$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Not: Erkek C57BL / 6 fareleri (5-7 haftalık), Charles River Laboratories International, Inc. (. St-Constant, Quebec, Kanada) ve MUB Sainte-Justine Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylandı protokollere göre manipüle edilebilir. Fare bronş doku eksplantlarında epitelial hücreler üzerinde LMPs proapoptotik etkilerinin araştırılması için primer bronşiyal epitel hücreleri için iyi bir kaynak sağlamaktadır. Bu protokol LMPs in vitro üretimi ve aynı zamanda LMPs ile muamele edilmiş bronş doku eksplantlarında apoptotik epitel hücrelerinin bulgulanması için bir yöntem tarif eder. Bu protokol 3 bölümden oluşmaktadır.
1. LMPs üretimi ve karakterizasyonu
NOT: bulaşmayı önlemek, bu deneyde kullanılan tüm malzemeler steril ya da otoklava olduğundan emin olmak için. Aksi belirtilmediği sürece, steril koşullar altında, bir biyolojik güvenlik kabini içinde oda sıcaklığında her adımları.
1.1) uyarılması ve milletvekillerinin Koleksiyon9
- Bir 37 ° C su banyosu içinde 10000000 CEM T hücreleri bir kısım çözülme. 10 ml seyreltik önceden ısıtılmış serum barındırmayan 200 gx 5 dakika bir 15 ml'lik steril bir tüpe ve santrifüj, X-VIVO hematopoietik ortam. Önceden ısıtılmış orta 5 ml süpernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri aspire.
- 15 ml önceden ısıtılmış hematopoietik X-VIVO gibi orta ve% 5 CO2 ile 37 ° C de, nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde, 4 gün boyunca inkübe ile (süspansiyon hücreleri için), T75 doku kültür şişesi içine aktarın hücreleri.
- 4 gün sonra, 100 ml taze ortam içeren bir T175 doku kültürü şişesi içine, tüm kültür ortamı ve hücre aktarın. Bunlar 2.000.000 hücre / ml'lik bir yoğunluğa kadar büyütüldü kadar aynı koşullar altında yaklaşık 72 saat boyunca hücrelerin kuluçkaya devam edin.
- Eşit dört T175 şişelerinden her biri 150 mi taze ortam ve hücreler, 2.000.000 / ml'lik bir yoğunluğa kadar (yaklaşık 48 saat enkübasyon) büyüyünceye kadar hücre kültürü devam arasında hücreleri ayrıldı.
- 6 hücre yeniden süspanse edin.
- 0.5 ug / ml bir son konsantrasyonda ortama (2 mg / ml'de DMSO içinde çözülmüştür), aktinomisin D edin ve 24 saat boyunca inkübe edilir.
- 50 ml konik tüpler içine tüm kültür ortamı aktarın ve 5 dakika boyunca 750 xg'de hücreleri aşağı doğru döndürün. 15 dakika büyük hücre parçaları kaldırmak için 1.500 xg'de 50 ml konik tüpler ve santrifüj içine süpernatant aktarın.
- 50 dakika boyunca 12.000 xg'de 250 ml şişe ve ultrasantrifüjdeki içine süpernatant aktarın. Süpernatantı atın ve pelet toplamak.
- Yıkama 50 dakika boyunca 12,000 x g'de santrifüj ile 50 ml'lik bir tüp içinde 40 ml steril PBS ile pelet LMPs zenginleştirilmiş. Iki kez bu adımı tekrarlayın.
- Son yıkama süpernatant toplayın; Bu araç kontrolü olarak kullanılır. 1 LMPs pelet Askıyaml PBS ve 1.5 ml steril bir mikrotüp içine aktarın. Kısım ve mağaza izole LMPs -80 ° C 'de (birden fazla serbest-erime döngülerinden kaçınmak için).
FACS Analizi 4 üzerinden milletvekillerinin 1.2) Karakterizasyonu
- CaCI2 olmadan anneksin tamponu 2 örnekleri, 1 ve başka bir hazırlayın: HEPES 10 mM NaCl 140 mM, artı ya da eksi 5 mM CaCl2.
