Yöntem makalesi

Kültürleme İnsan Femur Doku Eksplantlarından yöntemleri Metastatik Niche Meme Kanseri Hücre Kolonizasyon Eğitim için

12K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/52656

⸱

15 Mart 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Stanford University School of Medicine, 2Department of Orthopaedic Surgery, Stanford University School of Medicine

Bu makalede

Özet

Protokoller, insan kemik doku eksplantı model sisteminde göğüs kanseri hücre hareketi, çoğalması ve kolonizasyonu çalışmak için tarif edilmiştir.

Özet

Kemik meme kanseri metastazı en sık sitedir. Yaygın mikroçevresinin etkiler kanser hücresi davranışı kabul edilmesine rağmen, çok az insan kemik dokusunun doğal mikroçevresinin içinde meme kanseri hücre özellikleri ve davranışları hakkında bilinmektedir. Biz, izlemek ölçmek ve mikro-içinde insan meme kanseri hücrelerini modüle yaklaşımlar geliştirdik Total kalça protezi ameliyatları takip atılır femur başları izole kültür, insan kemik doku parçaları. Meme kanseri hücrelerini lusiferaz için tasarlanmış ve yeşil floresan protein (EGFP) ifade gelişmiş kullanarak, tekrarlanabilir sonra meme hücreleri floresan mikroskopi kullanılarak kemik parçaları içinde biyolüminesans görüntüleme kullanılarak göç ve çoğalması desenleri (BLI), parça hücre etkileşimleri ölçmek ve değerlendirmek mümkün Akış sitometrri ile kolonizasyon. Bu modelin temel avantajları şunlardır: 1) bir yerli, mimari sağlam doku microeilgili insan hücre tiplerini içerir ve hızlı nicel ve nitel izleme ve meme ve kemik hücre özellikleri, davranışları ve etkileşimleri pertürbasyon kolaylaştırır mikroçevresinin, 2) doğrudan erişim bütünlüklü. Birincil sınırlama, şu anda, kısa vadeli kültürüne çalışmanın pencere sınırlandırmaktadır doku parçalarının, sonlu canlılık olduğunu. Model sisteminin uygulamaları metastatik niş içinde meme kanseri ve diğer kemik arayan maligniteler temel biyoloji okuyan ve etkili bir kemik dokularında meme kanseri hücrelerini hedef tedavi stratejilerinin geliştirilmesi bulunmaktadır.

Giriş

tümör mikro yaygın meme kanseri ilerlemesi ve metastatik sırasında kanser hücresi davranış kritik belirleyicisi olarak kabul edilmektedir 1-3 yayıldı. Burada sunulan yöntemin amacı, insan kemik dokusundan, göğüs kanseri metastazı 4-6 en sık site mikro-içinde, meme kanseri hücrelerinin çalışma kolaylaştırmaktır. Kemik metastatik ilerlemesi 10,11 sorumlu hücreler ve salgılanan faktörler barındıran her ikisi de mineralize ve iliği bölümlerinin 7-9 oluşur. Yaygın in vivo fare modellerinde kullanılan rağmen metastatik sürecinin 12-15 sistemik çalışmalarını kolaylaştırmak, iskelet içinde hücre etkileşimleri gözlem ve doğrudan pertürbasyon için kolayca erişilebilir değildir. Eğitim ve fare kemik dokuları ve fare kemik iliği hücreleri kültür Model sistemleri daha iyi erişim sağlamak ve meme kanseri hücre m altında yatan birçok karışma ilgili anlayışlar ve mekanizmalar vermiştirMurin iskelet 16-22 etastasis. Ancak, çalışmalar kemik dokusu 23,24 için osteotropism ve türe özgü desenleri olabileceğini düşündürmektedir. Bu modeller, kemik muhtemel belirleyiciler hepsi doğal türe özgü kemik dokusu özelliklerindeki farklılıklardan, bağışıklık-eksikli fareler 11 değiştirilmiş kemik iliği popülasyonlardan elde edilen farklar, ve / veya deneylerinde kullanılan fareler nispeten genç yaş, yansıtabilir mikroçevresinin.

In vitro olarak, tipik haliyle, kemik iliği türevli osteoblast veya tek katmanlar olarak kültür stromal hücreler olarak ya da genetik mühendisliği 3 boyutlu model sistemlerinde 25-35 içinde belirli kemik hücre tipleri üzerinde odaklanmıştır insan kemik eş kültürlerinde meme kanseri hücreleri incelemek için yaklaşımlar. 2-boyutlu hücre kültürü modelleri, in vitro dayanak oluşan kanser araştırmaları için yaklaşımlar var olsa da, uzun hücre davranışı temelde m değiştirilmiş olduğu kabul edilmiştirkültür sistemleri 18,36,37 onolayer. Bu matris ve kolajen gibi doğal malzemelerden oluşan iskele tabanlı modelleri dahil olmak üzere 3-boyutlu bir oturma dokuların karmaşıklığı taklit eden, işlenmiş mikroçevrelerde gelişmesine yol açmıştır ya da sentetik polimerler, doku gibi mikroçevrelerde oluşturmak için özel hücre tipleri ile tohumlandı 36-41. Engineered yaklaşımlar da kontrol ve mikroçevresinin 18,19,41-43 hormonal ortam çalışma biyoreaktör platformlarının kullanımı dahil ettik. Biomimetik modelleri ve biyoreaktörler kontrollü bir ortamda kompleks doku çevresinde birçok unsuru sağlar ve başarılı kemik 18,19,35,42,43 meme kanseri metastazı çalışma önceden uygulanmış olsa da, işlenmiş model sistemler, genel olarak yapılmasına olanak vermemektedir doğal kemik ortamında mevcut hücre tipleri ve hücre dışı matriks bileşenlerinin tam spektrum.

