Hücre zarı atkı mikroparçacıklar (MPler), izole edilmiş ve kendi patofizyolojik etkileri, çeşitli modelleri üzerinde araştırılabilir aktif biyolojik veziküllerdir. Burada T lenfositleri (LMPs) türetilen milletvekillerini üretilmesi için ve solunum yolu epitel hücreleri üzerindeki proapoptotik etkilerini kanıtlamak için bir yöntem tarif eder.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Havayolu Epitel Hücreleri üzerinde Lenfositik mikrotanecikler ve proapoptotik Etkisi Algılama Üretimi
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Hücre-hücre iletişimine hücre zarı türetilmiş veziküllerin biyolojik rolleri ilgi son yıllarda artmıştır. Mikropartiküller (MP) ile 1 um, 0.1 um çapı kadar, veziküllerin böyle bir tipi olup, tipik olarak aktivasyonu ya da apoptoza ökaryotik hücrelerin plazma zarından döküldü. Burada D LMPs çok aşamalı bir diferansiyel santrifüj işlemi ile izole edilir ve akış sitometrisi kullanılarak, özelliği aktinomisin ile uyarılan apoptotik CEM T hücreleri T lenfosit kaynaklı mikro (LMPs) üretimini tarif eder. Bu protokol, aynı zamanda, fare primer solunum bronş doku eksplantlarında türetilen bronş epitel hücrelerinde LMPs proapoptotik etkilerini kanıtlamak için in situ hücre ölümü algılama yöntemi sunulur. Burada tarif edilen yöntemler, in vitro apoptotik lenfositlerden LMPs, çok miktarda izole etmek için tekrarlanabilir bir yöntem sağlamaktır. LMPs türetilmişBu şekilde, çeşitli hastalık modellerinde özelliklerini değerlendirmek için kullanılır ve farmakoloji ve toksikoloji testleri için edilebilir. Solunum yolu epitel dış çevre ve altta uzanan doku arasındaki bir koruyucu fiziksel ve fonksiyonel bariyer sunar göz önüne alındığında, bronşiyal doku eksplantlarında yerine ölümsüz epitel hücre çizgilerinin kullanımı yolu sistemi doku gerektiren araştırmalar için etkili bir model sağlar.
Giriş
Mikropartiküller (MP'ler), hücre aktivasyonu veya apoptozdan sonra salınan biyolojik olarak aktif mikron altı zar vezikülleridir. MP'ler hem sağlıklı hem de hasarlı hücrelerden türetilir ve birçok fizyolojik ve patolojik süreçte rol oynarlar. 1 MP'ler sadece insan plazmasında değil, aynı zamanda enflamatuar ve apoptotik dokuda da tespit edilmiştir. Hücre zarından türetilen MP'lerin biyolojik faydası, hücre sinyalleme modelleri ve farmakolojik araçlar dahil olmak üzere çeşitli ortamlarda gösterilmiştir. 2,3 Daha önce, aktinomisin D stimülasyonunu takiben (apoptozu indüklemek için) T lenfositlerden türetilen LMP'lerin anjiyogenezi baskıladığını ve ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Not: Erkek C57BL / 6 fareleri (5-7 haftalık), Charles River Laboratories International, Inc. (. St-Constant, Quebec, Kanada) ve MUB Sainte-Justine Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylandı protokollere göre manipüle edilebilir. Fare bronş doku eksplantlarında epitelial hücreler üzerinde LMPs proapoptotik etkilerinin araştırılması için primer bronşiyal epitel hücreleri için iyi bir kaynak sağlamaktadır. Bu protokol LMPs in vitro üretimi ve aynı zamanda LMPs ile muamele edilmiş bronş doku eksplantlarında apoptotik epitel hücrelerinin bulgulanması için bir yöntem tarif eder. Bu protokol 3 bölümden oluşmaktadır.
