Yöntem makalesi

Stereotaktik Enjeksiyon Tekniği uygulamak Hayvan Davranışları üzerinde Genetik Etkileri Eğitim için

DOI:

10.3791/52653

⸱

10 Mayıs 2015

 , 
1Department of Biology, The Pennsylvania State University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lentivirüsler cDNA'larını ifade eden ya da shRNAs farelerde spesifik beyin bölgelerinde gen ifadesini modüle edebilen stereotaktik enjeksiyon. Burada, biz Açık Alan Testi (OFT) ve Zorla Swim Testi (FST) gibi davranışsal görevleri ile stereotaktik enjeksiyon birleştirmek için bir protokol mevcut.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stereotaktik enjeksiyon farelerde hedeflenen beyin bölgelerine yüksek titre lentiviruses sunmak için yararlı bir tekniktir. Lentivirüsler aşırı ifade eden ya da beyin dokusuna önemli bir zarar vermeden, nispeten odaklanmış bölgede demonte gen ekspresyonu ya. İyileştikten sonra, enjekte edilen fare gibi Açık Alan Testi (OFT) ve Zorla Swim Testi (FST) gibi çeşitli davranışsal görevler üzerinde test edilebilir. OFT fare bir roman açık alanda merkezinde geçirdiği süreyi ölçerek farelerde hareketlilik ve endişeli fenotip değerlendirmek için tasarlanmıştır. Bir daha endişeli fare kontrollere göre yeni alanın ortasında önemli ölçüde daha az zaman harcayacaksınız. FST bir kova su içine yerleştirildiğinde fareler hareketsiz harcamak süreyi miktarının anti-depresif fenotip değerlendiriyor. Bir anti-depresif bir fenotipe sahip bir fare kontrol hayvanları ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha az zaman hareketsiz geçirecek. Bu protokolün amacı, ster kullanmaktırdavranış testleri ile birlikte bir lentivirüs eotactic enjeksiyon hayvan davranışlarını modüle nasıl genetik faktörler değerlendirmek için.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu genetik olarak manipüle edilmesi kolaydır, çünkü fare yaygın nörobiyolojisinde kullanılmıştır. Gen nakavt teknikleri her genetik faktör fare davranışlarını nasıl şekillendirdiğini araştırmacılar araştırmak için izin verir. Ayrıca, CRE-loxP sistemi doku için değerli bir araç sağlar ve farklı dokular içindeki gen fonksiyonu çalışma için araştırmacılar sağlar farelerde tip spesifik gen nakavt, Celi. 1 Bununla birlikte, uygulamada, CRE promoterlerin ekspresyon modelleri kontrol edilmesi zor olan ve bugüne kadar birçok kurulan CRE sürücüleri bölgeye özgü ifadesini elde değil. 2,3

Seçenek olarak ise, stereotaktik enjeksiyon yetişkin fare spesifik beyin bölgeleri hedef alan bir yöntemdir. CDNA veya shRNA eksprese genetik mühendisliği virüsleri enjekte ederek, gen ekspresyonunun bölgeye özgü modülasyonu elde edilebilir. Her bir farenin beyni boyutu değişir, ancak spesifik beyin bölgelerinde yer stereotaktik Coordi kullanılarak belirlenebilirkalça fare beyin kafatası üzerinde simgesel ayarlayın. En sık kullanılan görülecek Bregma, lambda ve interaural çizgi vardır. Beyin atlas elde edilen koordinatları kullanarak, her bir beyin bölgesinden 4 tam konumu antero-posterior (A / P), medyal lateral (M / L) ile tespit edilebilir, ve dorsal-ventral (D / V) 'den eksenleri Bregma / interaural hat kavşak. Enjeksiyonlar floresan mikroskobu ile teyit edilebilir ve böylece Tipik farelerin beyinlerinde enjekte virüsler ya kırmızı ya da yeşil floresan protein (RFP veya GFP) ile etiketlenmiş.

