Yöntem makalesi

Adenovirüs Serotipinin 5-vektörlü Aşı Yaklaşımlar Geliştirme Antijen Kapsid-Ortaklık Stratejisi kullanmak

DOI:

10.3791/52655

⸱

6 Mayıs 2015

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Alabama at Birmingham, 2Center for AIDS Research, University of Alabama at Birmingham

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, bir proof-of-prensibi iki değerlikli adenovirüs tip 5 (Ad5) vektörü oluşturmak için bir protokol mevcut Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 Antijen Kapsid-Ortaklık stratejisi kullanılarak. Bu vektör nitel uygunluk arzettiği gösterilmiştir, yetenek dahil antijenlere Ad5-pozitif in vitro sera'yı ve antijenikliği yanı sıra immünojenitesini kaçmak için.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Adenovirüs serotip 5 (Ad5) yoğun aşı gelişimi için geleneksel bir transgen yöntemleri ile modifiye edilmiştir. Klinik çalışmalarda bu geleneksel modifiye Ad5 vektörlerin azaltılmış etkililiğin öncelikle nüfusun çoğunluğu arasında Ad5 önceden varolan bağışıklık (PEI) ile ilişkili olabilir. Ad5 PEI endişe çözerek Ad5-vektörlü aşı gelişmesini teşvik etmek, yenilikçi Antijen Kapsid-Kuruluş strateji istihdam edilmiştir. Bu stratejinin liyakat, biz ilk hekson mekik inşa Ad5-vektörlü plazmid HVR1-Kwas-HVR5-His önceden yapılmış mekik plazmid HVR5-His 6 / pH5S içine aşırı değişken bölgesi (HVR) Hexon 1. altklonlanmasıyla 6 / pH5S, His 6 etiketi HVR5 dahil vardı. HIV epitopu ELDKWAS ihtiva eden bu HVR1 DNA fragmanı elde edilmiştir. HVR1-Kwas-HVR5-His 6 / pH5S sonra doğrusallaştırılmış ve doğrusallaştırılmış omurga plasmid pAd5 / ΔH5 (GL) ile birlikte transforme edilmiş olanHomolog rekombinasyon için. PAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 hücrelerine transfekte edilmiştir Bu rekombine plazmid, viral vektör Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 oluşturmak için. Bu vektör, viral bir fiziksel titre (VP / ml) ile belirtilen niteliksel uygunluğu, enfeksiyonlu titre (IP / ml) ve karşılık gelen VP / IP oranına sahip doğrulandı. Hem HIV epitopu ve O'nun 6 etiket yüzey maruz Ad5 kapsitinde vardı ve kendi epitop özel antijenisiteyi korudu. Bir nötralizasyon deneyi in vitro Ad5-pozitif serumlar ile nötralize aşmak için bu iki değerli vektörü yeteneğini gösterdi. Fare aşılama HIV epitopu ve 6 His için güçlü bir humoral bağışıklık spesifik oluştuğunu gösterdi. Bu proof-of-prensibi çalışma Antijen Kapsid-Ortaklık stratejisi ile ilişkili protokol fizibil farklı kapsid proteinleri değiştirerek Ad5-vektörlü aşıların üretimi için kullanılabilir öne sürdü. Bu protokol, hatta f olabilirurther nadir serotip adenovirüs vektörlü aşıların üretimi için de uyarlanabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan adenovirüs (Ad), bir çift sarmallı DNA genomunu ihtiva eden bir ikosahedral nükleokapsid sahip bir orta büyüklükte olmayan zarflı bir virüstür. Reklam Yedi gruba bir sınıflandırmaya (G ile A), Adenoviridae familyasına aittir. Her grup farklı serotiplerin virüs içeriyor. Grup C adenovirüs, hangi serotip 5 (Ad5) en yoğun çalışmalar yapılmış ve en yaygın gen tedavisi ve aşı gibi vectored yaklaşımlar uygulanmaktadır.

Geleneksel transgen stratejisi geliştirildi ve gen-faiz ile virüs erken genlerin değiştirmesi ile karakterize Ad5 değişiklikler, uygulanan ve gen-faiz bir ev sahibi odaklı ifadesi olmuştur. Örnekler Simian İmmün Yetmezlik Virüsü 1 rev geni ile erken gen 3 (E3) değiştirerek pENV9 / Ad5hrΔE3 inşaat olan İnsan Bağışıklık Yetmezliği ve gag geni ile erken gen 1 (E1) değiştirerek AdCMVGag inşaatıVirüs (HIV) 2 ve lac Z geni 3 E1 değiştirerek Reklam lac Z yapımı. Ad5 geleneksel transgen stratejisinin geniş uygulama şu esasa bağlıdır: Ad5, virüs ve virüs yayılması üzerine uygulanabilir gen mühendisliği, yabancı gen ucun geniş konaklama ve Ad5 4,5 güvenliği için barındıran geniş. Ancak, bu stratejinin kullanımı ile Ad5-vektörlü klinik tedavilerin azalmış etkililiğin Ad5 çocuklar ve yetişkinler 4,6 çoğunluğu arasında çok yaygın olduğundan, öncelikle Ad5 PEI ile ilişkili olduğu eşlenmiş olan büyük bir darboğaz olmuştur.