Yakın zamana kadar, göğüs kanseriHücreler, insan kemik dokularının yerli, bozulmamış, 3-boyutlu mikroçevresinin içinde çalışılmamıştır. Biz son zamanlarda (THR) ameliyatı 44 örneklerinde total kalça protezi izole insan kemik doku parçaları kullanarak bir ko-kültür modelinin gelişmesini bildirdi. Bu örnekler hem kısa vadeli kültüründe mikro-metastazı altında yatan mekanizmaları incelemek için gerekli mineralizasyon ve kemik iliği bölmeleri liman. Önceki çalışmada, kemik parçaları 44 ile (MDA-MB-231-Fluc) ko-kültür lusiferaz sentezleyen meme kanseri hücrelerinin çoğalmasını izlemek için biyoışıldama görüntüleme (BLI) kullanılarak kanıtını prensip oluşturmuştur. Burada insan kemik dokusu eksplantlarındaki yerli mikroçevresinin kapsamında meme kanseri hücre çoğalmasını, kolonizasyonu ve göç çalışmak için deneysel protokolleri ayrıntılı bulundular.

İlk olarak meme ölçmek için kemik parçaları bitişik eş-kültürleme göğüs kanseri hücreleri için bir protokol mevcutBLI kullanarak hücre çoğalması. Bu bölümde, meme hücresi süspansiyonları, kemik mumu parçaları ile hareketsiz hale kemik parçaları, bitişik 6 oyuklu plakalar içinde hücre noktalar olarak tohumlanır. Kontrol kuyuları, kemik mumu, ama hiçbir kemik fragmanı içerirler. Hücre noktalar eklemek sonra, orta eklenmiş ve plaka BLI ile ölçülür biyolüminesens sinyal yoğunluğu (hücre sayısı ile ilişkili) sonra 24 saat için kültüre edilir. Bir sonraki adımda, kolonizasyonun ve çoğalmanın çalışma kemik parçalarının doğrudan ekilmiş ko-kültür göğüs kanseri hücreleri için yöntemler sunar. İşte meme hücre süspansiyonları kolonizasyonu ve hücre sayısını izlemek için zamanla BL ve floresan mikroskobu ile kültüründe izlenir kemik doku parçaları, doğrudan pipetlenir. Bu yöntemde, kemik iliği bölme akış sitometrisi ile kolonize göğüs kanseri hücrelerinin analizi için her zaman noktasında kemik parçaları temizlendi, ya da ilik canlılığı deneyleri edilebilir.

Buna ek olarak, elimizdeki deMeme kanseri hücre göçü ölçmek için kâtip, iki farklı yaklaşım. İlk yöntemde adım kemik dokusu kültür yüzer doğru göç ölçülmesi için özetlenmiştir. Transwell iç üst yüzeyleri bir 8 um gözenek büyüklüğüne sahip membranlar eklemek üzerine (Şekil 1A 'da gösterildiği gibi), bu protokolde, göğüs kanseri hücreleri tohumlanır. Ekler daha sonra kemik dokusu süpernatan ya da kontrol ortamı içeren oyuklara sahip bir alıcı plaka içerisine yerleştirilmiştir. 20 saatlik bir bekletme sürecinden boyunca, meme kanseri hücrelerinin az sayıda aşağı bunlar BLI tespiti için eklemek alt doku kültür kuyu içine sokma zarları içinden yer değiştirmektedir. İkinci geçiş yöntemde meme kanseri hücreleri Transwell uç zarların alt dış yüzeyleri üzerine ekilir. Kemik dokusu parçaları uç bardak içine yerleştirilir ve göğüs kanseri hücreleri (Şekil 1 B 'de gösterildiği gibi), kemik parçaları kolonize zarlanndan taşınmalarısonra BLI kullanarak görüntülü.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Femur başları Stanford Üniversitesi Tıp Okulu'nda Ortopedi Bölümü'nde seçmeli THR ameliyatı geçiren hastaların toplanmıştır. Tüm dokular Stanford Üniversitesi Araştırma Uyum Ofisi düzenlemelerine uygun olarak de tanımlanan örneklerin olarak toplanmıştır.