1. LMPs üretimi ve kar....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
LMPs floresan-aktive edilmiş hücre (FACS) analizi, sıralama ve MP'lerin (≤1 um)% 97 anneksin-V-Cy5 pozitif olan 1 um boncuklar kullanılarak bir kapı ile anneksin V boyama 10 ile karakterize edilmiştir (Şekil 1A ve 1B). Tipik haliyle, LMPs yaklaşık 2.5 mg ile bu protokol izlenerek elde edilmiştir. C57BL bronş doku eksplantlarında / 6 fareleri araç ve LMPs işlemine tabi tutulmuştur. Bronşiyal bölümlerin histopatolojik analizi bronşiyal epitel yapısal bütünlüğü ile LMPs etkisini ortaya çıkar.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Milletvekilleri hücrelerarası çapraz konuşma aktif arabulucular ve onların çalışma bilimin birçok alanda umut vericidir. 11 Bu çalışma bir apoptotik T hücre soyu elde LMPs in vitro büyük ölçekli üretimi için ayrıntılı bir protokol sundu. Bu MPler lenfosit moleküllerinin büyük bir repertuarı ifade eder ve biyolojik hücre ve doku homeostazının düzenlenmesinde rol oynar. Bununla birlikte, farklı kaynaklardan elde edilen LMPs biyolojik olarak farklı olabilir. 4,9,12,13
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Teşekkürler
Vizyon Sağlık Araştırma Ağı - Bu çalışma Sağlık Araştırması (178.918), Fonds de recherche en santé du Québec, Kanada Enstitüleri hibe ile desteklenmektedir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| LMP'lerin üretimi ve karakterizasyonu | |||
| CEM T hücreleri | ATCC | CCL-119 | |
| X-VIVO 15 orta | Cambrex, Walkersville | 04-744Q | |
| Şişe T75 | Sarstedt | 83.1813.502 | |
| Şişe T175 | Sarstedt | 83.1812.502 | |
| Aktinomisin ve nbsp; D | Sigma Kimya A.Ş. | A9415-2mg | |
| PBS | Yaşam Teknolojileri | 14190-144 | |
| 0.22 ve mikro; m filtre | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Annexin-VCy5 | BD Pharmagen | ||
| FACS akış çözümü | BD Bio-sciences | 342003 | |
| Floresan mikro boncuklar (1 & mikro; m) | Moleküler Problar | T8880 | |
| Polisteren sayma boncukları (7 & mikro; m) | Bangs laboratuvarları | PS06N/6994 | |
| Polipropilen FACS tüpleri | Falcon | 352058 | |
| 1 ml pipet | Fisher | 13-678-11B | |
| 5 ml pipet | Falcon | 357543 | |
| 25 ml pipet | Ultident | DL-357551 | |
| 1.5 ml konik polipropilen mikro tüp | Sarstedt | 72.690 | |
| 15 ml konik polipropilen tüp | Sarstedt | 62.554.205 | |
| 50 ml konik polipropilen tüp | Sarstedt | 62.547.205 | |
| 50 ml yüksek hızlı polipropilen kopolimer tüp | Nalgene | 3119-0050 | |
| 250 ml yüksek hızlı polipropilen şişe | Beckman | 356011 | |
| Protein tahlili (Bradford tahlili) | Bio-Rad Laboratories | 500-0006 | |
| Protein tahlili standardı II | Bio-Rad Laboratuvarları | 500-0007 | |
| Test tüpü 16 x 100 | VWR | 47729-576 | |
| Test tüpü 12 x 75 | Ultident | 170-14100005B | |
| Hücre inkübatörü ve nbsp; | Mandel | Heracell 150 | |
| Düşük hızlı santrifüj | IEC | Centra8R | |
| Yüksek hızlı santrifüj | Beckman | Avanti J8 | |
| 250ml şişe için yüksek hızlı rotor | Beckman | JLA16.250 | |