Ad5 önemli darboğazı aşmak için, temel amacı Ad5 PEI engellemeyi alternatif bir strateji geliştirmektir. Bu tür nötralize edici antikorlar (yakalar) 8-10 ve CD8 + T hücresi tepkilerinin olarak doğuştan gelen bağışıklık 7, adaptif bağışıklık Ad5 karşı 10 birlikte gösterilmiştirAd5 yakalar Ad5 PEI 10,11 katkıları baskın rol oynamaya görünen ile Ad5 PEI ntribute. Dahası, Ad5 ana protein Hexon, lif ve penton tabanı dahil kapsid proteinleri bulunan hedef epitopları, yakalar. Hangi Of, hekson Ad5 yakalar 8,11-13 önemli hedefidir. Bu bulgulara dayanarak, yenilikçi Antijen Kapsid-Kuruluş strateji girmiştir. Bu yeni strateji, nötralizan antikorların ve verimli Ad5 vektör idareleri azalarak tanınması lider, proteinlerin-faiz Ad5 nötralize epitoplarını vardiya veya maskeleri Ad5 kapsid proteinleri üzerinde değiştirilmesini ya da birleştirilmesini vurgulamaktadır. Aynı zamanda ana doğrudan bağışıklık sistemine 4,14,15 kadar antijenler-faiz sunarak sağlam humoral bağışıklığı ve güçlü hücresel bağışıklığı ortaya çıkarmak yardımcı olabilir, çünkü bu strateji rekabetçi olması dikkat çekicidir. Bu strateji dayanarak, moleküler klonlama ve yeniden birleştirici Reklam viral vektör, bir kurtarma yapısal ayrılabilirdört ana adımlar (a) ya da polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ya da sentez ile gen-faiz fragmanının hazırlanması; (B) bir adenovirüs omurgasına gen bölgesinin çıkar fragmanını ve homolog kollar ihtiva eden bir mekik plazmidinin gen fragmanının ligasyonu; (C) homolog rekombinasyon ko-transforme doğrusallaştırılmış plasmid omurgası pAd5 / ΔH5 (GL) 16 gen-faiz fragmanını ihtiva eden plasmid Servisi; (D) doğrusallaştırılmıştır rekombinant adenoviral plazmid transfeksiyon antijenleri-faiz ile birleşmiş rekombinant Reklam vektör kurtarmak için.

Grubumuzun ve bazıları farklı bulaşıcı patojenlere karşı İlan vectored aşı geliştirilmesi için bu alternatif reklam birleşme stratejisi artırdık. Bir rekombinant Ad vektör üretilmesini bildirdi Ad-HVR1-LGS-His Ad5 hekson (hexon5) arasında HVR1 yereli bir His-etiketli, HIV-1 antijeni V3 içeren 6 -V3. Bu oluşturulan vektör str tetiklediV3 epitopa 4 özgü Ong humoral immün tepkisi. Ayrıca hexon5 2 HVR2 yereli olarak HIV-1 zara yakın ekto bölge (MPER) eklenerek Ad5 / HVR2-MPER-L15ΔE1 gelişimini bildirilmiştir. Buna ek olarak, Dr. Zhou'nun grup Reklam serotip 3 (Ad3) vectored aşılar, yani. Geliştirmek için bu Reklam kuruluş stratejisinin yararları kullandı, Reklam-3'te of HVR1 içine enterovirus 71 nötralize edici epitopu SP70 dahil ederek viral vektör R1SP70A3 nesil hekson (hexon3). R1SP70A3 Enterovirüs 71 meydan 15 karşı koruma yüksek oranda kurşun epitop SP70 özgü güçlü yakalar ve IFN-γ üretimini, üretilen.