Farelerin Davranış değerlendirmeler psikiyatrik bozuklukların temel araştırma için özellikle gereklidir. Hastalarda psikiyatrik bozuklukların belirtileri genellikle anormal davranışları içerir. Bu insan davranışlarının bazıları evrimsel olarak korunmuş olan ve doğrudan taklit ve farede gözlenebilir. Örneğin, depresyon, davranışsal umutsuzluk ölçerek fare örnek alınabilir. Sık sık depresyon olan kişilerHiç yardımcı olacaktır yapmak bir şey sanki tr, sonunda intihara yol açabilir belirti hissediyorum. Kemirgenler, bu suyun bir havuzda yüzen karşı yüzme fare (vazgeçerek olarak görülüyor) süreyi ölçen Zorla Swim Testi (FST) kullanılarak modellenebilir. Bu paradigma, anti-depresanlar ile fenotip tahlisiye tarafından onaylanmıştır. Tedavi edilmeyen kontrollerle karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha az zaman harcayacaksınız hareketsiz anti-depresanlar almış 7,8,9 Fare. Başka bir davranış testi, Açık Alan Testi (OFT) farelerde lokomosyon değerlendirmek için tasarlanmıştır ve ayrıca farelerde endişeli fenotip analiz etmek için de kullanılabilir. 5,6 Bu test de yakın zaman fareler daha güvenli hissediyorum önermesine dayanır Bir roman açık alanda duvara. Onlar meraklı hayvanlar vahşi tip fareler sonunda, yeni bir ortam araştıracaktır. Ancak, alanın merkezinde daha az zaman harcama fare geçirme girişimlerini aşmak mümkün olmayacaktır olarak, fare anksiyete gösterirl korku yeni bir ortama getirdiği. Açık alanın merkezinde kaldığı zaman miktarı ile belirlenir olarak fare anksiyete, birçok psikiyatrik bozukluklarda mevcut olduğu, insanlarda klinik anksiyete, karşılaştırılabilir.

Davranış paradigmaları stereotaktik enjeksiyon kombinasyonu hedef beyin alanında, belirli bir genin ekspresyonunu değiştirmek için yeni bir yöntemdir. Fare davranışlar üzerinde modüle edilmiş gen ekspresyonu etkisi daha sonra tespit edilebilir. Tüm beyin nakavt aksine, bu yöntem, yalnızca spesifik beyin alanları hedef olarak özellikle yararlıdır. Buna ek olarak, stereotaktik enjeksiyon, tipik olarak, yetişkin vahşi tip fare gerçekleştirilir, bu nedenle, endojen gen ekspresyonu gelişim aşamalarında içinde muhafaza edilmiştir. Gen gelişim embriyonik veya postnatal aşamasında hayatta kalmak için gerekli ise bu yöntem şaşırtmak etkisini önlemek olacaktır. Bir büyük sınırlama deneysel fareler Throug gitmek gerekir olduğunuH farelerin kafatası sahip olduğu bir invaziv cerrahi, açılacak. Ayrıca, gen modülasyon derecesi virüsün titresi ve verimlilik ile belirlenir. Virüs özel aletler gerektirir stereotaktik koordinatları kullanarak doğru bölgeye enjekte edilmesi gerekmektedir. Doğru enjeksiyon yerinde doğrulanması sadece otopsi tamamlanabilir.

Bu yöntem, daha önce çeşitli nörolojik hastalıklarda spesifik bir genin katılımını test etmek için kullanılmıştır. Örneğin, virüslerin aracılık ettiği bir RNAi (dopamin sentezlenebilir sağlar) Th genini hedef substantia nigra compacta'da enjekte edildi ve lokomotor davranışını analizi yapılmıştır. Bir başka çalışmada 10 ile ilgili olarak, fare davranışını değerlendirmek için bir lentivirüs susturulması DISC1 stereotaktik enjeksiyon kullanılan şizofreniye. DISC1 demonte yenilik tepki olarak artan hareketin neden (paralellikler şizofrenide pozitif belirtiler) ve daha fazla hareketsizlikFST. 11 Benzer bir şekilde, ek bir çalışma, 5-HT1B aşın dışa vurum, OFT artmış büzülmesi için bu yöntemi kullanan bir anti-anksiyete fenotipi ile tutarlı neden olduğunu buldu. 12 Stereotaksik enjeksiyonlar CRE-loxP farelerde rekombinasyonu azaltmak için cre virüsü sağlayabilir . Bu yöntem, selektif amigdala Y2 reseptörü ve stria terminalisin yatak çekirdeği silmek için kullanılmıştır. Davranış analizi üzerine, bu fareler gen merkezi amigdala silindi bir anti-depresif fenotip bulundu, ancak bulundu gen bazolateral amigdala veya stria terminalisin yatak çekirdeğinde silinmiş hiçbir fenotip. 13 Böylece, bu tekniği Hayvan davranışları üzerinde genetik etkisini araştırmak için benzersiz bir araç sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: hayvanlarla ilgili tüm protokoller Pennsylvania State Üniversitesi'nden hayvan bakım yönergelerine uygun olarak takip edildi, IACUC # 44057

1. lentivirüs Üretimi

Not: Transfeksiyondan bir önceki gün, LentiX-293 hücreleri,% 80 birleşme olmalıdır.