1. Bir Meme Kanseri Hücre Hattı (ler) seçilmesi

  1. Elde edilir ya da bir lusiferaz-GFP raportör yapısı ile, istenen göğüs kanseri hücre çizgisi (ler) transfekte. Aşağıdaki deneyler, uyku güzellik transpozon plazmid pKT2 / LuBiG ile transfeksiyon ile MDA-MB-231 ve MCF-7 göğüs kanseri hücre çizgileri ateşböceği lusiferaz dengeli bir şekilde ifadesi için tasarlanmış (Fluc) ve gelişmiş yeşil floresan protein (EGFP) kullanılarak gerçekleştirilmiştir transposaz plazmit pK / hUbiC-SB11 45,46.
    Not: Transfekte edilmiş hücre çizgileri MDA-MB-231-Fluc-EGFP ve MCF-7-Fluc EGFP olarak adlandırılır.

2. Ayırma Doku FFemoral Heads ragments

  1. THR ameliyatları sonrası, fizyolojik tuzlu su ile dolu bir steril kap içinde atılır femur başı toplar. Laboratuvara numune aktarın ve cerrahi 1-3 saat içinde işleme. Not: işlemede bir gecikme varsa, 4 ° C'de örneği yerleştirin.
  2. Deneyin her türü için aşağıda belirtilen şekilde steril eldiven, cerrahi rongeur, forseps, beher% 70 izopropanol ile aletleri, ve doku kültürü gemiler durulama: laminer akış doku kültürü kaputu emici mat aşağıdaki öğeleri yerleştirerek bir çalışma alanı hazırlayın .
  3. Bir steril cerrahi eldiven giyen, bir yandan yuvarlak femur başını tutun femur maruz üst şaft istenen boyutta (~ 2-5 mm) trabeküler kemik parçaları ayıklamak için, diğer elinde rongeur kullanmak için. Kültür kabı içine kemik parçaları transfer (örneğin, 6-, 12, ya da doku kültürü plakası, veya geçiş bölmesi 24-çukurlu), proliferasyon türüne bağlı olarak, sütunonization veya göç deneyi, adım 3, 4 veya 5'te tarif edildiği gibi.
    NOT: Her özel proliferasyon, kolonizasyon veya göç deneyi için ilk adımları tamamlandıktan sonra yukarıda tarif edildiği gibi kemik dokusu parçaları hasat edilmesi. Şekil 2'de gösterildiği gibi, parçalar, boyut aralığında değişecektir. Fragmanları önce ya da standart amacıyla deneyler sonra tartılır edilebilir.

Kemik Fragments bitişiğinde 3. Eş-kültürleme Meme Kanseri Hücreleri BLI kullanma Meme Hücre Proliferasyonunu Tedbir

  1. Önceki deneyden 2 x 10 5 meme kanseri hücre / 50 ul ihtiva eden bir süspansiyon hazırlamak ve kültürde kemik parçaları hareketsiz tutmak için kemik mumu fişleri hazırlayın. 3 parçaya P200 mikropipet ucu kesin ve kemik mumu küçük (~ 35 mg) adet kesmek için bir "çerez kesici" bir şekilde büyük parçanın dar ucunu kullanın. Petri kabı içine kemik balmumu fişlerini çıkarmak için küçük parçanın geniş ucunu kullanındepolama için.
  2. Her kuyunun 00:00 pozisyonunda kemik balmumu bir parça koyun ve yavaşça bir steril eldivenli işaret parmağı ile bastırın.
  3. Pipet, 6 gözlü bir plakanın her bir kuyucuğun merkezinde, DMEM,% 10 FBS + Pen-strep 1 x 10 5 göğüs kanseri hücreleri ihtiva eden bir hücre süspansiyonu 50 ul. (Alternatif olarak, arzu edildiği takdirde dağınık bir biçimde tohum hücreleri.) Hücre eki teşvik etmek için 45 dakika boyunca 37 ° C'de doku kültürü kuluçka makinesi içinde plaka koyun.
  4. Her deney kuyu için kemik mumu 1 parça üzerine 1 kemik parçasını yerleştirin ve sabitlemek için ronjur ile hafif basınç uygulayın. Alt üç kuyu sadece kontroller olarak kemik mumu ihtiva ederken, belirli bir THR örnekten şekilde 3 kemik parçaları ilk üç kuyular yerleştirilir üç nüsha olarak deneyleri.
  5. 5 ml'lik bir pipet kullanılarak, yumuşak ve yavaş meme hücreleri veya kemik parçaları yerinden ayrılmasını önlemek üzere, her bir yan DMEM% 10 FBS, 5 ml sağlar. 37 plaka koyun76, 20-24 saat süre ile C doku kültürü kuluçka makinesine kondu.
  6. Biyoışıldama görüntüleme gerçekleştirmek için (BLI) inkübatör plaka çıkarın ve her bir oyuğa (300 ug / ml'lik bir konsantrasyon elde etmek için) lusiferin substratı ilave edin. Görüntü aşağıdaki parametreleri kullanarak bir IVIS Görüntüleme Platformu'nda hemen plaka: 1 f-stop, küçük binning, 1 sn pozlama süresi, seviye D sinyal her yoğunluğunu sıra ortalama parlaklık (fotonlar / saniye / kare santimetre / Tedbir steradyan).
  7. Tüm deney ve kontrol kuyuları için ortalama parlaklık ölçmek için İlgi (ROI) Bölgeleri tanımlamak için görüntüleme yazılımı kullanın. Bir Excel sayfası İhracat ortalama parlaklık değerleri istatistik gerçekleştirmek ve grafikler oluşturmak için.