Teknik başvuru amacıyla, bizim çalışmamız HVR1 içine HIV-1 antijeni içeren bir iki değerli Ad5 vektörü Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 nesil odaklanmak niteliksel Antijen Kapsid-Kuruluş stratejisi yararlandı birda hexon5 ve HVR5 içine His etiketi. oluşturulan viral vektör, ayrıca immünolojik değerlendirilmiştir. Antijen Kapsid-Ortaklık stratejisi farklı bulaşıcı hastalıklara karşı Ad5-vektörlü aşılama yaklaşımlarının geliştirilmesi yönünde yararlanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Onaylı protokol numarası 101109272 altında burada tarif edildiği gibi Birmingham Kurumsal Hayvan Kullanımı ve Bakımı Komitesi University of Alabama farelerin kullanımını onayladı.

1. Genetik Construction Modifiye Plazmid pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 Antijen Kapsid-Ortaklık Stratejisi

  1. Mekik plazmid inşaatı HVR1-Kwas-HVR5-His 6 / pH5S
    1. Hexon5 geninin Accl için sınırlama enzimi noktalan Agel ile sentezlenen DNA dizisi, HVR1-Kwas ihtiva eden bir plasmid sipariş.
    2. 37 ° C'de 3 saat enzimler Agel (6 adet) ve Accl (6 adet) sentezlenen parçası (HVR1-Kwas) 6 ug Digest. Elektroforez ile% 2 agaroz jeli içinde dijeste fragmanının gidermek ve üreticinin protokolüne uygun olarak bir DNA jel özütleme kiti ile fragmanı arındırmak.
    3. Ekin molar oranına göre 3 vektör: 1, T4 DNA ligazı ve ligaz b kullanımıUffer önceden yapılmış mekik plazmidinin 100 ng fragmanı (HVR1-Kwas) 12 ng bağlanması için HVR5-His 6 / pH5S 2 st için oda sıcaklığında bir 10 ul hacim içinde 17, Agel ve Accl siteleri ile.
    4. (1800 V) bir elektro-içinde elektro DH5α hücreleri 50 ul ligasyon ürünün 10 ul: 1 ul dönüşümü. Dönüştürülmüş DH5α hücrelerine SOC ortamı 950 ul ilave edin ve 300 rpm, 37 ° C'de 1 saat süreyle inkübe karışımı. Kanamisin içeren Luria-Bertani (LB) agar üzerinde 1 mi karışımının 100-200 ul yayıldı ve 37 ° C 'de O / N inkübe edin.
      1. ~ Fragmanı HVR1-Kwas hedefleme PCR ile 10 koloniler taranması için, ileri primer (TATGTGTGTCATGTATGCGT) karışımı (üreticinin protokolüne göre) bir PCR master karışım çözeltisi içine primer (GGAGGCCCACTTGTCCAGCTC) ve tek bir koloni DH5α tersine çevirir. PCR master mix çözümü ile sağlanan kılavuza bakarak bir termalcycler örnekleri çalıştırın.
      2. Bölüm 1.1.4.1 gösterildi klonlarda fragmanı HVR1-Kwas sıralamak için ileri primer (TATGTGTGTCATGTATGCGT) kullanın.
  2. Plazmid pAd5 / İnşaat H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6
    1. Özet 6 ug HVR1-Kwas-HVR5-His 6/37 ° C 'de 3 saat süre ile enzimleri EcoRI (6 adet) ve Pmel (6 adet) ile pH5S ve homolog rekombinasyon kolları ve çift modifiye hexon5 geni ihtiva eden fragmanı saflaştırılması, olarak adım 1.1.2 belirtti. Omurga plazmid SwaI ile pAd5 / ΔH5 (GL) 16 Linearize.
    2. Servisi plazmidden hedef fragmanın 100 ng ve (1800 V) bir elektro-homolog rekombinasyon için elektro BJ5183 hücreleri 50 ul halinde doğrusallaştırılmış pAd5 / ΔH5 (GL) omurgası 100 ng Co-dönüşümü. Dönüştürülmüş hücreler SOC ortamında 950 ul ilave edin ve 37 ° C, 300 rpm'de 1 saat süreyle inkübe karışımı. 1 ml karışımı 200 ul - 100 Yayılı37 ° C 'de O / N inkübasyon için kanamisin (son 50 ug / ml) ihtiva eden LB agar üzerine.
      1. Al ~ 3 ml 10 küçük koloniler, bir çalkalayıcı (250 rpm, 37 ° C) O / N inkübasyon için kanamisin (son 50 ug / ml) ihtiva eden sıvı LB. Kültürden plazmidler ekstrakte edin. Aşama 1.1.4.1 'de gösterildiği gibi, bu parçanın HVR1-Kwas hedefleyerek 10 koloniler taranması için PCR analizi kullanın.
      2. Omurga genomunun pIX fragmanının hedef PCR analizi, aynı koloniler taranması için, ileri primer (AGCTGTTGGATCTGCGCCAGCAGGTT) karışımı, (imalatçının protokolüne göre) bir PCR master karışım çözeltisi içine primer (CCAAACAGAGTCTGGTTTTTTATTTAT) ve tek bir koloni BJ5183 tersine çevirir. PCR master mix çözümü ile sağlanan kılavuza bakarak bir termalcycler örnekleri çalıştırın.
      3. PAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 PCR çift pozitif koloniler atayın.
    3. Plazmidden pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 100 ng TransformAşama 1.1.4 'de gösterildiği gibi hücre DH5α için.
      1. Aşama 1.1.4.1 'de gösterildiği gibi, parça HVR1-Kwas hedefleyerek ~ 10 koloniler taranması için PCR analizi kullanın.
      2. Aşama 1.2.2.2 'de gösterildiği gibi, omurga genomunun pIX fragmanının hedef aynı koloniler taranması için PCR analizi kullanın.
      3. PAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 Parçanın HVR1-Kwas sıralamak için ileri primer (TATGTGTGTCATGTATGCGT) kullanın.