  1. Sadece transfeksiyondan önce DMEM ile hücrelerin durulayın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca penisilin (100 lU / ml) ve streptomisin (100 ug / ml) içeren DMEM /% 10 FBS, 10 ml inkübe edilir.
  2. 1 dakika boyunca 1 DMEM ilave edildi ve girdap: 3 oranında (PEI 3 ul DNA 1 ug:) DNA ve polietilenimin (PEI), 1 (1 mg / ml) ile seyreltilir. DNA hacmi DNA konsantrasyonuna bağlıdır ilave edildi. 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
    1. Örneğin, çanak başına PEI 60 ul vektör plasmidinin 10 ug, psPax2 14 plazmidinin 5 ug, veziküler stomatit virüsü (VSV), 5 ug oluşan bir DNA plazmidi 20 ug kullanın.
  3. 1 dakika boyunca karıştırın tekrar DNA ve PEI çözüm karıştırın. 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
  4. DMEM (100 mm tabak içinde 10 ml kültür ortamı için, yani, 1 ml) 'nin toplam kültür ortamının 1/10 hacim. Çanak içine damla DNA PEI karışımı damla 1 ml ekleyin ve kültür ortamı DNA ile iyi karıştırılmış olduğu için kadar etrafında çanak girdap.
  5. Oda sıcaklığında 6 saat süreyle inkübe ve süpernatant kaldırmak. Kültür ortamının 5 ml.
  6. Transfeksiyondan 48 saat sonra, 50 ml bir tüp içinde, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 627 x g'de viral süpernatan ve spin toplar. Ultrasantrifüj işlemi tüp içine 0.45 um'lik bir şırınga filtreden geçirilerek viral süpernatanın 30 ml filtre.
  7. Tüpler dengelemek ve parafilm küçük bir parça ile tüpler kapsayacak şekilde steril su ekleyin. Spin tüpler 4 ° C'de 120 dakika boyunca 11.249 x g'de. Bir vakum ucu kullanarak sıvı çıkarın.
  8. Soğuk PBS 100 ul tüp ekleyin. Yavaşça 4 ° CO / N tüp sallayın.
  9. Virüs, pipet t yeniden askıyaO PBS ucu ile pelet dokunmamaya dikkat ederek, pelet 10 defadan fazla adım 1.8 ekledi. Bu tamamlanana kadar pelet yeniden süspansiyon haline edilmeyecektir.
  10. -80 ° C sıvı nitrojen ve mağaza tüp, flaş-freeze başına 10-20 ul virüs kısım.

2. Stereotaktik Enjeksiyon

Araçların 2.1) hazırlanması

  1. Ameliyat öncesi makas, künt uç forseps, bir iğne tutucu, neşter, pamuklu bir çift ve bir sterilizasyon göstergeli kapalı bir paket içinde bir bez ve otoklav yerleştirin. Ayrıca,% 10 povidon iyot,% 70 etil alkol, emilebilir sütürler, bir ısıtma yastığı, suni gözyaşı edinin cam boncuk sterilizatör, matkap, bir matkap ucu, 2 atılabilir şırınga, enjeksiyon şırınga, elektrikli tıraş makinesi, analjezik (ketoprofen), anestetik (avertin), eldiven ve enjeksiyon pompası ile stereotaktik aparatı.
  2. 0.2-kullanılarak steril kaputu% 1.25 avertin taze çözüm o gün, filtre Yap# 181; steril şırınga filtresi m ve steril serum şişenin içine yerleştirin. Tert-amil alkol 5 ml 2,2,2-tribromoetil alkol 2.5 g karıştırın, daha sonra, 200 ml su içinde çözülür. 5. 15 altında pH'ı tutun