Kemik Fragments üstüne Doğrudan Tohumlu 4. Eş-kültürleme Meme Kanseri Hücreleri Kolonizasyon ve Hücre sayısı Eğitim için

  1. 24-çukurlu doku kültürü plakasının boş kuyu doğrudan kemik parçaları yerleştirmek (1 fragmanı / çukur) için forseps kullanır.
  2. Ölmekdoğrudan her bir kemik parçasından en 1 x 03-06 Ekim meme kanseri hücreleri içeren DMEM% 10 FBS, 50 ul hücre süspansiyonu damlacık ette. Hücre eki teşvik etmek için 45 dakika boyunca 37 ° C'de doku kültürü kuluçka makinesi içinde plaka koyun. Yavaşça parçası tamamen ortam içine, her bir sıra bu yan içine 1-2 mi DMEM,% 10 FBS ekleyin. 20-24 saat süreyle 37 ° C'de doku kültürü kuluçka makinesi içinde plaka inkübe edin.
  3. İnkübasyondan sonra, her bir çukura 1 ml DMEM% 10 FBS ihtiva eden bir taze 24-yuvalı plaka her bir kemik dokusu fragmanı aktarmak için forseps kullanır. BLI gerçekleştirmek için, adımları 3,6-3,7 yukarıdaki izleyin. Buna ek olarak, parçalar, bir floresans mikroskobu kullanılarak izlenebilir ya da aşama 6'da tarif edildiği gibi, meme kanseri hücresi sayısı ve özelliklerinin analizi için iliği popülasyonu elde etmek için yıkanır olabilir.
  4. BL, pipet floresan bifosfonat etiketleme çözümü 5 ul (ön aşağıdaki floresan mikroskobu ile kalitatif değerlendirme için sağlam parçaları hazırlamak içinKemik parçalarının mineralize spikülleri etiketlemek için, her bir oyuğa) kullanılarak üreticinin talimatlarına göre düşüktü. Bir 24 saat boyunca doku kültür inkübatörü içinde plaka inkübe edin.
  5. Floresan bifosfonat etiketleme çözeltisi içinde kültür 24 saat sonra, görüntü GFP (485 nm) ve bisfosfonat etiketin (680 nm) için yapılandırılmış bir floresan mikroskobu kullanılarak fenol kırmızısı içermeyen ortam ve görünümü içeren bir doku kültür plakalarına fragmanları aktarmak için forseps kullanır.

