunulan tahlil çeşitli yönleriyle mevcut yöntemlere göre bir gelişmedir. İlk olarak, çok oyuklu bir plaka montaj işlemi verimli ve gerekli malzemelerin toplam maliyeti düşüktür. İkinci olarak, hidrojeller tek bir homojen jel, film içinde büyük partiler halinde üretilmektedir. Son olarak, ticari olarak temin edilebilir, yalnızca malzeme gerekmektedir. Analizin yarar hücre morfolojisi üzerinde alt-tabaka sertliğinin etkisinin incelenmesi ve alan yayılması ile görüntülenmiştir.

Protocol

Hidrojel-ilişkili Çözümleri ve Alikot 1. Hazırlık

1. Poliakrilamid jel ön-madde çözeltisinin hazırlanması.
   1. Akrilamid, (A) karıştırılarak poliakrilamid jel ön-madde solüsyonu hazırlayın (w / v% 40, E _r 71,08 g / Mol) ve çapraz bağlayıcı bisakrilamid (B), (a / h% 2, E 154,17 g / mol _r), ve tespit edilen Tablo 1 'de belirtilen hacim yüzdeleri ile iyonize su.
      NOT: Bu çözümler büyük partiler halinde hazırlanır ve birkaç aya kadar 4 ° C 'de muhafaza edilebilir.
      1. DİKKAT: Akrilamid inhalasyon veya sindirim üzerine toksik olan, özellikle toz biçiminde olduğunda: bu durumda, tercihan, toksisite riskleri azaltmak / v solüsyonu ağırlık% 40 kullanılır. Eldiven, gözlük, ve bir laboratuvar önlüğü gibi, koruyucu giysiler giyerek sadece süre taşıyınız. Buzdolabında bir ışık dayanıklı, sıkıca kapalı bir kapta saklayın (<23 ° C, bölgeyi iyi havalandırılmış).
      2. DİKKAT: Bis-akrilamid, özellikle, inhalasyon ya da sindirim üzerine toksikzaman toz biçiminde: bu durumda, tercihan, toksisite riskleri azaltmak / v solüsyonu% 2 w kullanılır. Eldiven, gözlük, ve bir laboratuvar önlüğü gibi, koruyucu giysiler giyerek sadece süre taşıyınız. Buzdolabı (<4 ° C, iyi havalandırılmış alan) bir ışık dayanıklı, sıkıca kapalı bir kapta saklayın.
2. Hazırlama ve N -Sulfosuccinimidyl-6- (4'-azido-2'-nitrofenilamino) heksanoat kullanım bölümü (Sülfo-SANPAH, E 492,40 g / mol _r). DİKKAT: Sulfo-SANPAH Ciddi göz tahrişine neden olur; eldiven ve uygun göz ve yüz koruması ile anlaştım. Mağaza aldıktan sonra -20 ° C'de ve önceki şişelemeden.
   1. Sülfo-SANPAH saklamak için: 50 mg / ml dimethylsulfoxane (DMSO) içinde Sülfo-SANPAH çözülür. Tüp başına 20 ul 50 mikro santrifüj tüplerine stok çözeltisi alikosu. Kuru buz veya sıvı azot içinde hızlı dondurma -80 ° C'de ve mağaza (maksimum çapraz bağlayıcı verimliliği korumak için bir seçime bağlı, fakat tercih edilen bir aşaması).
      NOT: tümbölenler can birkaç ay boyunca saklanabilir.
   2. Sülfo-SANPAH kullanmak için: kısım kısaca çözülme ve deiyonize su içinde 480 ul seyreltin. Hemen kullanın. Sulfo-SANPAH suda hızlı hidrolize: bu nedenle hızlı bir şekilde yukarıdaki tüm adımları gerçekleştirmek için dikkat çekmek.
3. Amonyum persülfat (M _r 228,18 g / Mol) alikotları hazırlanması.
   NOT: Amonyum persülfat göz, cilt ve solunum tahriş olmasına neden olur. Işlerken uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın. Bir kimyasal davlumbaz amonyum persülfat tozu Kolu. Kuru, iyi havalandırılan bir yerde saklayın tozu. Aliquoted sonra, seyreltik çözelti çalışma tezgahı üzerinde kullanılabilir.
   1. Ağ / hac% 10'luk bir nihai amonyum persülfat konsantrasyonu elde etmek için deiyonize su içinde amonyum persülfat çözülür. -20 ° C'de kısım ve mağaza. Kullanımdan hemen önce çözülme.
4. Kolajen Tip I çözeltisinin hazırlanması.
   1. Böylece stok seyreltilmesi ile 0.2 mg / ml kollajen çözüm hazırlayınpH 7.4 1 x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde dökülmesinden. Buz kısaca Mağaza veya seyreltme üzerine hemen kullanın.