Modifiye Ad5 Viral vektör Ad5 / 2. Hazırlık H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6

  1. Yüksek glukoz DMEM içine FBS (son% 10), 100X Esansiyel Olmayan Amino Asitler (nihai 0.1 mM), 200 mM L-glutamin (son 2 mM), penisilin / streptomisin solüsyonu (son% 1) ilave edilerek tam orta Teşkil . (% 85 nemli koşullar altında 37 ° C ve% 5 CO2), bir kültür inkübatörü içinde tam bir ortam içinde, insan embriyonik böbrek (HEK293) hücreler koruyun.
  2. Viral ziyaretinde Kurtarmactor Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6
    1. Tam ortam ve kültür O / N 5 ml ihtiva eden bir T-25 balon içinde Tohum HEK293 hücrelerine 3.0 x 10 6% 80 birleştiği bir tek tabaka elde etmek.
    2. 15 ug Linearize pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 3 saat süreyle 37 ° C'de sınırlama enzimi Pacl (15 birim) ile 100 ul hacim içinde.
      1. Özü doğrusallaştırılmış pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 fenol eşit hacimde (1 dakika süre ile 10,000 x g) iki kez reaksiyona santrifüjle: kloroform: bir davlumbaz izoamil alkol (: 24: 1 25 ° oranında) ve karışık bir çözelti (% 100 etanol içinde 300 ul sodyum asetat 10 ul) ve% 70 etanol içinde 700 | il ardışık santrifüjleme (10 dakika süre ile 10,000 x g). Her santrifüj adımında süpernatant atın.
    3. Saflaştırılmış plazmid damıtılmış su veya Tris-EDTA (TE) tampon maddesi 40 ul yeniden süspanse edin. Optik DE ölçülmesiyle plazmid DNA Miktarınınnsity 260 nm'de (OD).
    4. Üreticinin kılavuzuna göre, T-25 balonuna ticari lipozomal transfeksiyon reaktifi ile doğrusallaştırılmış plazmidin 3 ug transfekte. 6 saat kültürü inkübatör post-transfeksiyon ve daha sonraki kuluçka de tam orta transfeksiyon ortamı değiştirin. Bireysel viral plaklar oluşana kadar, her iki veya üç gün tam orta yerine transfekte hücreleri koruyun.
    5. Plaklar, tam bir sitopatik etki (CPE) geliştirmek zaman, steril bir muhafaza içinde bir şişe üzerinde kalan hücreler kazıma ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile hasat orta hücre lizatı. % 2 FBS içeren ortama ~ 1 ml hücre pelletini Askıda ve donma-çözülme dört kat hücreleri bölünürler. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 10,000 x g'de santrifüje tabi tutulmasımn ardından lizat kurtarılan virüs içeren süpernatan toplamak.
  3. Viral vektör Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 Büyük ölçekli yayılım
    1. Th yaymakT-25 balonuna tam lizat 1/3 ile enfekte steril bir muhafaza içinde HEK293 hücreleri ihtiva eden bir T-75 balon içinde E virüsü. Tam CPE kültürü inkübatör 2-3 gün içinde geliştirmeye olanak sağlar. Adım 2.2.5 belirtildiği gibi lizat süpernatant hasat.
    2. Virüs yayılma koşullarına bağlı olarak, T-75 balonuna tam lizat 1/2 ile enfekte steril bir muhafaza içinde 1-3, T-175 şişelerinde virüsü yayar. Tam CPE kültürü inkübatör 2-3 gün içinde geliştirmeye olanak sağlar. Adım 2.2.5 belirtildiği gibi lizat süpernatant hasat.
    3. Önceki T-175 şişesi (lar) tam lizat 1/2 ile enfekte steril bir muhafaza içinde bir düzine veya daha fazla T-175 şişelerinde virüsü yayar. Virüs çoğaltma koşulları ve ihtiyacı olan virüs miktarı göre bir şişe, kullanım miktarını belirler. Tam CPE kültürü inkübatör 2-3 gün içinde meydana geldiğinde adım 2.2.5 belirtildiği gibi lizat süpernatant hasat.
  4. Purifsezyum klorür Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 ication
    1. 5 mM HEPES, CsCl çözümleri iki yoğunlukları hazırlayın: 1.33 mi g / ve 1.45 g / ml CsCl ile temas gelmesini de önler.
    2. CsCl yük 4 mi steril bir ultra santrifüj tüpüne (1.33 g / ml) ve hafifçe tüpün dibine CsCl 4 ml (ug / ml 1.45) yükleyin. Yük yavaş yavaş steril kaput geçişlerini üstüne lizat süpernatant 4 ml.
    3. Kusurlu / yüksek virüs banttan olgun / alt virüs bandı ayırmak için 4 ° C'de 3 saat boyunca 110.000 xg'de tüp santrifüj. Bir 33 G iğne ile donanmış bir 3 ml'lik bir şırınga kullanılarak alt bant toplayın ve steril bir muhafaza içinde 4 ml hacim içinde 5 mM HEPES ile bant seyreltin.
    4. Aşama 2.4.2 de tarif edildiği gibi, iki CsCl çözeltilerinin yoğunlukları ve virüsün seyreltildi bant ile bir tüp yerleştirin. 4 ° C'de 110,000 x g, O / N tüpü santrifüjleyin. Aşama 2.4.3 tarif edildiği gibi viral bant toplayın.
    5. Bir dialys toplanan virüs çözümü enjekteSteril kaput içinde 33 G iğne ile silahlı 3 ml şırınga ile kaset olduğunu.
    6. 1x diyaliz tamponu 700 ml kaseti yerleştirin (1 L tarifi: 10x PBS 100 mi,% 100 gliserol, 100 ml damıtılmış su, 800 mi, 0.22 um'lik bir filtreden filtre tamponu) ve diyaliz tamponu yerine her 3 4 kez saat. Iğneli şırınga ile diyaliz virüs çözümü dışarı aspire.