Fare 2.2) Hazırlanması

  1. Fare (375 mg / kg) 'nin ağırlığına göre avertin uygulayın. 15, bir karın içinden (İP) enjeksiyon yoluyla Avertin fare ile enjekte edilir, ve daha sonra tamamen anestezi kadar geri kafes içine yerleştirin.
  2. IP enjeksiyonu (ketaprofen, 5 mg / kg), yer ve kurumasını önlemek için fare gözleri yapay gözyaşı yoluyla bir analjezik verin.
  3. Fare onların ayak kısma tamamen uykuda olduğundan emin olun. Fare ayak tutam yanıt verirse, o zaman (50 ul dozlarda) daha anestetik verir. Elektrikli tıraş makinesi kullanarak fare kafasını tıraş. (Burnu üstüne, tipik kulakların hemen arkasından) ameliyat edilecek alanı ve çevredeki tıraş.
  4. Fare i yerleştirinStereotaktik aparat nto. Anterior kelepçe üzerine ön dişler Mandal ve kelepçe düşürmek ve çene tamamen güvenli olduğunu böylece sıkın.
  5. Tam kafa stabilize etmek kulak kanalına kulak çubukları yerleştirin. Iç kulak zarar verebilecek olan, çok kulak çubukları eklemek için dikkatli olun. Bitmiş kez fare vücut başının pozisyonunu bozmadan hafifçe taşınacak gerekir.
  6. Prosedür boyunca farenin vücut ısısını düzenlemek için farenin altında bir ısıtma yastığı yerleştirin.
  7. İyice cerrahi bölgeyi temizleyin. Bir pamuklu çubuk kullanarak, cerrahi sitenin ortasından başlayarak ve dışa doğru hareket, dairesel hareketlerle% 10 povidon iyot ovalayın. Ardından, aynı şekilde cerrahi sitede% 70 etil alkol ovmak bir pamuklu bir bez kullanın. İki kez tekrarlayın.

2.3) İlk Kesi

  1. Fare prepped sonra, steril ekipman çantayı açın. Değişim eldiven touchi öncealetleri ng. Steril bir bez çıkarıp bez üzerine aletleri yerleştirin. Herhangi bir enstrüman bir un-steril bir yüzey dokunursa, sterilize 15 saniye için cam boncuk sterilizatör kullanın.
  2. Baskın olmayan el dominant el ve künt uçlu forseps neşter atın. Künt uç forseps yavaşça kavrama fare cilt kullanmak ve neşter kullanılarak bir kesi yapmak. Yaklaşık 1,5 cm (burun doğru) kulakların üstünde kesi başlayın ve kulakları altında yaklaşık 0.5 cm uzatmak. (Şekil 1) bregma maruz farenin kafasının ortasında aşağı dikey kesi uzatın.
  3. Bregma görüntülenmiştir sonra, yavaşça kafatasının yüzeyini örten herhangi bir kan çıkarmak için steril pamuk ucu almak. Başın tarafa doğru cilt itmek için iki pamuk ipuçlarını kullanın.

2.4) Ekipman Kurulumu

  1. Herhangi bir Kan kafatasının yüzeyine kaldırılır ve açık bir şekilde görünür hale bregma sonra (con şırınga hazırlanması10 8 TU 1 ul / ml hacim) santrasyonu. Davlumbaz, virüs ile şırınga enjekte edilecek doldurun. Hiçbir kabarcıklar içinde olduğundan emin olun. Tam güvenli olduğundan emin olun, stereotaktik aparatı içinde şırınga yerleştirin.
  2. Steril şırınga iğne ucu bregma kesiştiği ve interaural hattına ayarlanır böylece, doğru kafatasının yüzeyi üzerinde olduğu kadar yavaşça şırınga indirin. Sıfır olarak bu noktayı ayarlayın ve bu noktadan itibaren koordinatları belirler.
  3. Ilgi beyin alanına bağlı olarak, stereotaktik koordinatlar değişir. Bir beyin atlası 4 kullanılarak bu koordinatları belirler. Koordinatlar belirlendikten sonra, bu koordinatları maç için şırınganın iğne taşımak. Koordinatları kullanarak dentat girus Hedef: = +/- 1 mm, A / P = -1,82 mm M / L. Delik delinmiş gereken yere görselleştirmek için kafatası üzerinde sağa iğne indirin.
  4. Biraz şırıngayı kaldırın matkap almak ve matkap bi yerkafatasına yaklaşık 45 ° açıyla hedef matkap sitenin üstünde t hakkı. Sondaj başlayın ve kafatası yol verir kadar sondaj tutmak. Kafatası yol verdiğinde, direniş bir düşüş tespit edilebilir. Kortikal hasar görmesini önlemek amacıyla, beyne delmek için dikkatli olun.
  5. Steril pamuk ucu alın ve delikten herhangi bir kan silin.
  6. Ucu sağ beyin (değil kafatası) yüzeyinde oturur, böylece şırınga indiriniz. D / V beyin atlas koordinatlara göre, istenilen derinliğe Alt 0'a şırınga (derinlik) koordinat ayarlayın. -1,79 Mm dentat girus, set D / V ulaşmak için.
  7. 0.2 ul / dk'lık bir hızda enjekte başlatın. Şırınga istenilen derinliğe daha düşük kayma olmadığından emin olmak için izleyin. Bu durum ortaya çıkarsa, yavaşça tekrar istenilen derinliğe şırınga yükseltmek.
  8. Enjeksiyonu tamamlandıktan sonra, herhangi bir kalıntı virüs absorbe edildiğinden emin olmak için yaklaşık 2 dakika bekleyin. Yavaş yavaş şırınga yükseltmek ve herhangi li kaldırmak için bir pamuk ucu kullanınenjeksiyon yerinde sterlin.
  9. Diğer yarımkürede için tekrarlayın.