2. Hidrojel Hazırlık (Şekil 1'e bakın)

1. Hidrofobik cam slaytların hazırlanması.
   1. Bir cam plaka üzerine bir hidrofobik çözeltisinin bir kaç damla yerleştirin ve yüzey boyunca yaymak için kağıt mendil kullanmayın. Hava kurumasını bekleyin ve hidrofobik kaplama bile dışarı tekrar kağıt mendil ile silin.
      NOT: oda sıcaklığında bir yanıcı kabine saklayın hidrofobik bir çözüm. Kullanırken kişisel koruyucu ekipman kullanın. Iyi havalandırılan bir alanda çalışın.
2. Esnek plastik destek hazırlanması.
   1. Hidrofobik kaplı cam plakanın boyutuna uyacak şekilde esnek plastik desteği kesti.
   2. Hafifçe böyle bir neşter gibi keskin bir aletle yüzeyi çizilmeye esnek plastik destek hidrofobik yan işaretleyin.
      NOT: jel kez - tamamen şeffaf - kurur, Çizikleri esnek plastik destek tarafı jel içeren ayırt yardımcı olacaktır.
      Not: esnek plastik destek, bir hidrofobik ve hidrofilik bir tarafa sahiptir. Bir kez yatırılır, poliakrilamid kalıcı kolay sonraki hidrojel kullanımını kolaylaştırır plastik desteğin hidrofilik tarafına yapışır.
3. Jel Hazırlanması (örneğin, miktarlar 5 ml jel prekürsör çözeltilerinde için verilmiştir).
   Not: jel başlangıç ​​kalınlığı, 0.5 mm olduğunda 5 mi ~ 40 jeller üretmek için yeterli olacaktır. Jel kalınlığı azalır, daha fazla jeller elde edilebilir.
   1. 50 ml'lik konik bir tüp içinde arzu edilen nihai konsantrasyonu (Tablo 1) poliakrilamid ön-madde çözeltisi 4972,5 ul koyun. Açılan bir kapakla 30 dakika boyunca bir gaz tahliye açıklığının yerleştirin.
      NOT: Oksijen serbest radikal tuzak gibi davranır ve mevcut, polimerizasyonu inhibe eder.
   2. Amonyum persülfat ağ / hac% 10, 25 ul ekle nihai elde etmek için (1.3 noktasına bakınız)% 0.05 amonyum persülfat konsantrasyonu.
   3. N, N, N ', N'-tetrametiletilendiamin 2.5 ul ekle% 0.5 bir son TEMED konsantrasyon elde etmek için gazı giderilmiş jel çözeltisine (TEMED, E 116,24 g / mol _r).
      NOT: Mağaza TEMED oda sıcaklığında bir yanıcı kabine içinde. Uygun kişisel koruyucu ekipman giyen zaman kimyasal davlumbaz taşıyınız. Bu yüksek ölçüde hava ve neme duyarlı olduğu gibi sıkı bir atıl gaz altında kapalı tutun.
   4. 5 kez - aşağı yukarı 3 pipetleme ve hafifçe karıştırın çözüm. Jel habercisi çözüm içine oksijen difüzyon önlemek için vorteks etmeyin.
   5. Hidrofobik kaplamalı cam slayt ile esnek plastik destek ve sandviç hidrofilik yüzüne jel çözümü Pipet. Istenilen kalınlıkta (örneğin, 0.5 mm), silikon ayırıcılar ile iki slayt ayırın. Jelleşme bir göstergesi olarak kullanmak için 50 ml konik bir tüp içinde bir polimer ön-madde ile az bir miktar (~ 100 ul) bırakın.
      NOT:Herhangi bir boşluk kullanılabilir. 120 um - Örneğin, Parafilm tek bir şerit, bir son 100 şişmiş jel kalınlığı sağlar.
   6. Polimerizasyon üzerine düz bir hidrojel yüzeye tespit esnek plastik destek / jel sandviç üstüne başka bir cam plaka yerleştirin.
   7. Arzu edildiği takdirde daha az zaman daha yüksek bir ağırlık% 'si arasında jeller için kullanılabilir olmasına rağmen, jel, 45 dakika boyunca polimerize olsun. Jel polimerize olduğunu tespit etmek için, 50 ml konik tüp içinde kalan çözümü gözlemlemek; Geri kalan çözelti, jel ise, o zaman cam plaka üzerine jelasyon de başlatılmıştır olasıdır. Bununla birlikte, kalıp erken açılması tam bir polimerizasyonu engellemek unutmayın.
   8. Jel oluşturulduktan sonra, üstte kovalent bağlı bir poliakrilamid jeli ile esnek plastik destek soyulabilir ve kuru hava jel tarafı yukarıya ayarlanır.
      Not: konveksiyon veya sıcak kurutma bu basamağını hızlandırmak için kullanılabilir. Esnek plastik destek üzerine kurutulmuş sonra, jel deposu olabilirsüresiz d.
      1. Poliakrilamid jeller kabarcıkları nedeniyle formu vermedi esnek plastik desteği, herhangi bir çıplak noktalar işaretleyin. Jel kuruduktan sonra bu esnek plastik desteği ile uyum gibi işaretle jel hala sulu ise.

