Basit Poliakrilamid-tabanlı Sertlik bağımlı Hücre Yanıtların Çalışmaları multiwell Sertlik Deneyi

Summary

Burada, poliakrilamid jellerin çok kuyulu plaka formatında hızlı, verimli ve ucuz bir şekilde hazırlanmasını sağlayan bir yöntem açıklanmaktadır. Yöntem herhangi bir özel ekipman gerektirmez ve herhangi bir araştırma laboratuvarı tarafından kolayca benimsenebilir. Sertliğe bağlı hücre tepkilerini anlamaya odaklanan araştırmalarda özellikle yararlı olacaktır.

Abstract

Şu anda, in vitro hücre araştırmalarının çoğu sert doku kültürü polistiren (~ 1 GPa) üzerinde gerçekleştirilirken, vücuttaki çoğu hücre elastik ve çok daha yumuşak (0.1 – 100 kPa) bir matrise bağlıdır. Bu tür sertlik uyumsuzluğu hücre tepkilerini büyük ölçüde etkilediğinden, hücre substratları olarak hizmet etmek için geniş bir sertlik aralığını kapsayan hidrojel malzemelerin geliştirilmesine büyük bir ilgi vardır. Ucuz olan ve vücuttaki tüm yumuşak dokuların sertlik aralığını kaplayan poliakrilamid jeller, birçok araştırma grubu için tercih edilen hidrojeldir. Bununla birlikte, poliakrilamid jel hazırlığı uzun, sıkıcıdır ve yalnızca küçük partiler için uygundur. Burada, jeller için yapısal bir destek olarak kalıcı esnek bir plastik film kullanarak, poliakrilamid jellerin çok kuyulu bir plaka formatında hazırlanmasını sağlayan bir testi açıklıyoruz. Teknik, mevcut yöntemlerden daha hızlı, daha verimli ve daha az maliyetlidir ve başka türlü mevcut olmayan özel boyutlarda jellerin hazırlanmasına izin verir. Herhangi bir özel ekipman gerektirmediğinden, yöntem herhangi bir araştırma laboratuvarı tarafından kolayca benimsenebilir ve sertliğe bağlı hücre tepkilerini anlamaya odaklanan araştırmalarda özellikle yararlı olacaktır.

Introduction

Vücutta en dokular ~ 1 GPa arasında bir elastisite modülüne sahiptir 0.1 kPa ila yumuşak kıkırdağın 100 kPa beyin, ancak, in vitro hücre araştırmalarında en doku kültür polistiren (TCP) üzerinde gerçekleştirilmiştir arasında değişen bir Young modülüne sahip yumuşak viskoelastik malzemelerdir . ¹ Bu sertlik uyumsuzluğu ölçüde hücreler çevrelerine cevap şeklini etkiler. Araştırma artan vücut, ^2,3 kök hücreler de dahil olmak üzere. Bunun sonucunda ⁴ farklı hücre tiplerinin kaderi üzerinde tabaka sertlik etkisi açıklık böylece adanmış, birden hidrojeller sertlik-bağımlı hücre anlaşılmasına yardım için geliştirilmiştir Yü....

Protocol

Hidrojel-ilişkili Çözümleri ve Alikot 1. Hazırlık

1. Poliakrilamid jel ön-madde çözeltisinin hazırlanması.
   1. Akrilamid, (A) karıştırılarak poliakrilamid jel ön-madde solüsyonu hazırlayın (w / v% 40, E _r 71,08 g / Mol) ve çapraz bağlayıcı bisakrilamid (B), (a / h% 2, E 154,17 g / mol _r), ve tespit edilen Tablo 1 'de belirtilen hacim yüzdeleri ile iyonize su.
      NOT: Bu çözümler büyük partiler halinde hazırlanır ve birkaç aya kadar 4 ° C 'de muhafaza edilebilir.
      1. DİKKAT: Akrilamid inhalasyon veya sindirim üzerine toksik olan, özellikle toz biçiminde olduğunda: bu durumda, tercihan, toksisite risk....

Results

Poliakrilamid (PA) hidrojelleri yaygın sertlik bağımlı hücre tepkileri test etmek için kullanılır. ^17,24 akrilamid, (A) ve bis-akrilamid (B) bir çok yumuşak dokuların sertlik aralığı içinde yayılan PA jeller yapabilir çeşitli konsantrasyonlarda karıştırarak gövde - 0.3 -.. Burada 300 kPa Young modülü ¹ Bununla birlikte, bunlar, poliakrilamid jellerin hazırlanması sıkıcı ve zaman genellikle, örneğin, ilaç tarama gibi "yüksek verim" uygulamalarda faydalarını kısıtlayıcı, alıcı ^12, basit ve.......