5. Kemik Doku Fragments ve kültürlü Kemik Parçası süpematantlan için Meme Kanseri Hücreleri Göç Ölçme

  1. Kemik doku kültürü süpernatant doğru göç.
    Not: üç kopya halinde, belirli bir THR örnekten şekilde 3 fragmanları deneyleri gerçekleştirmek 3 süpernatantlar oluşturmak için kullanılır. Her deney için, göç kemik süpernatanlan vs kontrol ortamını yalnızca içeren üç kuyu içeren üç kuyu boyunca karşılaştırılır.
    1. Kemik tis oluşturunoyuk başına 2.2 ml DMEM% 10 FBS ihtiva eden bir 12 gözlü bir levhanın gözleri içine kemik parçalarının yerleştirilmesi ile süpernatantlar dava. 24 saat boyunca 37 ° C'de doku kültürü kuluçka makinesi içinde kültürü. 24 saat sonra ortam çekin ve 2.2 ml taze DMEM,% 10 FBS ile değiştirin. DMEM-10% FBS aynı şekilde içeren sağlıgı kontrol kuyuları.
      NOT: düşük operasyon sonucu meydana gelen doku travmasının yanıt olarak salgılanan faktörler kaldırmak için 24 saat sonra değiştirildi. Kemik dokusu üzerinde yüzer durumda kısımlar oluşturulacak için sadece meme kanseri hücre göçü FBS katkıları için kontrol edilmesi için dahil edilir FBS içeren ortam içeren ortam, kuyu FBS ihtiva eden.
    2. 48 saat sonra, bir alıcı plakanın oyukları içinde her bir süpernatan / kontrol ortamı ve pipet 0.9 ml toplar. ekler sonra bu kuyulara alınacaktır. Uçlar, tohumlama sırasında doku kültürü kuluçka makinesi içinde alıcı plaka inkübe edin. Not: Kalan supernatant (~ buharlaştırmadan sonra 1 mi) secretome fiili analizi için toplanabilirrs eğer 44 istenilen.
    3. Transwell tohum için, standart bir boş 24 oyuklu doku kültürü plakası içine yerleştirin. Şekil 1A'da gösterildiği gibi, her bir ek üst, iç zar yüzeyi üzerine DMEM% 10 FBS içinde, 1 x 10 5 meme kanseri hücreleri ihtiva eden Pipet 350 ul hücre süspansiyonu. Eki teşvik etmek için 45 dakika süreyle 37 ° C'de doku kültürü kuluçka makinesi içinde tohumlanır ekler ihtiva eden 24 oyuklu plaka koyun.
    4. Hücreler ekler taşıyabilir sonra, imalatçının talimatlarına göre alıcı plaka ekler aktarmak için forseps kullanır. Açı eklemek zarında ve iyi yüzer madde alıcı arasındaki kabarcık oluşumunu önlemek için de alıcı içine yerleştirerek her ekleme. 37 ° C'lik bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde 20 saat ekler ile alıcı plaka inkübe edin.
      NOT: insert membran ve iyi supernatan alıcı arasındaki kabarcıklar için alıcı plakasının alt tarafını kontrol edint. Kabarcıklar görülebilir iseniz, belirli ekler kaldırmak ve hiçbir kabarcıklar mevcut olana kadar iyice alıcı içine tekrar yerleştirin.
    5. 20 saat kullanım forseps sonra alıcı plaka ekler kaldırmak için. Adımda prosedürler kullanılarak 3.6-3.7 görüntü içine göç ve alıcı plaka kuyuların dibine bağlı olan hücreleri BLI gerçekleştirmek.
  2. Kemik doku parçaları doğru göç.
    Not: üç kopya halinde, belirli bir THR örnekten şekilde 3 fragmanları deneyleri gerçekleştirmek 3 ayrı uçlar yerleştirilir ve 3 cam tanesi, kontroller olarak, 3 ayrı uçlar yerleştirilir.
    1. Her kuyuya 0.9 ml DMEM-10% FBS pipetleme alıcı plaka hazırlayın. Ekler hazırlanırken doku kültürü kuvöz içine yerleştirin.
    2. Ekler tohum, bir kapağı olan plastik bir tüp mikrofuge'ye kutusunun yüzeyinde onları ters çevirin. 1 x 10 5 göğüs kanseri hücreleri d içeren DMEM% 10 FBS, 50 ul hücre süspansiyonu damlacık Pipetirectly (ters ekler üzerinde yukarı baktığından) Her ekleme zarının dış, alt yüzeye. Kapaklı mikrofuge'ye tüp kutusu açık kırık Kapak ve hücre eki teşvik etmek 45 dakika için 37 ° C doku inkübatör aktarın.
    3. Doku kültürü kaputu mikrofuge'ye tüp kutusunu aktarın ve sağ tarafı yukarı numaralı seribaşı ekler açmak ve alıcı plaka kuyu içine aktarmak için forseps kullanabilir. Her ekleme kabına Pipet 0.450 ml DMEM-% 10 FBS. Forseps kullanarak, her hazırlanmış ekleme fincan içine bir kemik dokusu fragmanı (~ 3 mm) aktarın. İsteğe bağlı olarak, ek bir kuyu cam boncuklar negatif kontrol olarak kullanılır. 20 saat boyunca bir doku kültür inkübatörü içinde plaka koyun.
    4. Migrasyonun ölçülmesi için, oyuk başına 1 mi DMEM,% 10 FBS ihtiva eden bir standart 24 oyuklu doku kültürü plakası hazırlanır. Inkübatör alıcı plakasını çıkarın ve standart plaka ayrı kuyu içine her birinden eklemek kemik parçaları ve boncuk aktarmak için forseps kullanabilir. Lüsiferin eklealt-tabaka her oyuğa (300 ug / ml'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için) ve adım 3.6-3.7 prosedürleri kullanarak BLI gerçekleştirin.

6. Ek öncesi ve sonrası deneysel Analizleri

  1. Kızarmış iliği analizi.
    1. 50 ml konik tüp üst yerleştirilen 70 mikron hücre süzgecinden içine bir kemik parçası aktarın. Kuvvetli bir şekilde konik bir tüp içinde kemik iliği hücreleri, bir süspansiyon elde etmek için, 10 ml PBS ile bir parçasını temizlemek için bir 25 G iğne ile 10 ml'lik bir şırınga kullanın. Santrifüj hücre süspansiyonu 300 xg'de 3 dakika, 21 ° C, süpernatan aspire ve PBS içinde pelet hücreleri ya da akış sitometrisi için istenen diğer bir çözüm yeniden süspanse edin.
      Not: Tekrar süspansiyona, miktarlar santrifüj ve uygulamadan sonra hücre peleti boyutuna bağlı olarak değişir.
    2. Canlılık analizi için PBS ~ 75-300 ul hacim ticari olarak temin edilebilen fluorescenc kullanılarak uygun olan ve bu süspansiyonlar analiz edilebilire göre canlılığı testleri, imalatçının talimatlarına uygun olarak, geleneksel bir hemasitometre pipetlenir ve bir ters flüoresan mikroskop kullanılarak sayılmıştır.
    3. Akış sitometrik analizi için ya da GFP-pozitif göğüs kanseri hücrelerinin saptanması göre ayrılması,% 2 FBS, 2 mM EDTA ihtiva eden 1 ml PBS içinde hücre topağı tekrar süspansiyon ve 10 konsantrasyon 1 x 10 6 hücre / ml mM HEPES, öyle ki.
  2. H & E Boyama ve İmmünhistokimya.
    1. Hematoksilin ve eosin (H & E) boyama ve / veya immünohistokimya için fragmanları işlemek için, bir dizi 2 kalemle etiketlenmiş plastik kasetlerinde fragmanları yerleştirin ve 24 saat süre ile,% 10 tamponlu formalin ile dolu bir kap içinde daldırın.
    2. Parafin gömme için proses dokular, kesit ve her fragmanında mineralli spikülleri hesabını bir Dekalsifikasyon aşamasını içerir rutin protokoller kullanılarak boyanan.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Femoral Heads Doku Fragments Yalıtımlı