- Parçacıkları kaldırmak için 0.22 mikron filtre kullanılarak anneksin tampon ve FACS akış kılıf sıvısı Filtre.
- FACS tüpüne 5 mM CaCl2 ile anneksin tampon 44 ul LMPs 1 ul sulandırmak. CaCI2 (negatif kontrol) olmadan anneksin tamponu 44 ul LMPs 1 ul bir tüp hazırlanır.
- Her bir tüp içinde annexinV-Cy5 5 ul ilave edin ve iyice karıştırın. Karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin. Her bir tüp içinde, FACS akış kılıf sıvısı 400 ul karışım seyrelterek reaksiyonu durdurun.
- 7 mikron sayma bea 10 ul (200.000 boncuk) EkleHer bir tüp bir iç standart olarak DS süspansiyon mutlak sayısı elde edildi.
- Göreli büyüklüğü kapılarını (FSC-H, PMT E00, ölçek log) ve bağıl granülarite (SSC-H, PMT 325, log ölçek) büyüklüğü kalibre floresan boncuklar kullanılarak sitometrede akış nokta arsa kurulması 1 mikron (kapı 1) ve 7 mikron (kapı 2) hapların kapısı sayma.
- 20.000 sayma boncuk kapısı 2 ulaşılana kadar bir sinyal alarak, nokta arsa (ölçek log, PMT 765) anneksin kurulmuş kapıları ve FL-4 kanal kullanarak FSC-H / SSC-H arsa üzerinde LMPs örnek analiz.
- CaCl2 ihtiva eden tampon maddesi içinde anneksin LMPs pozitif annexinV olaylarını belirlemek ve CaCI2 (negatif kontrol) olmadan anneksin tamponunda LMPs olaylarını çıkarın.
- Aşağıdaki denkleme göre MP'lerin mutlak sayısı hesaplanır:
MP P 1.3) Belirlenmesirotein Konsantrasyon (Bradford tahlili)
- 1.25 ila 20 ug / ml bir protein standardı 5 seri dilüsyonları hazırlayın. Pipet iki kez temiz bir test tüpüne her bir standart ve örnek 800 ul. Her tüpe Bradford boya reaktif 200 ul ekle. İyice karıştırın, daha sonra 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir.
- 595 nm'de absorbansı ölçülür. Standart eğrinin lineer regresyon kullanılarak LMPs protein konsantrasyonunu belirleyin.
2. Bronş Doku Eksplantlarındaki ve LMPs Tedavisi
NOT: Steril bir çalışma ortamı özel dikkat ve aseptik deneyler aşağıdaki kullanılan çözümler ve orta hazırlamak. Komple Şifa Orta hazırlamak 100 ml Doku Şifa Orta (buz üzerinde çözülmüş) Serum ile Doku Şifa Orta Takviyeler 1 ml ekleyin ve iyice karıştırın.
Bronş Doku Eksplantlarından 2.1) hazırlanması
- Kültür işleminden önce, 1 cm 2 6 alanlarını çizilmeyebir neşter ile her biri 100 mm doku kültürü çanağı yüzeyinin kenarında her. Kat her bir kültür çanağı kaplama çözeltisinin 2 ml'si ile 100 mm doku kültürü çanağı çizilmiş ve 37 ° C'de / nemlendirilmiş bir CO2 kuluçka makinesi içinde O, N çanak inkübe edin. Vakum fazlası çözüm aspire ve Doku Yıkama Orta 15 ml çanak doldurun.
- Hayvan bakım etik komitesi tarafından onaylanmış protokollere göre CO 2 solumaktan (5 ila 7 haftalık) C57BL / 6 fareler Euthanize.