2.5) Sütür

  1. Ambalajından ve kavrama iğne tutucular kullanılarak iğne steril dikiş ve iğne çıkarın. Uzak iğne tutucu iğne sivri kenarını Yüz. Baskın olmayan el künt uç forseps tutun ve fare üzerindeki kavrama cilt kullanabilirsiniz. Dominant elin ile başlayın.
  2. Yavaşça deri yoluyla sütür itmek ve kesi diğer tarafında cilt kapmak için künt uçlu forseps kullanabilir. Yaklaşık 0.75 inç kalana kadar yoluyla sütür materyali çekin.
  3. Iğne gidelim ve iğne tutucu bir anda etrafında dikiş sarmak için künt uçlu forseps kullanabilir, daha sonra, iğne tutucu ile 0.75 inç kalan dikiş kapmak ve aracılığıyla dikiş çekme iğne ve iğne tutucu, böylece Onlar aslında vardı ki o kafa karşısındaki tarafında sonunda. Bu bir düğüm oluşturmalıdır.
  4. Bu adımı yineleyinÜç kez daha, başın yan alternatif iğne tutucu, her zaman biter.
  5. Sütür kesin ve adımları tekrarlayın 2.5.1-2.5.3 kesi kapanana kadar.

2.6) Post-operatif Bakım

  1. Yavaşça fare kulak çubukları kaldırmak ve ön kelepçe onun çenesini kaldırın.
  2. O uyanır ve kendi etrafında hareket edinceye kadar ısıtma yastığı fare tutun. Günlük fare izleyin ve tutmak ve bu, damat yeme ya da içme olarak değil ağrı belirtileri, göz dışarı. Gerekli görüldüğünde ek analjezik verin.

3. Açık Saha Testi

3.1) Kurma

  1. 50 cm yüksekliğinde duvarlarla, boyutları 50 cm x 50 cm boş bir kare, plastik arenada edinin (ama biraz daha büyük olabilir). Deney başlamadan önce,% 70 etil alkol ile arena temizleyin. Etil alkol tamamen arenaya fare yerleştirmeden önce kuru olduğundan emin olun.
  2. Üzerinde arena yerleştirinZemin ve aydınlatma gölgeler ve parlamayı en aza indirmek için ayarlandığından emin olmak için deneyin.
  3. Izleme yazılımı kullanıyorsanız, (fare net bir görünümü var yeterince uzakta tam kapsayacak şekilde bütün arenada, ama yeterince yakın), açık alan doğrudan havai açık alanda üzerinde yaklaşık 1,5 ft kamerayı yerleştirin.
  4. Kutu (30 cm x 30 cm yaklaşık bir alan) merkezinde bir bölge oluşturun. 16, bir dilimini ayarlamak yan paneldeki bölge 1 sekmesine tıklayın.
    1. Üst panelinde bir şekil anahat seçin ve merkez bölgenin çevresini özetlemektedir. Bölge eklemek seçin ve merkez bölgesi iç tıklayınız. Program istemleri kullanarak (bu prosedür için 'merkezi' olarak anılacaktır) bölge adlandırın. Davranışsal deney elle atılır ise, alanın alt bandı kullanılarak işaretlenmiş, 10 cm x 10 cm kareler ayrılmıştır emin olun.
  5. Yazılımı kurmak, böylece ayarlarının doğru ve fare kolayca visi olduğunuEkranda ble. Test arena (aydınlatma) ve fare rengi ile uyumlu olacak şekilde makine üzerinde algılama ayarları yaparak bu başarmak.
    NOT: ayarları doğru olduğunda, sistem herhangi bir gölge veya idrar / dışkı sadece fare izlemek ve olmamalıdır. Belirli yazılım ayarları arena aydınlatma ve fare rengine bağlıdır.