Femur başları erkek ve Stanford Üniversitesi Tıp Okulu'nda Ortopedi Bölümü'nde seçmeli total kalça protezi ameliyatı geçiren kadın hastalarda (yaş 44-90 yıl) eşit sayıda toplanmıştır. Her atılır femur başı mineralli spikülleri ve kemik iliği oluşan trabeküler kemik dokusu barındıran üst femur, küçük bir bölümünü içerir. Bu doku küçük parçalar elde etmek için cerrahi bir rongeur kullanılarak mil (Şekil 2A) ve cerrahi olarak açığa...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Mehra ark., Daha önce yüksek kaliteli dokuları ortaya ve metastatik süreci 47 çalışma, insan kemik örneklerinin kullanımını doğrularken, otopsi sırasında hasat metastatik prostat kanseri hastalarından alınan postmortem toplama ve kemik örneklerinin analizi tarif var. Burada, toplama, işleme ve meme hücre göçü, kolonizasyon ve çoğalmasını incelemek için kısa vadeli bir ko-kültür sisteminde THR cerrahi sonrası atılır femur başları elde edilen insan kemik doku parçaları kullanarak protokolleri tarif var...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Rapor edilecek açıklama yok.

Teşekkürler

Bu çalışmalar Alternatif Araştırma ve Geliştirme Vakfı (107.588), Ulusal Sağlık Enstitüsü (1U54CA136465-04S1) ve Kaliforniya Meme Kanseri Araştırma Programı (201B-0141) hibe, kısmen finanse edildi. Biz Dr teşekkür ederim. Cömert bağış için Andrew Wilber ve R. Scott McIvor onların transponson ve pKa / hUbiC-SB11 transposaz plazmidler. Biz minnetle John Tamaresis, Ph.D. kabul istatistiksel yöntemler tavsiye için, Timothy Brown flow sitometri gerçekleştirmek için, göçler tahliller tavsiye için Georgette Henrich, Nancy Bellagamba için THR örneklerinin koleksiyonu kolaylaştırılması.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
DMEM (1X) + GlutaMAX-lYaşam Teknolojileri10569-010Tüm DMEM'leri %10 fetal sığır serumu ve %1 Pen/Strep ile tamamlayın
McCoy's 5A Orta (1X)Yaşam Teknolojileri16600-082Tüm McCoy's % 10 fetal sığır serumu ve% 1 Pen / Strep
ile tamamlayın Fetal sığır serumuYaşam Teknolojileri16000-044
Penisillen StreptomisinYaşam Teknolojileri15140-122
Blastocidin (10 mgl/ml)InvivoGen ant-blTransfekte edilmiş hücre hatları için kullanılan ek ortam.
Şahin® Şeffaf PET Membranlı 24 Kuyulu Plaka için Hücre Kültürü Ekleri (8.0 & mu; m gözenek boyutu)Corning Incorporated353097
Falcon® 24 Kuyu TC ile İşlenmiş Polistiren Hücre Kültürü Ekleme Yardımcı PlakasıCorning Incorporated353504
CANLI/ÖLÜ Canlılık/Sitotoksisite Kiti * memeli hücreleri için *İnvitrojen Tespit TeknolojileriL-3224
FluoroBrite DMEMYaşam TeknolojileriA18967-01
D-lusiferin ateşböceği, potasyum tuzu 5 g (30 mg / ml)Life TechnologiesL-8220
Steril Hücre Süzgeci 70 & mu; mFisher Scientific22363548
6 Kuyulu TC ile İşlenmiş Hücre Kültürü KümesiCorning Incorporated3516
12 İyi TC ile İşlenmiş Hücre Kültürü KümesiCorning Incorporated3513
24 İyi TC ile İşlenmiş Hücre Kültürü KümesiCorning Incorporated3526
Friedman-Pearson RongeurGüzel Bilim Araçları16021-14
Kemik mumuCerrahi Uzmanlıklar Şirketi903
IVIS 50 Görüntüleme PlatformuKumpas Yaşam Bilimleri/PerkinElmer
Living Image Yazılım Programı Kumpas Yaşam Bilimleri/PerkinElmer133026
EVOS FL Görüntüleme SistemiYaşam TeknolojileriSürüm 4.2
OsteoSense 680 EXPerkinElmerNEV10020EX
MCF-7 meme kanseri hücreleriATCCHTB-22
MDA-MB-231 meme kanseri hücreleriATCCHTB-26
Monoklonal fare anti-insan sitokeratini antikorDAKO Sitomasyon Klonu(AE1/AE3)