- Aseptik neşter, Dumont süper ince cımbız, ve cerrahi makas ile akciğer dokusunun teşrih. Dikkatle parankim ve kan damarları çıkarın. Uygunsa, laboratuara taşınması için buz soğukluğunda Doku, yıkama ortamı içine akciğer dokusu yerleştirin.
- Bundan başka doku Yıkama Ortamı içinde batık bronş incelemek ve periferik akciğer dokulardan 1-2,5 mm bir çapı olan bronş ayırın. Bir neşter ile ~ 5 mm kalınlığında bronş halkalar halinde Dilim bronşiyal dokular.
Bronşiyal parçaları pick up ve yemekleri çizik alanlar üzerine yerleştirmek için steril kavisli Microdissecting forseps ile bir çekiş hareketi kullanın. - Doku Yıkama Ortamı çıkarın ve bunları tabaklarına yapışmasının sağlanması için ~ 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe fragmanları.
- Her yemeğin Komple Şifa Orta 10 ml ekleyin ve kontrollü bir atmosfer modüler inkübatör odasına koyun. Yüksek O2 gaz karışımı (% 70 O2,% 25 N2 ve% 5 CO2), odasını yıkayın. Bir tezgah üstü yörünge inkübatör odasına yerleştirin ve 37 ° C'de sallayın. Orta parçaları üzerinde aralıklı olarak akmasına izin verecek şekilde, dakikada 10 çevrim, 24 saat boyunca çalkalayın.
- 24 saat inkübasyondan sonra, bir faz-kontrast ters ışık mikroskobu altında doku eksplantlar dikkate alınmalıdır. Sonraki LMPs tedavisi için tam, ince saç hareketi ve canlı bronş epitel ile bronş eksplantlar seçin.
2.2) LMPs Tedavi
- Aşağıdaki gibi tam büyüme ortamı hazırlayın: çözülme büyüme ortamı takviyeleri buz serum ve fibroblast inhibitörü ile. Serum ve büyüme ortamı, 100 ml 200 ul fibroblast inhibitörü ile büyüme ortamı takviyesi 1 ml ilave et; iyice karıştırın. Kullanımdan önce, 10 dakika boyunca 37 ° C'de tam büyüme ortamı ısıtın.
- 800 ug / ml bir konsantrasyonda bir LMPs stok hazırlamak için PBS ile yeni bir steril bir Eppendorf tüpü içinde izole LMPs seyreltin.
- 12-çukurlu bir doku kültür plakasının her bir oyuğuna, tam büyüme ortamında 0.5 ml ilave edilir.
- Doku kültürü plakasının her bir kuyunun önceki protokol (bölüm 2.1) den kavisli Microdissecting forseps ile seçilen bronşiyal eksplantlar aktarın.
- LMPs tedavi kuyuları ve kontrol kuyuları tespit etmek uygun kültür plaka etiketleyin. Ve 25 ul kontrol aracı (40 ug / ml bir son konsantrasyon için) her LMPs tedaviye 25 ul LMPs stok ekleyin (bkz LMP Kontrol kuyuları s üretimi).
- Hafifçe çalkalanarak 37 ° C sıcaklıkta kontrollü bir atmosfer modüler inkübatör içinde inkübasyona devam edin.
- 24 saat sonra, PBS ile eksplantlar 3 kez yıkayın ve bir sonraki aşama (% 4 paraformaldehit [PFA] katılaştırma) geçin.
3. Histopatolojik Sınav
3.1) Sonraki Adımlar Devam Etmeden Önce ardından Çözümler hazırlayın
- 137 mM NaCI, 2.7 mM KCI, 10 mM Na-2 HPO 4, 1.76 mM KH 2 PO 4, pH 7.4 karıştırılarak 1x PBS tamponu hazırlayın.
- % 4 PFA, karıştırılarak 60 ° C'de ısıtıldı, 400 ml su içinde PFA 20 g çözülmesi hazırlamak; çözeltinin-berraklaştırılması için 10 M NaOH ve bir kaç damla ekleyin. Sonraki 1x PBS tampon ekleyin ve 7.4 500 ml hacim ve pH ayarlamak. Filtre ve kısım; -20 ° C'de saklayın.