Kurtarılan Viral Vector 3. Doğrulama

  1. Viral vektör Titrasyonları
    1. 10 ve 1: Virüs Fiziksel titresi için, virüs ve 1 diyaliz tamponu (arka plan kontrolü) hem seyreltilmiş virüs liziz tamponu içinde 20 (% 10 SDS Tris-EDTA), küçük tüplere ve 56 ° C 'de tüm tüpler inkübe 10 dk.
    2. Bir biophotometer açın ve OD 260 nm'de absorbans modunu ayarlayın. "Boş" altını tıklayarak arka plan sinyalini dengelemek için: seyreltilmiş diyaliz tamponu (10 1) kullanın. Biophotometer scr yazın "10 + 90"een ve seyreltilmiş virüsün sinyali (: 10 1) okuyun.
    3. Adım 3.1.2 yöntemi takip ederek, ancak bunun yerine biophotometer ekranında "5 + 95" tür: seyreltilmiş virüs sinyali (20 1) okuyun. 1.1x10 12 iki virüs okuma numaraları çarpın ve iki dilüsyonları iki ayrı titreleri göre VP / ml gibi bir birim olup ortalama titresi hesaplanır.
    4. Virüs bulaşıcı titresi (IP / ml) için, 10 gün sonrası enfeksiyon HEK293 hücreleri üzerinde enfeksiyon derinliğini belirlemek için Karber istatistiksel TCID 50 yöntemi 14 kullanın (dpi)
  2. Viral vektör üzerindeki antijenik maruz ekran Değerlendirilmesi
    1. Kat bir ELISA plaka viral vektör, ve standart bir ELISA yöntemi 14 adımların geri kalanı ile devam eder. Dahil antijenler 14 karşılık gelen saptanması için insan anti-gp41 (2F5) monoklonal antikoru (mAb) ve fare anti-His etiket mAb kullanın.
    2. Bir denatu viral vektör gidermekKırmızı protein jel elektroforezi (SDS-PAGE) ve standart bir Western Blot yöntemi 14 adımların geri kalanı ile devam eder. Dahil antijenler 14 karşılık gelen saptanması için insan anti-gp41 (2F5) monoklonal antikoru (mAb) ve fare anti-His etiket mAb kullanın.
  3. Ad5-Positve serumları atlamasına yeteneği vektörün in vitro değerlendirilmesi
    1. Kültür inkübatör (37 ° C ve% 5 CO2 altında 85% nemli koşullar) 'de tam bir ortam içinde HeLa hücrelerinin koruyun. FBS (son% 10), 200 mM L-glutamin (son 2 mM) ve minimum gerekli ortam (MEME) içerisine penisilin / streptomisin solüsyonu (son% 1) ilave edilerek tam orta oluşturuyor.
    2. 1x10 6 hücre 6 oyuklu plakalarda Tohum HeLa hücre / kuyu ve 2 saat süre ile kültürü inkübatör (37 ° C ve% 5 CO2 altında 85% nemli koşullar) 'de inkübe edin. (Viral vektör 5 IP / hücre ile Ad5-pozitif serumları (0.1 ul veya 0 ul) inkübeAd5, veya Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 1 saat boyunca kültürü inkübatöründe 6) hücreleri ihtiva eden 6 oyuklu plakalar üzerine karışımları ilave edilmeden önce.
    3. 24 saat (HPI) enfeksiyondan de, liziz tamponu içinde 0.5 ml bir kez PBS ile lize hücreleri ile yıkayın. 5 dakika boyunca 15.000 xg'de Santrifüj ve süpernatant toplamak. Virüsler, lusiferaz genini içerir, çünkü lusiferaz sinyali okumak için lusiferaz alt-tabaka 100 ul süpernatan 20 ul karıştırın.