3.2) Acclimation ve Test

  1. Çevrelerine onları gelmesini amacıyla test öncesi davranışsal oda 1 saat içine deneysel fareler taşıyın. Iklimlendirme için kendi kafesine fareler bırakın.
  2. Teybe kameraya davranışsal görev açın ve fare duvara bakacak şekilde arena orta önüne doğru fareyi yerleştirin.
  3. 5 dakika boyunca zamanlayıcıyı ayarlayın ve uzak arenada adım. Mümkünse yanlışlıkla fare etkilemediği şekilde, odadan.
  4. 5 dk kadar olduğunda, fare kaldırmak ve onların kafese koyun.
  5. İyice bir sonraki fare geçmeden önce alanı temizlemek için% 70 etil alkol kullanın. Etil alkol tamamen kuruduktan emin olun.

3.3) Puanlama

  1. Dört pençeleri orta 30 cm x 30 cm içeride olduğunda alanın ortasında varlık olarak fareyi düşünün.
  2. Fare merkezinde geçirdiği süreyi ölçmek. Alternatif olarak, bu kez (örneğin Noldus ethovison gibi) izleme yazılımı kullanarak belirler.
    1. Bunu yapmak için, analiz sekmesine gidin ve analiz profilleri altındaki "hareketi" üzerine tıklayın. Şu anda belirlenen kategoriler silin ve sonra konum sekmesi altında "bölgesinde" seçeneğini seçin. Merkez dilimini seçin. Sonra, sonuçlarını görüntülemek için (sonuç sekmesi altında) "analiz çıkışını" seçeneğini seçin. Her deneme görünmelidir zaman listeleyen bir tablo hareketsiz geçirdi.
  3. Aksi takdirde, elle OFT puan. açık alan ope altındaki ana hatları 25, 10 cm x 10 cm'lik kareler olmalıdırn alan (as adım 3.1.3 belirtilen). Fare arena merkezi haline girişlerin sayısına ek olarak, merkezde geçirdiği süreyi ölçmek. 16
    NOT: Merkez 30 cm x 30 cm alan açık alanda merkezi olarak kabul edilir. Bir fare dört pençeleri 30 x 30 cm alanı içinde ise merkez bölgesini yaşayan olarak kabul edilir.

4. Zorla Swim Testi

NOT: davranışsal görevleri arasında beş gün en az bekleyin.

4.1) Kurma

  1. 2 L açık kova edinin ve 22 ° C su ile doldurun. Bir masanın üzerine kova yerleştirin ve aydınlatma gölgeler ve parlamayı en aza indirmek için ayarlandığından emin olmak için deneyin.
  2. Izleme yazılımı kullanıyorsanız, doğrudan havai kepçenin kamerayı yerleştirin.
  3. Yazılımı kurmak fare ekranda kolayca görülebilir şekilde.

4.2) Acclimation ve Test

  1. Davranışsal ro içine deneysel fareler TaşıTestten önce om 1 saat çevresi ile uyum sağlamaya. Iklimlendirme için kendi kafesine fareler bırakın.
  2. Teybe kamera davranışsal görev açın. Yavaşça su kepçenin ortasında fare. Fareyi düşürmemeye dikkat edin. Yavaş yavaş fare düşürmek, ön ayakları ilk suya değecek şekilde. Daldırarak kendi kafasını önlemek için özen gösterin.
  3. 6 dakika zamanlayıcı ayarlayın ve davranışsal alandan uzaklaşın.
  4. 6 dakika kadar olduğunda, kova fareyi kaldırmak ve onların kafesine geri fare yerleştirmeden önce aşırı su silin.