| 50ml tüp için yüksek hızlı rotor | Beckman | JA30.50 | |
| Fow sitometri ve nbsp; | BD Bio-sciences | FACS Calibur | |
| Spektrofotometre | Beckman | Serisi 600 | |
| Bronş dokusu eksplantları ve kesitleri | |||
| C57BL / 6 fare (5-7 haftalık) | Charles River Laboratuvarları, Inc. | ||
| Fare Hava Yolu PrimaCell ve ticaret; Sistem: | CHI Bilimsel, Inc. | 2-82001 | |
| Kaburga Sırtlı Karbon Çelik Neşter Bıçakları | Becton Dickinson AcuteCare | 371310 | # 10 |
| Neşter Saplı | Güzel Bilim Araçları A.Ş. | 10003-12 | # 7 |
| faz kontrastlı ters mikroskop | Olympus Optical CO., LTD. | CK2 | |
| yüksek O2 gaz karışımı | VitalAire Kanada A.Ş. | ||
| modüler kuluçka odası | Billups-Rothenberg Inc. | MIC-101 | |
| MaxQ 4000 inkübe orbital çalkalayıcı | Barnstead Lab-Line, | SHKA4000-7 | |
| 12 oyuklu doku kültürü plakası | Becton Dickinson and Company | 353043 | |
| Plastik doku kültürü kapları (100 mm) | Sarstedt, Inc. | 83.1802 | |
| Cerrahi makas | Güzel Bilim Araçları A.Ş. | 14060-09 | Düz, keskin, 9 cm uzunluğunda |
| Yarı kavisli Graefe forseps | Güzel Bilim Araçları A.Ş. | 11052-10 | |
| nemlendirilmiş CO2 inkübatörü | Mandel Scientific Company Inc. | SVH-51023421 | |
| Histopatolojik inceleme | |||
| formalin formaldehit | Sigma-Aldrich, Inc. | HT5011 | |
| parafin | Fisher bilimsel Uluslararası, Inc. | T555 | |
| etil alkol | Merck KGaA, Darmstadt | EX0278-1 | |
| Glutaraldehit | Sigma-Aldrich, Inc. | G6403 | |
| Kakodilat | Sigma-Aldrich, Inc. | 31533 | |
| mikroskop slaytları | VWR Scientific Inc. | 48300-025 | 25x75 mm |
| Ksilen | Fisher bilimsel Uluslararası, Inc. | X5-4 | |
| Mayer'in hematoksilen | Sigma-Aldrich, Inc. | MHS16 | Filtre kağıdı ile huni |
| HCl | Fisher bilimsel Uluslararası, Inc. | A144s-500 | |
| eozin ve nbsp; | Sigma-Aldrich, Inc. | HT110116 | Filtre kağıdı ile huni |
| Montaj ve ticaret; Montaj Ortamı | Thermo Fisher Scientific Inc. | SP15-100 | |
| cam lamel | cerrahi tıp endüstrileri, Inc. | 84503 | 24 kez; 24 #1 |
| TUNEL tespit kiti | Yerinde Hücre Ölümü Tespiti, POD | 11 684 817 910 | |
| fırın | Sevkiyat Sanayi A.Ş. | LEB-1-20 | |
| döner Mikrotom | Leica Microsystems Inc. | RM2145 | |
| filtre kağıdı | Whatman International Ltd. | 1003150 | #3 |
| Mikroskop | Nikon Görüntüleme Japonya A.Ş. | E800 | |
| boyama kabı komple | Wheaton Industries, Inc. | 900200 | çanak, raf, kapak dahil |
| 1,5 ml eppendorf tüp | Sarstedt Inc. | 72.69 | 39x10 mm |
| Orbital ve Pistonlu Su Banyosu | ExpotechUSA | ORS200 | |
| fosfat tamponlu tuzlu su | GIBCO | 14190-144 | |
| çeker ocak | Nicram RD Service | 3707E |
Kaynaklar
- Tushuizen, M. E., Diamant, M., Sturk, A., Nieuwland, R. Cell-derived microparticles in the pathogenesis of cardiovascular disease: friend or foe. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (1), 4-9 (2011).
- Martinez, M. C., Tual-Chalot, S., Leonetti, D., Andriantsitohaina, R.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