Discussion

Başlangıçta elektroforez için geliştirilen Poliakrilamid jeller, ²⁸ şimdi rutin hücre morfolojisi, hareketliliği ve diğer hücre özellikleri arasındaki iletişimi ^3,24,29 tarihinde substrat sertlik etkilerini incelemek için hücre kültürü substrat olarak kullanılır. (Şekil 2, Tablo 1 'de referans ^17,25,26 bakınız) polimer ön-madde konsantrasyonu basit bir değişiklikle - (300 kPa 0.3) ¹ Poliakrilamid alt-tabaka sertliğinin manipülasyon vücuttaki tüm yumuşak do.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
40% Akrilamid	Bio-Rad	161-0140
%2 Bis-akrilamid	Bio-Rad	161-0142
Amonyum Persülfat	Bio-Rad	161-07000
TEMED	Sigma Aldrich	T9281
Sülfo-SANPAH	Termo Bilimsel	22589
Kollajen Tip 1, Sıçan kuyruğundan, 3.68 mg / ml	BD Biosciences	354236
Dimetil sülfoksit (DMSO)	Fisher Scientific	BP231-100
Hidrofobik çözelti — Repel Silane	GE Sağlık Biyo-Bilimleri	17-1332-01
PBS (1x), pH 7.4	HyClone	SH30256.01
Polidimehidroksioksan (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kiti]	Elsworth Yapıştırıcılar	3097358-1004
Tyrpsin/EDTA (10x)	Sigma Aldrich	44174
RPMI-1640 Orta (1x)	HyClone	SH30027-02
Fetal Sığır Serumu	HyClone	SH30073-03
Penisilin Streptomisin	MP Biyomedikal	1670046
Deterjan: Triton-X	Sigma Aldrich	T8787
Formaldehit% 37 Çözelti	Sigma Aldrich	F1635
Sığır Serumu Albümini (BSA)	Sigma Aldrich	A2153
BSA bazlı hücre yapışma engelleme kiti — ECM Hücre Yapışma Dizisi Kiti	Chemicon International	ECM540
Tek kullanımlık laboratuvar ekipmanları
>esnek plastik destek — Poliakrilamid Jeller için GelBond PAG Film	GE Healthcare Bio-Sciences	309819
Cam Plakalar	Slumpys	GBS4100SFSL
50 ml konik tüpler	Fisher Scientific	3181345107
15 ml konik tüpler	FALCON	352097
Mikro santrifüj tüpleri	Fisher Scientific	2 ml: 02681258
96 oyuklu plaka (düz tabanlı)	Fisher Scientific	12565501
Tek Kullanımlık Pipetler (1  ml, 2  ml, 5  ml, 10  ml, 25  ml, 50  ml)	Fisher Scientific	1 ml: 13-678-11B, 2  ml: 05214038, 5  ml (FALCON): 357529, 10  ml: 13-678-11E, 25  ML: 13-678-11, 50  ml: 13-678-11F
Cam Transfer Pipetleri	Fisher Scientific	5 3/4": 1367820A, 9":136786B
Pipet Uçları (1-200  μ l, 101-1000  μ l)	Fisher Scientific	2707509
Plastik Standart Tek Kullanımlık Transfer Pipetleri	Fisher Scientific	13-711-9D
Parafilm	PARAFILM >	PM992
Pudrasız Muayene Eldivenleri	Quest	92897
Silikon ara parçalar — Silikon levha, 0,5 mm kalınlık/13 cm x 18 cm	Grace Bio-Labs	JTR-S-0.5
Büyük/tek kullanımlık olmayan laboratuvar ekipmanları
Işık ve Floresan Mikroskop (Axiovert 200M)	Zeiss	3820005619
Mikroskop Yazılımı	Zeiss	AxioVision Rel. 4.8.2
UV fırın	UVITRON	UV1080
Vakum odası/gaz giderici	BelArt	999320237
Gaz giderici için vakum pompası	KNF Lab	5097482
Doku Kültürü Davlumbazı	NUAIRE	NU-425-600
Kimyasal Çeker Ocak	KEWAUNEE	99151
Ters Mikroskop (Axiovert 25)	Zeiss	663526
İnkübatörü	NUAIRE	NU-8500
Pipet Yardımı	Drummond Scientific Co.	P-76864
Hemasitometre	Parlak Çizgi	383684