4.3) Puanlama

  1. Yüzme vs yüzen zaman ölçmek için, (bu varsayılan ayar olmalı) Noldus tarafından önerilen izleme yazılımı kullanıyorsanız,% 11 oranında hareketsizliği ayarlayın.
  2. Izleme sistemi kullanarak ölçmek için, analiz sekmesine gidin ve analiz profilleri altında hareket tıklayınız. Üzerine, şu anda ayarlanmış kategoriler silin ve sonra hareketlilik durumunu seçin(bireysel davranış altında) sol yan panel. % 11 hareketsizlik ayarlayın.
  3. Sonuçlar sekmesinin altında, parça görselleştirme seçin. Sonuçları görmek için (sonuç sekmesi altında) analiz çıkışını seçin. Her deneme görünmelidir zaman listeleyen bir tablo hareketsiz geçirdi.
  4. El puanlama, fare, fare hareketsiz geçirdiği zamanın yüzme veya tırmanma ve miktarı harcıyor zamanı ölçmek. Buna ek olarak, ilk kez hareketsiz ila gecikme ölçmek. Sonuçlar Bölüm Şekil 2'ye bakınız.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doğru stereotaktik enjeksiyon doğru koordinatları ayarı dayanır. virüs enjekte etmek için kullanılan iğnenin ucu bregma kesiştiği ve interaural hat (Şekil 1) doğrudan ayarlanması gerekir. Bu iğne doğru yerleştirilmiş olup olmadığını belirlemek için bir stereomikroskopta kullanmak yararlı olur. Mikroskop ile bakıldığında virüsü enjekte edildi, bu bregma kesiştiği interaural hat üzerinde doğrudan toprak olacaktır, böylece iğne konumlandırılmalıdır. Bu şırınga iğnesi açılış doğrudan kavşak üzerinde yer alm...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Başarılı stereotaktik enjeksiyonları üç faktöre dayanır: iğne (uç, canlı fare tutmak (bregma kesiştiği ve interaural hat üzerinde iğne ucu) koordinatları için doğru sıfır noktası ayarlama ve sıfır noktasına doğru derinlik ayarı Sadece) beyin dokusu dış dokunmadan. farelerin canlılığı önemlidir. Cerrahi hayatta kalma fare düzgün anestezi ve yeterli analjezik aldığı olduğundan emin yaparak destekli edilebilir. Ağrı ameliyat sonrası zayıf kazanımı önemli bir nedeni olduğu bilinmektedir. Fare tam ameliyat boyunca anestezi s...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma kısmen Amerikan Kalp Derneği Bilim İnsanı Geliştirme Hibesi ve Yingwei Mao'ya verilen NARSAD Genç Araştırmacı Ödülü tarafından desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Stereotaktik Aparat ürün 51725Stoelting co.51725
Özetin özeti stereotaksik pompa Hırsızlık a.ş.53311
Enjeksiyon Şırıngası, 65 RNHamilton7633-01
DMEMSigma-AldrichD5796
PEI Polibilimler A.Ş.23966
Makasİnce Cerrahi Aletler14084-08
Künt uçlu forsepsİnce Cerrahi Aletler11002-12
İğne tutucu ve nbsp;İnce Cerrahi Aletler12001-13
MatkapRam Ürünleri A.Ş. Microtorque kontrol kutusu, pedallı Tech2000 el aleti
Cam boncuk sterilizatörüInotech IS-400
Emilebilir sütürler UnifyM-K518r19Emilebilir, ters kesme
Pamuklu çubuklarVWR89031-270
Isıtma yastığıGaymarT-pump TP-500 PN11184-000
Yapay gözyaşıRugbyNDC 0536-6550-91
Tek kullanımlık şırıngaBD Şırınga309623
Bez
Eldiven ve nbsp;AnsellSenseitouch #7823
Avertin veya diğer anesteziklertarif alıntısına
Ketoprofen veya diğer analjeziklerveteriner hekime bakın 
İzleme yazılımıNoldusEthovision XT
İzleme KamerasıNoldusMedya Kaydedici
bakın