Kaynaklar

  1. Place, A. E., Jin Huh, S., Polyak, K. The microenvironment in breast cancer progression: biology and implications for treatment. Breast Cancer Res. 13, 227(2011).
  2. Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9, 239-252 (2009).
  3. Bissell, M. J., Radisky, D. Putting tumours in context. Nat Rev Cancer. 1, 46-54 (2001).
  4. Coleman, R. E., Rubens, R. D. The clinical course of bone metastases from breast cancer. British journal of cancer. 55, 61-66 (1987).
  5. Mundy, G. R. Metastasis to bone: causes, consequences and therapeutic opportunities. Nat Rev Cancer. 2, 584-593 (2002).
  6. Hess, K. R., et al. Metastatic patterns in adenocarcinoma. Cancer. 106, 1624-1633 (2006).
  7. Clarke, B. Normal bone anatomy and physiology. Clin J Am Soc Nephrol. 3, Suppl 3. S131-S139 (2008).
  8. Weatherholt, A. M., Fuchs, R. K., Warden, S. J. Specialized connective tissue: bone, the structural framework of the upper extremity. Journal of hand therapy : official journal of the American Society of Hand Therapists. 25, 123-131 (2012).
  9. Travlos, G. S. Normal structure, function, and histology of the bone marrow. Toxicologic pathology. 34, 548-565 (2006).
  10. Casimiro, S., Guise, T. A., Chirgwin, J. The critical role of the bone microenvironment in cancer metastases. Molecular and cellular endocrinology. 310, 71-81 (2009).
  11. Patel, L. R., Camacho, D. F., Shiozawa, Y., Pienta, K. J., Taichman, R. S. Mechanisms of cancer cell metastasis to the bone: a multistep process. Future Oncol. 7, 1285-1297 (2011).
  12. Goldstein, R. H., Weinberg, R. A., Rosenblatt, M. Of mice and (wo)men: mouse models of breast cancer metastasis to bone. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 25, 431-436 (2010).
  13. Kim, I. S., Baek, S. H. Mouse models for breast cancer metastasis. Biochemical and biophysical research communications. 394, 443-447 (2010).
  14. Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Res. 8, 212(2006).
  15. Thibaudeau, L., et al. Mimicking breast cancer-induced bone metastasis in vivo: current transplantation models and advanced humanized strategies. Cancer metastasis reviews. 33, 721-735 (2014).
  16. Schiller, K. R., et al. Secretion of MCP-1 and other paracrine factors in a novel tumor-bone coculture model. BMC Cancer. 9, 45(2009).
  17. Curtin, P., Youm, H., Salih, E. Three-dimensional cancer-bone metastasis model using ex-vivo co-cultures of live calvarial bones and cancer cells. Biomaterials. 33, 1065-1078 (2012).
  18. Krishnan, V., et al. Dynamic interaction between breast cancer cells and osteoblastic tissue: comparison of two- and three-dimensional cultures. Journal of cellular physiology. 226, 2150-2158 (2011).
  19. Krishnan, V., Vogler, E. A., Sosnoski, D. M., Mastro, A. M. In vitro mimics of bone remodeling and the vicious cycle of cancer in bone. Journal of cellular physiology. 229, 453-462 (2014).
  20. Bussard, K. M., Venzon, D. J., Mastro, A. M. Osteoblasts are a major source of inflammatory cytokines in the tumor microenvironment of bone metastatic breast cancer. Journal of cellular biochemistry. 111, 1138-1148 (2010).
  21. Sosnoski, D. M., Krishnan, V., Kraemer, W. J., Dunn-Lewis, C., Mastro, A. M. Changes in Cytokines of the Bone Microenvironment during Breast Cancer Metastasis. International journal of breast cancer. 2012, 160265(2012).
  22. Bussard, K. M., et al. Localization of osteoblast inflammatory cytokines MCP-1 and VEGF to the matrix of the trabecula of the femur, a target area for metastatic breast cancer cell colonization. Clinical & experimental metastasis. 27, 331-340 (2010).
  23. Kuperwasser, C., et al. A mouse model of human breast cancer metastasis to human bone. Cancer research. 65, 6130-6138 (2005).
  24. Rosenblatt, M. A tale of mice and (wo)men: development of and insights from an 'all human' animal model of breast cancer metastasis to bone. Transactions of the American Clinical and Climatological Association. 123, 135-150 (2012).
  25. Oh, H. S., et al. Bone marrow stroma influences transforming growth factor-beta production in breast cancer cells to regulate c-myc activation of the preprotachykinin-I gene in breast cancer cells. Cancer research. 64, 6327-6336 (2004).
  26. Moharita, A. L., et al. SDF-1alpha regulation in breast cancer cells contacting bone marrow stroma is critical for normal hematopoiesis. Blood. 108, 3245-3252 (2006).