Kurtarılan Viral Vector 4. İmmünolojik Değerlendirilmesi

  1. Ad5 ve Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6: İki aşı grupları hazırlayın.
    1. 2 haftalık bir arayla, bir homolog "ana-yükleme" bağışıklama rejiminde, 1x10 10 VP / fare olarak virüsleri ile kas içinden (n = 8 / grup) fareler enjekte edilir.
    2. 2 hafta her enjeksiyon sonrası anda, hayvan lancets (5 mm uç uzunluğu) ile birlikte kanama yanak tarafından anestezi olmadan farelerin kanama1.5 ml tüpler kan almak.
  2. Aşağı çevrilerek ve boruların kan karıştırın ve 30 dakika için oda sıcaklığında kan inkübe edilir. 5, 4 ° C'de minimum ve yeni bir 1.5 ml'lik tüplere transfer sera (üst katman) için 10,000 x g'de tüpler dönerler.
    1. 5, 4 ° C'de dakikada ve transfer sera için 10,000 x g'de yeni tüplere Spin yeni -80 ° C'de depolama için 1.5 ml tüpler işaretlenmiş.
  3. Sera dayalı ELISA ile antijen-spesifik humoral bağışıklık Değerlendirilmesi
    1. His peptit (1 mM stok) ve HIV-1 peptit (1 mM stok), ayrı ayrı 100 içinde seyreltilir.
    2. mM karbonat tamponu (pH 9.5), 10 uM peptit kaplama konsantrasyonu elde etmek için. Coat ayrı 4 ° C'de plakalar O / N oyuk başına 100 ul ilave edilmesi ve kuluçkalama ile seyreltildi peptidlerle ELISA plakaları.
    3. PBST içinde% 5 BSA içinde 1 saat süre ile 200 / çukur ul ve blok dört kez PBST ile plakalar, yıkama. 1 de plakalarına fareler sera uygulayın: 100 seyreltme engelleme buf içindefer, 100 ul / yuva. Oda sıcaklığında 2 saat inkübasyondan süreyle inkübe edin.
    4. Dört kez PBST ile plakalar, yıkama. / Oyuk 100 ul bloke edici tampon içinde, 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilerek plakalar bloke eder.
    5. 100 ul / oyuk bireysel His peptid ve HIV-1 peptit ile kaplanmış plakalar hem: (bloke tampon maddesi içinde 5.000 1) keçi anti-fare IgG-HRP uygulanır. Oda sıcaklığında 2 saat süreyle inkübe edin. PBST ile plakalar, yıkama.
    6. 30 dakika boyunca HRP alt-tabaka ile inkübe edildikten sonra OD450 nm plakaları okuyun.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Antijen kapsid-ekleme stratejisinde (Şekil 1A) iki değerlikli Ad5 viral vektörü Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 oluşturmak için kullanılmıştır. Öncelikle, mekik plazmid HVR1-Kwas-HVR5-His 6 / pH5S önceki inşa mekik plazmid HVR5-His 6 / pH5S 17 içine HVR1-Kwas fragmanı altklonlanmasıyla inşa edilmiştir. İkinci olarak, plazmid pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 14 "EcoRI-HVR1-Kwas-HVR5-His6-Pmel" bir kısmı ve SwaI-doğrusallaştırılmış pAd5 / ΔH5 a...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