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schwenk, F., Baron, U., Rajewsky, K. A Cre-transgenic mouse strain for ubiquitous deletion of loxP-flanked gene segments including deletion in germ cells. Nucleic Acids Research. 23 (24), 5080-5081 (1995).
  2. Hirrlinger, J., et al. Split-cre complementation indicates coincident activity of different genes in vivo. PLoS One. 4 (1), 1-10 (2009).
  3. Fenno, L. E., et al. Targeting cells with single vectors using multiple-feature Boolean logic. Nature Protocols. 11 (7), 763-772 (2014).
  4. Paxinos, G., Franklin, K. The mouse brain in sterotaxic coordinates. , Academic Press. San Diego, CA. (2001).
  5. Gould, T. D., Dao, D. T., Kovacsics, C. E. Mood and anxiety related phenotypes in mice: the open field test. Humana Press. 42, 1-20 (2009).
  6. Denenberg, V. H. Open-field behavior in the rat: W.0hat does it mean. Annals of the New York Academy of Sciences. 159, 852-859 (1969).
  7. Bogdanova, O. V., Kanekar, S., D’Anci, K. E., Renshaw, P. F. Factors influencing behavior in the forced swim test. Physiology & Behavior. 118, 227-239 (2013).
  8. Porsolt, R. D., Anton, G., Blavet, N., Jalfre, M. Behavioral despair in rats: A new model sensitive to antidepressant treatments. European Journal of Pharmacology. 47 (4), 379-391 (1978).
  9. Hunsberger, J., Dunman, C. Animal models for depression-like and anxiety-like behavior. Nature Protocol Exchange. , (2007).
  10. Hommel, J. D., Sears, R. M., Georgescu, D., Simmons, D. L., DiLeone, R. J. Local gene knockdown in the brain using viral-mediated RNA interference. Nature Medicine. 9 (12), 1539-1544 (2003).
  11. Mao, Y., et al. Disrupted in schizophrenia 1 regulates neuronal progenitor proliferation via modulation of GSK3beta/beta-catenin signaling. Cell. 136 (6), 1017-1031 (2009).
  12. Clark, M. S., Sexton, T. J., McClain, M., Root, D., Kohen, R., Neumai, J. F. Overexpression of 5-HT1B receptor in dorsal raphe nucleus using herpes simplex virus gene transfer, increases anxiety behavior after inescapable stress. Journal of Neuroscience. 2 (11), 4550-4562 (2002).
  13. Tasan, R. O., et al. The central and basolateral amygdala are critical sites of neuropeptide Y/Y2 receptor-mediated regulation of anxiety and depression. Journal of Neuroscience. 30 (18), 6282-6290 (2010).
  14. Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Current Protoc Hum Gen. 12 (12.10), (2007).
  15. Carter, D. A. Anesthetizing mice. Methods Mol Biol. 18, 135-136 (1993).
  16. Alachkar, A., Jiang, D., Harrison, M., Zhou, Y., Chen, G., Mao, Y. An EJC factor RBM8a regulates anxiety behaviors. Current Molecular Medicine. 13 (6), 887-899 (2013).
  17. Bernal, J., Baldwin, M., Gleason, T., Kuhlman, S., Moore, G., Talcott, M. Guidelines for rodent survival surgery. Journal of Investigative Surgery. 22, 445-451 (2009).
  18. Wahlsten, D. Getting ready for testing. Mouse Behavioral Testing: How to use mice in behavioral neuroscience. Academic Press. , 133-141 (2011).
  19. Kheirbek, M. A., et al. Differential control of learning and anxiety along the dorso-ventral axis of the dentate gyrus. Neuron. 6 (77), 955-968 (2013).
  20. Snyder, J. S., Soumier, A., Brewer, M., Pickel, J., Cameron, H. A. Adult hippocampal neurogenesis buffers stress responses and depressive behaviors. Nature. 476 (7361), 458-461 (2011).
  21. Sik-Lee, J., et al. Induction of neuronal vascular endothelial growth factor expression by cAMP in the dentate gyrus of the hippocampus is required for antidepressant-like behaviors. Journal of Neuroscience. 29 (26), 8493-8505 (2009).
  22. Miller, D. G., Adam, M. A., Miller, A. D. Gene transfer by retrovirus vectors occurs only in cells that are actively replicating at the time of infection. Molecular and Cellular Biology. 10 (8), 4239-4242 (1990).
  23. Rubinson, D. A., et al. A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference. Nature Genetics. 33, 401-406 (2003).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Lentivir s EnjeksiyonuDavran sal TestlerA k Alan TestiZorunlu Y zme TestiHistolojik Do rulamaGen Mod lasyonuFare DavranBeyin HedeflemeCerrahi Haz rl k

İlgili makaleler