3. multiwell plaka Meclisi, Kollajen Kaplama ve Sterilizasyon

1. Multiwell plakası montaj.
   1. Bir kez kurutulduktan sonra, arzu edilen şekillerde PA jeller kesti.
      1. 96 oyuklu bir plaka için, ~ 6 mm bir çapı olan bir ağır-iş delik kullanımı. Kare veya dikdörtgen şekiller halinde jeller kesmek için bir ağır kağıt kesici kullanın. Seçenek olarak ise, makas kullanın.
   2. Üreticinin talimatlarına uygun olarak 96-çukurlu plaka başına PDMS yaklaşık 500 ul hazırlayın. Çok oyuklu bir plaka tabanına jeller tutkal için, her bir göze merkezinde küçük damlacık polidimetilsiloksan (PDMS), (± 5 ul) yerleştirin. Forseps kullanarak, bir poliakrilamid yerleştirinaşağı her iyi, esnek plastik destek tarafında e jel. PDMS, tedavi, 4 saat, en az 37 ° C 'de Prefabrik levha bırakmak için izin verilmesi.
2. Poliakrilamid jellerin Kollajen kaplama.
   1. Bir transfer pipet, küçük bir miktar koyun - sülfo-SANPAH (7 8 ul) jel yüzeyi eşit şekilde kaplamak için yanlara iyi ve girdap her (1.2.2 noktasına bakınız). Sülfo-SANPAH suda stabil olmadığından derhal çalışın.
   2. 5 dakika boyunca - (365 nm, yoğunluk = 37 mW λ = 302), yüksek yoğunluklu UV lambası altında plaka yerleştirin. Aşırı sülfo-SANPAH kaldırmak için PBS ile jeller durulayın.
   3. 50 ul 0.2 mg Pipet / ml kolajen Tip I çözelti, her oyuğa (1.4 noktasına bakınız). 4 ° C'de en az 2 saat ya da O / N, oda sıcaklığında kapalı plaka bırakın.
      NOT: kolajen kaplama sürecini hızlandırmak için, bir transfer pipet kollajen çözümü eklemek için kullanılabilir. Genellikle, 1 - çözümün 2 damlacıkları tamamlamak için yeterli olmalıdırly jel yüzeyini kaplayan.
   4. Kollajen bağlanmasını sağlamak üzere, en az 2 saat boyunca oda sıcaklığında plaka bırakın.
   5. 2 saat boyunca bir doku kültür başlığı içinde fazla kolajen çözeltisi çıkarın ve UV (λ = 200 nm) altında sterilize etmek için PBS ile durulayın.
   6. Nemlendirmek ve dengelenmeye O / N (orta bileşim için bölüm 4.1 bakınız) tam orta jeller bekletin. Hücre kadar 2 gün boyunca buzdolabında hemen veya mağaza ekim için kullanın.

Pensilvanya Sertlik Testi 4. Hücre Tohumculuk

Not: ortak memeli hücre çizgileri için tipik olmakla birlikte, bu bölümde tarif protokolü özellikle meme kanseri MDA-MB-231 hücre çizgisi ile birlikte kullanılır (bakınız Şekil 4 ve 5).