aşıların geliştirilmesi için Ad5 değişiklik geleneksel transgen stratejisinin uygulama öncelikle Ad5 PEI 4,6 ile bağlantılı darboğaz için azalmıştır. Bu darboğaz kısmen bu strateji Ad5 nötralizan antikorların tarafından nötralize kaçmasına beri antijenlerin-faiz ile Ad5 ve nötralize epitoplarını değiştirerek, alternatif Antijen Kapsid-Ortaklık stratejisi (Şekil 1A) uygulamasıyla azaldı ve sağlam dokunulmazlık nesil kolaylaştırmak olabilir dahil antijenlerin-of-faiz. Bu çalışmada, modifiye edi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sağlık 5T32AI7493-20 ve 5R01AI089337-03 hibe Bu eser Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından kısmen desteklenmiştir. fon çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayınlama kararı, ya da yazının hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Hücre bölünmesi için 1x DPBSThermo ScientificSH30256.01& nbsp;
Diyaliz tamponu hazırlama için10x DPBSThermo ScientificSH30378.02
tamponu hazırlama içingliserolSIGMAG5516-1L
SDSBIO-RAD161-0301virüs lizis tamponu hazırlama için
Fetal Sığır Serumu (FBS)Thermo ScientificSH30910.03kültür ortamının bileşeni
100x Esansiyel Olmayan Amino Asitler ve nbsp;Thermo ScientificSH30238.01kültür ortamının bileşeni
200 mM L-glutaminCellgro25-005-CIkültür ortamının bileşeni
penisilin / streptomisin çözeltisi  Yüksekkültür ortamı DMEM'in Cellgro30-002-CI
HEK293 hücre kültürü içinThermo ScientificSH30081.01
HeLa hücre kültürü içinMinimum Temel Orta EagleSIGMAM5650
fenol: kloroform: izoamil alkol ve nbsp;Büyük boy DNA saflaştırmaSIGMAP3803-100ML
 Araştırma Ürünleri International Corp.Virüs saflaştırması içinC68050
CsCl çözeltisi hazırlama içinHEPESCellgro25-060-CI
Virüs kurtarma ve üst düzeyHEK293ATCC51-0036
Nötralizasyon testi içinHeLaATCCCCL-2
T-25 şişesi HücreThermo Scientific156367 
T-75 şişesiCORNING430641 
T-175 şişesiThermo Scientific159910 
Virüs saflaştırma içinUltrasantrifüjBECKMANNA
Virüs saflaştırmaUltrasantrifüj tüpBECKMAN
344059 Virüs diyalizi içinThermo Scientific66380
ELISA plakasıELISA
insan anti-gp41 (2F5) mAbİmmünolojik testler içinNIH AIDS Reaktif Programı1475
fare anti-His etiketi mAbGenScriptA00186immünolojik testler için
SOC ortamıCORNING46-003-CR
PCR Hayvan neşteri için PCR ana karışım solüsyonuQIAGEN
201445 (5 mm'de nokta uzunluğu)FarelerinMEDIpoint 
Virüs fiziksel titre titrasyonu içinbiyofotometreEppendorf
diyaliz glikozlu bileşenisezyum klorür için için kültürü için Hücre kültürü için Hücre kültürü için diyaliz kaseti için için Thermo Scientific 442404 kanaması için