  27. Koro, K., et al. Interactions between breast cancer cells and bone marrow derived cells in vitro define a role for osteopontin in affecting breast cancer cell migration. Breast cancer research and treatment. 126, 73-83 (2011).
  28. Pohorelic, B., et al. Role of Src in breast cancer cell migration and invasion in a breast cell/bone-derived cell microenvironment. Breast cancer research and treatment. 133, 201-214 (2012).
  29. Nicola, M. H., et al. Breast cancer micrometastases: different interactions of carcinoma cells with normal and cancer patients' bone marrow stromata. Clinical & experimental metastasis. 20, 471-479 (2003).
  30. Korah, R., Boots, M., Wieder, R. Integrin alpha5beta1 promotes survival of growth-arrested breast cancer cells: an in vitro paradigm for breast cancer dormancy in bone marrow. Cancer research. 64, 4514-4522 (2004).
  31. Martin, F. T., et al. Potential role of mesenchymal stem cells (MSCs) in the breast tumour microenvironment: stimulation of epithelial to mesenchymal transition (EMT). Breast cancer research and treatment. 124, 317-326 (2010).
  32. Kapoor, P., Suva, L. J., Welch, D. R., Donahue, H. J. Osteoprotegrin and the bone homing and colonization potential of breast cancer cells. Journal of cellular biochemistry. 103, 30-41 (2008).
  33. Chen, X., Lu, J., Ji, Y., Hong, A., Xie, Q. Cytokines in osteoblast-conditioned medium promote the migration of breast cancer cells. Tumour biology : the journal of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine. 35, 791-798 (2014).
  34. Bersini, S., et al. A microfluidic 3D in vitro model for specificity of breast cancer metastasis to bone. Biomaterials. 35, 2454-2461 (2014).
  35. Marlow, R., et al. A novel model of dormancy for bone metastatic breast cancer cells. Cancer research. 73, 6886-6899 (2013).
  36. Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130, 601-610 (2007).
  37. Hutmacher, D. W., et al. Can tissue engineering concepts advance tumor biology research. Trends in biotechnology. 28, 125-133 (2010).
  38. Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature reviews. Molecular cell biology. 7, 211-224 (2006).
  39. Hutmacher, D. W. Biomaterials offer cancer research the third dimension. Nature. 9, 90-93 (2010).
  40. Kim, J. B. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Seminars in cancer biology. 15, 365-377 (2005).
  41. Xu, X., Farach-Carson, M. C., Jia, X. Three-dimensional in vitro tumor models for cancer research and drug evaluation. Biotechnology advances. 32, 1256-1268 (2014).
  42. Dhurjati, R., Krishnan, V., Shuman, L. A., Mastro, A. M., Vogler, E. A. Metastatic breast cancer cells colonize and degrade three-dimensional osteoblastic tissue in vitro. Clinical & experimental metastasis. 25, 741-752 (2008).
  43. Mastro, A. M., Vogler, E. A. A three-dimensional osteogenic tissue model for the study of metastatic tumor cell interactions with bone. Cancer research. 69, 4097-4100 (2009).
  44. Contag, C. H., et al. Monitoring dynamic interactions between breast cancer cells and human bone tissue in a co-culture model. Molecular imaging and biology : MIB : the official publication of the Academy of Molecular Imaging. 16, 158-166 (2014).
  45. Multhaup, M., et al. Cytotoxicity associated with artemis overexpression after lentiviral vector-mediated gene transfer. Human gene therapy. 21, 865-875 (2010).
  46. Thorne, S. H., et al. CNOB/ChrR6, a new prodrug enzyme cancer chemotherapy. Mol Cancer Ther. 8, 333-341 (2009).
  47. Mehra, R., et al. Characterization of bone metastases from rapid autopsies of prostate cancer patients. Clin Cancer Res. 17, 3924-3932 (2011).
  48. Riccio, A. I., Wodajo, F. M., Malawer, M. Metastatic carcinoma of the long bones. Am Fam Physician. 76, 1489-1494 (2007).
  49. Ahmann, G. J., et al. Effect of tissue shipping on plasma cell isolation, viability, and RNA integrity in the context of a centralized good laboratory practice-certified tissue banking facility. Cancer epidemiology, biomarkers & prevention : a publication of the American Association for Cancer Research, cosponsored by the American Society of Preventive Oncology. 17, 666-673 (2008).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

nsan Kemik DokusuMeme Kanseri H creleriBiyol minesans G r nt lemeFloresan MikroskobuAk SitometrisiTranswell MigrasyonuDoku K lt rKemik li i KompartmanH cre Proliferasyonu

İlgili makaleler