1. 37 ° C'de 5 dakika boyunca,% 5 tripsin / EDTA maruz bırakılarak doku kültür şişesi ile ilgili hücreler toplanır. Kültür şişesi alanının her cm ² başına tripsin / EDTA ~ 80 ul kullanın; Örneğin fo tripsin / EDTA 2 ml kullanmakra T25 hücre kültürü şişesi. Yeniden askıya arzu edilen bir nihai hücre konsantrasyonunda% 10 cenin sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin ile desteklenmiş tam ortam içinde toplanan hücreler. Hesap zamanı iki katına hücrenin yanı sıra hücreler tahlil numaralı seribaşı olacak zamanın uzunluğu dikkate alındığında, uygun bir alt birleşik hücre konsantrasyonunu seçin. Eklenen ortam tamamen hidrojeller batığın için yeterli olduğundan emin olun.
   Not: hidrojeller ortam içinde önceden-dengelenmiş olan bu yana yeterli olmalıdır 100 ul hacim (3.2.6 aşama bakınız). Jeller, önceki adımda ortam içinde önceden-dengelenmiş olan bu yana çukurlu bir levha için kullanılan tipik ortam hacimleri için yeterli olmalıdır.
   NOT: deney herhangi bir bağlantı bağımlı bir hücre tipi için uygun olacaktır.
   1. Bir hemasitometre kullanarak bir ters mikroskop altında hücre sayısı. Yük 10 her hemasitometre portuna hücre süspansiyonu ul ve en az 8 kadran hücre sayısını ortalama. Almak içinNihai hücre konsantrasyonu, 10 ⁴ hücre sayısını çarpın.
      NOT: Her hemasitometre kadranda hücre sayısı 20 olduğunda iyi hücre sayımı sonuçları elde edilir - 50.
2. Kültür, 37 ° C'de, nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde PA sertlik deneyi üzerine hücre ve% 5 _CO2. 3 gün - her 2 ortamı değiştirmek. 5 dakika boyunca 37 ° C'de% 5 tripsin / EDTA maruz bırakılarak gerektiğinde hücreler toplanır. Doku kültür şişesi ^cm2 tripsin / EDTA ~ 80 ul kullanın. Biraz yanlara çukurlu plaka devrilme ve hidrojel dokunmadan aksine, her bir yan duvarına üzerine pipet dokunarak aspire veya pipet orta: Tüm hücre manipülasyon adımları sırasında, özel hidrojel yüzeyi bozmayacak özen gösterin.
   NOT: standart doku kültürü taşıma sırasında hidrojel yüzeye zarar vermemeye özel özen dışında, hücreler üzerinde seribaşı sanki sertlik deneyi aynı şekilde manipüle edilebilir üzerine numaralı seribaşınormal bir çok-yuvalı plaka.

Pensilvanya Sertlik Testi üzerine Tohumlu Hücre 5. Görüntüleme

1. Doğrudan PA sertlik deneyi Görüntü hücreleri.
   NOT: Herhangi bir mikroskop - ters, floresan veya konfokal, hücre görüntüleme için kullanılabilir.
   Not: sertlik deneyi oluşturmak için kullanılan esnek bir plastik destek tamamen saydam olan ve autofluoresce veya hücre görüntüleme ile karışmaz. Bununla birlikte, esnek plastik desteğin kendisi şeffaf olsa bile, görüntüleme yetenekleri amacı çalışma mesafesi ile sınırlı olacaktır. Esnek plastik destek keskin yüksek büyütme için azalan, 0.23 mm kalınlığında ve 10X objektif bir tipik çalışma mesafesi ~ 4 mm vardır.
   1. Canlı hücre görüntüleme için, mikroskop plaka tutucu ve görüntüde pozisyon PA sertlik deneyi. 2 saat altında görüntüleme oturumları tutun, ya da daha uzun görüntüleme kez bir çevre odasına sahip bir mikroskop kullanmak.
   2. Ne zaman canlı hücre imyaşlanma amaç değil,% 0.1 deterjan ile takviye% 4 formaldehit çözeltisi içinde hücreler düzeltmek. 2 saat içinde en az oda sıcaklığında sabitleyici hücreleri bekletin. PBS ile iki kez durulayın. Belirlenmiş bir çöp bidonuna sabitleyici atık atın.
      Not: Hücreler hemen görüntülenebilir ya da 2 hafta süre ile, 4 ° C'de PBS içinde batık saklanan. DİKKAT: Formaldehit Teneffüs ve temas halinde toksiktir. Bir kimyasal davlumbaz eldiven kullanınız.
      NOT: Belirli fiksatifler bazı hücre proteinlerini zarar nedeniyle Hücre tespit protokolü, daha sonra hücre boyama ve işleme protokolleri dayalı seçilmelidir.
   3. Floresan görüntüleme için, leke multiwell plaka doğrudan istenen hücre boyası ile hücrelerin sabit. Görüntü hemen.

Results

Poliakrilamid (PA) hidrojelleri yaygın sertlik bağımlı hücre tepkileri test etmek için kullanılır. ^17,24 akrilamid, (A) ve bis-akrilamid (B) bir çok yumuşak dokuların sertlik aralığı içinde yayılan PA jeller yapabilir çeşitli konsantrasyonlarda karıştırarak gövde - 0.3 -.. Burada 300 kPa Young modülü ¹ Bununla birlikte, bunlar, poliakrilamid jellerin hazırlanması sıkıcı ve zaman genellikle, örneğin, ilaç tarama gibi "yüksek verim" uygulamalarda faydalarını kısıtlayıcı, alıcı ^12, basit ve...