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cheng, S. M., et al. Coexpression of the simian immunodeficiency virus Env and Rev proteins by a recombinant human adenovirus host range mutant. Journal of virology. 66, 6721-6727 (1992).
  2. Matthews, Q. L., et al. HIV antigen incorporation within adenovirus hexon hypervariable 2 for a novel HIV vaccine approach. PloS one. 5, e11815(2010).
  3. DeMatteo, R. P., et al. Long-lasting adenovirus transgene expression in mice through neonatal intrathymic tolerance induction without the use of immunosuppression. Journal of virology. 71, 5330-5335 (1997).
  4. Gu, L., et al. A recombinant adenovirus-based vector elicits a specific humoral immune response against the V3 loop of HIV-1 gp120 in mice through the 'Antigen Capsid-Incorporation' strategy. Virology journal. 11, 112(2014).
  5. Matthews, Q. L., Krendelchtchikov, A. L. G., Li, Z. C. Viral Vectors for Vaccine Development. INTECH. , (2013).
  6. Tang, D. C., Zhang, J., Toro, H., Shi, Z., Van Kampen, K. R. Adenovirus as a carrier for the development of influenza virus-free avian influenza vaccines. Expert review of vaccines. 8, 469-481 (2009).
  7. Flatt, J. W., Kim, R., Smith, J. G., Nemerow, G. R., Stewart, P. L. An intrinsically disordered region of the adenovirus capsid is implicated in neutralization by human alpha defensin 5. PloS one. 8, e61571(2013).
  8. Bradley, R. R., Lynch, D. M., Iampietro, M. J., Borducchi, E. N., Barouch, D. H. Adenovirus serotype 5 neutralizing antibodies target both hexon and fiber following vaccination and natural infection. Journal of virology. 86, 625-629 (2012).
  9. Zaiss, A. K., Machado, H. B., Herschman, H. R. The influence of innate and pre-existing immunity on adenovirus therapy. Journal of cellular biochemistry. 108, 778-790 (2009).
  10. Sumida, S. M., et al. Neutralizing antibodies and CD8+ T lymphocytes both contribute to immunity to adenovirus serotype 5 vaccine vectors. Journal of virology. 78, 2666-2673 (2004).
  11. Sumida, S. M., et al. Neutralizing antibodies to adenovirus serotype 5 vaccine vectors are directed primarily against the adenovirus hexon protein. Journal of immunology. 174, 7179-7185 (2005).
  12. Bradley, R. R., et al. Adenovirus serotype 5-specific neutralizing antibodies target multiple hexon hypervariable regions. Journal of virology. 86, 1267-1272 (2012).
  13. Gahery-Segard, H., et al. Immune response to recombinant capsid proteins of adenovirus in humans: antifiber and anti-penton base antibodies have a synergistic effect on neutralizing activity. Journal of virology. 72, 2388-2397 (1998).
  14. Gu, L., et al. Using multivalent adenoviral vectors for HIV vaccination. PloS one. 8, e60347(2013).
  15. Tian, X., et al. Protection against enterovirus 71 with neutralizing epitope incorporation within adenovirus type 3 hexon. PloS one. 7, e41381(2012).
  16. Wu, H., et al. Construction and characterization of adenovirus serotype 5 packaged by serotype 3 hexon. Journal of virology. 76, 12775-12782 (2002).
  17. Wu, H., et al. Identification of sites in adenovirus hexon for foreign peptide incorporation. Journal of virology. 79, 3382-3390 (2005).
  18. Qiu, H., et al. Serotype-specific neutralizing antibody epitopes of human adenovirus type 3 (HAdV-3) and HAdV-7 reside in multiple hexon hypervariable regions. Journal of. 86, 7964-7975 (2012).
  19. Parker, C. E., et al. Fine definition of the epitope on the gp41 glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1 for the neutralizing monoclonal antibody 2F5. Journal of virology. 75, 10906-10911 (2001).
  20. Farrow, A. L., et al. Immunization with Hexon Modified Adenoviral Vectors Integrated with gp83 Epitope Provides Protection against Trypanosoma cruzi Infection. PLoS neglected tropical diseases. 8, e3089(2014).
  21. Krause, A., et al. Epitopes expressed in different adenovirus capsid proteins induce different levels of epitope-specific immunity. Journal of virology. 80, 5523-5530 (2006).
  22. Omori, N., et al. Modification of a fiber protein in an adenovirus vector improves in vitro gene transfer efficiency to the mouse microglial cell line. Neuroscience letters. 324, 145-148 (2002).
  23. Dmitriev, I. P., Kashentseva, E. A., Curiel, D. T. Engineering of adenovirus vectors containing heterologous peptide sequences in the C terminus of capsid protein IX. Journal of virology. 76, 6893-6899 (2002).
  24. Xue, C., et al. Construction and characterization of a recombinant human adenovirus type 3 vector containing two foreign neutralizing epitopes in hexon. Virus research. 183, 67-74 (2014).
  25. Tian, X., et al. Construction and characterization of human adenovirus serotype 3 packaged by serotype 7 hexon. Virus research. 160, 214-220 (2011).
  26. Kim, J. W., et al. An adenovirus vector incorporating carbohydrate binding domains utilizes glycans for gene transfer. PloS one. 8, e55533(2013).
  27. Vasconcelos, J. R., et al. Pathogen-induced proapoptotic phenotype and high CD95 (Fas) expression accompany a suboptimal CD8+ T-cell response: reversal by adenoviral vaccine. PLoS pathogens. 8, e1002699(2012).
  28. Matthews, Q. L., et al. Genetic incorporation of a herpes simplex virus type 1 thymidine kinase and firefly luciferase fusion into the adenovirus protein IX for functional display on the virion. Molecular imaging. 5, 510-519 (2006).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Viral Vector ConstructionPlasmid Shuttle SystemHomologous RecombinationViral Titer AnalysisNeutralization AssayHIV Epitope DisplayHis6 Tag IncorporationCesium Chloride Purification

İlgili makaleler