- Aşağıdaki dehidrasyon veya rehidrasyon reaktifler hazırlayın; % 100,% 90,% 70,% 50 etanol ve ksilen.
e_step "> 3.2) Eksplantın Fiksasyon ve Doku Bölüm parafinden arındırma
- % 4 PFA 1.5 ml ile etiketlenmiş bir mikrosantrifüj tüpü içinde, her eksplant yerleştirin ve 4 ° C 'de O / N inkübe edin. 1x PBS ile iki kez eksplantlar durulayın.
- Bir alkol serisi ile eksplantlar kurutmak (% 70 etanol: Her 3 kez 30 dakika% 90 etanol: Her 2 kez 30 dakika,% 100 etanol: 3 kez 30 dakika her biri, daha sonra, ksilen, 3 kere 20 dakika) ekstrakte edildi. Bir çeker ocak içinde, oda sıcaklığında bütün adımları.
- Bir fırın içinde 58 ° C 'de parafin doku eksplantlar imbed. Bir döner mikrotom kullanılarak 5 mikron kalınlığında doku bölümleri hazırlayın.
- 56 ° C su banyosunda bölümleri Şamandıra ve sonra etiketli histolojik slaytlar üzerine bölümleri monte edin. 1 saat 65 ° C'de manuel boyama rafları ve kuru slaytlar yerleştirin. Slaytlar oda sıcaklığında soğumaya bırakın.
- Parafin çıkarmak için 10 dakika her ksilen içeren 4 ardışık leke yemekler rafları batırın. Inci, sonra% 100,% 95: iksilenin çıkması için bir etanol seri rafları Dipdaha sonra% 80,% 70, sonra% 50 etanol (her adım için 5 dakika) tr. Etanolü ortadan kaldırmak için 5 dakika boyunca musluk suyu ile rafları durulayın.
3.3) Hematoksilen Eozin ve (H & E) Boyama
- Sabit doku bölümleri ile çalışmaya devam; 15 dakika için Mayer'in Hematoksilen ile dolu bir boyama çanak içine raf yerleştirin. 20 dakika için hematoksilin kaldırmak için musluk suyu ile raf durulayın.
- 30 saniye için% 95 etanol içinde 30 sec.Place için damıtılmış su içinde yerleştirin. 1 dakika Eosin Y çözüm boyama çanak yerleştirin. 2 dakika her biri için,% 95 etanol,% 100 etanol ve ksilen 2 değişikliklere dihidrat.
- Fazla eozin çıkarıldığından emin olmak için bir mikroskop altında hızlı bir kontrol yapınız. Bir kapak camı ile kapak daha sonra, her bir slayt üzerine montaj ortamı (Fisher SP15-100) olarak 2-3 damla yerleştirin.
3.4) in situ hücre ölümü algılama içinde: TÜNEL tahlili
- Başlamadan önce, proteinaz K çalışma çözeltisi hazırlayın: 20 ug / ml10 mM Tris / HCI, pH 7.4 ile yıkanır.
- Bölüm 3.2 (Eksplantın tespit ve doku bölüm Parafinden arındırmadan) 5'e kadar olan adımları tekrarlayın 1. Deiyonize H 2 O ile slaytlar durulayın
- 10 dakika boyunca 1x PBS ile slaytlar daldırın. Aşırı PBS boşaltın. Proteinaz K kullanmaya hazır çözelti ile oda sıcaklığında 30 dakika boyunca doku bölümleri inkübe edin. Durulayın 1x PBS ile iki kez kayar.
- Hücre ölümü algılama kiti Öğretim Kılavuzunda açıklandığı gibi TÜNEL tahlili yapın. Montaj orta kullanarak monte, ve cam lamelleri ile manuel lamel.
- Bir ışık mikroskobu altında örnekleri analiz edin. Kahverengi renk apoptotik hücreleri analiz Pro Image 4.5 kullanın.