Discussion

Başlangıçta elektroforez için geliştirilen Poliakrilamid jeller, ²⁸ şimdi rutin hücre morfolojisi, hareketliliği ve diğer hücre özellikleri arasındaki iletişimi ^3,24,29 tarihinde substrat sertlik etkilerini incelemek için hücre kültürü substrat olarak kullanılır. (Şekil 2, Tablo 1 'de referans ^17,25,26 bakınız) polimer ön-madde konsantrasyonu basit bir değişiklikle - (300 kPa 0.3) ¹ Poliakrilamid alt-tabaka sertliğinin manipülasyon vücuttaki tüm yumuşak do...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
40% Akrilamid	Bio-Rad	161-0140
%2 Bis-akrilamid	Bio-Rad	161-0142
Amonyum Persülfat	Bio-Rad	161-07000
TEMED	Sigma Aldrich	T9281
Sülfo-SANPAH	Termo Bilimsel	22589
Kollajen Tip 1, Sıçan kuyruğundan, 3.68 mg / ml	BD Biosciences	354236
Dimetil sülfoksit (DMSO)	Fisher Scientific	BP231-100
Hidrofobik çözelti — Repel Silane	GE Sağlık Biyo-Bilimleri	17-1332-01
PBS (1x), pH 7.4	HyClone	SH30256.01
Polidimehidroksioksan (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kiti]	Elsworth Yapıştırıcılar	3097358-1004
Tyrpsin/EDTA (10x)	Sigma Aldrich	44174
RPMI-1640 Orta (1x)	HyClone	SH30027-02
Fetal Sığır Serumu	HyClone	SH30073-03
Penisilin Streptomisin	MP Biyomedikal	1670046
Deterjan: Triton-X	Sigma Aldrich	T8787
Formaldehit% 37 Çözelti	Sigma Aldrich	F1635
Sığır Serumu Albümini (BSA)	Sigma Aldrich	A2153
BSA bazlı hücre yapışma engelleme kiti — ECM Hücre Yapışma Dizisi Kiti	Chemicon International	ECM540
Tek kullanımlık laboratuvar ekipmanları
>esnek plastik destek — Poliakrilamid Jeller için GelBond PAG Film	GE Healthcare Bio-Sciences	309819
Cam Plakalar	Slumpys	GBS4100SFSL
50 ml konik tüpler	Fisher Scientific	3181345107
15 ml konik tüpler	FALCON	352097
Mikro santrifüj tüpleri	Fisher Scientific	2 ml: 02681258
96 oyuklu plaka (düz tabanlı)	Fisher Scientific	12565501
Tek Kullanımlık Pipetler (1  ml, 2  ml, 5  ml, 10  ml, 25  ml, 50  ml)	Fisher Scientific	1 ml: 13-678-11B, 2  ml: 05214038, 5  ml (FALCON): 357529, 10  ml: 13-678-11E, 25  ML: 13-678-11, 50  ml: 13-678-11F
Cam Transfer Pipetleri	Fisher Scientific	5 3/4": 1367820A, 9":136786B
Pipet Uçları (1-200  μ l, 101-1000  μ l)	Fisher Scientific	2707509
Plastik Standart Tek Kullanımlık Transfer Pipetleri	Fisher Scientific	13-711-9D
Parafilm	PARAFILM >	PM992
Pudrasız Muayene Eldivenleri	Quest	92897
Silikon ara parçalar — Silikon levha, 0,5 mm kalınlık/13 cm x 18 cm	Grace Bio-Labs	JTR-S-0.5
Büyük/tek kullanımlık olmayan laboratuvar ekipmanları
Işık ve Floresan Mikroskop (Axiovert 200M)	Zeiss	3820005619
Mikroskop Yazılımı	Zeiss	AxioVision Rel. 4.8.2
UV fırın	UVITRON	UV1080
Vakum odası/gaz giderici	BelArt	999320237
Gaz giderici için vakum pompası	KNF Lab	5097482
Doku Kültürü Davlumbazı	NUAIRE	NU-425-600
Kimyasal Çeker Ocak	KEWAUNEE	99151
Ters Mikroskop (Axiovert 25)	Zeiss	663526
İnkübatörü	NUAIRE	NU-8500
Pipet Yardımı	Drummond Scientific Co.	P-76864
Hemasitometre	Parlak Çizgi	383684