İnsan multipl miyeloma (MM) hücreler, mezenkimal hücreler ve hayatta kalma ve proliferasyon için hücre dışı matris bileşenlerinin destek mikro-gerektirir. Biz tümör büyümesi, işgali ve anjiyogenez üzerine kanser ilaçlarının etkilerini incelemek için engrafted insan miyelom ve mezenkimal hücreler ile in vivo tavuk embriyo modelini kurdu.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Chicken İnsan Multipl Miyelom Xenograftlarında Modeli Kurulması Tümör Büyüme, Invasion ve Anjiogenez Eğitim için
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Multipl miyelom (MM), malign plazma hücre hastalığı, çaresiz kalır ve yeni ilaçlar hastaların prognozu iyileştirmek için gereklidir. Nedeniyle, kemik mikro-ve oto / parakrin büyüme faktörlerinin eksikliği insan MM hücrelerinin yetiştirilmesi güçtür. Bu nedenle, insan MM hücreleri üzerinde yeni bir terapötik etkisini incelemek için in vitro ve in vivo kültür sistemlerinde uygun kurmak için acil bir ihtiyaç vardır. Burada, in vitro ve in vivo olarak kompleks 3 boyutlu bir ortamda insan multipl miyeloma hücrelerinin büyümesi için bir model sunmaktadır. MM hücre hatları OPM-2 ve RPMI-8226 transgen GFP ifade transfekte edildi ve insan mezenkimal hücreler ve kolajen varlığında yetiştirilmiştir tip-I üç boyutlu küremsi olarak matris. Buna ek olarak, sferoidler, tavuk embriyo koriyoalantoik membran ı (CAM) üzerinde aşılandı ve tümör büyümesi stereo flöresanlı mikroskobu ile kontrol edilmiştir. Her iki model de yeni terapötik dru çalışma izinkarmaşık bir 3D ortamı ve bir transgen özgü GFP-ELISA greft homojenizasyon sonrası tümör hücre kitlesinin nicelleştirmesinde gs. Ayrıca, onun altında bulunan bir konukçu dokusuna ev ve tümör hücrelerinin invazyonu anjiyojenik tepkilerin bir stereo mikroskop ile günlük olarak takip edilmekte ve insan tümör hücreleri (Ki-67, CD138, vimentin) ya da ana duvar hücreleri kapsayan kan damarları karşı immunohistokimyasal lekeleme ile analiz edilebilir (desmin / ASMA).
Sonuç olarak, onplant sistem karmaşık bir 3D ortamda MM hücre büyümesini ve anjiyogenez okuyan izin verir ve MM hücrelerinin hayatta kalma ve çoğalmasını hedefleyen yeni terapötik bileşikler için tarama sağlar.
Giriş
Multipl miyelom (MM), kemik iliğinde malign plazma hücrelerinin proliferasyonu, kemik lezyonları ve immün yetmezlik 1 ile karakterizedir. Proteazom inhibitörleri (bortezomib) ve immün modülatör ilaçlar (pomalidomid ve lenalidomid) gibi yeni tedavi seçenekleri mevcut olmasına rağmen, MM hala korkunç bir prognoz ile tedavi edilemez bir malignite olmaya devam etmektedir 2. Kötü prognoz, özellikle uzun süreli tedavi ve MM klonlarının seçim baskısı altında, tedaviye değişken yanıtlara katkıda bulunan MM hücre klonlarının olağanüstü heterojenliği ile açıklanabilir 3.
Yeni ilaçların ve bunların kombinasyonlarının <....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Laboratuar Hayvan Refah hatching.The NIH Ofisi, bu alanda (http yazılı kılavuzu sağlamıştır kadar Avusturya hukuk ve ABD kamu sağlık hizmeti kuş embriyo Laboratuvarı Hayvan Refahı Dairesi'ne göre, canlı omurgalı hayvanlar olarak kabul edilmez: // www.grants.nih.gov/grants/olaw/references/ilar91.htm ve NIH Yayın No .: 06-4515).
1. Hücre Kültürü ve lentiviral transfeksiyonu
- Kültür MM hücre çizgileri OPM-2, RPMI-8226 ve RPMI1640 ortam maddesi, kemik iliğinden insan mezenkimal kök hücreleri, varlığında,% 10 sığır cenin dana serumu ve 100 IU / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin ve 2 mM glutamin ile desteklenmiş 37 ° C'de% 5 CO2 iç....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
3D multipl miyelom küremsi deneylerinde hedef bileşiklerin in vitro analizlerde
In vitro olarak, birincil insan AA hücrelerin kültürlenmesi sınırlama kemik iliğinden hücre dışı büyüme matrisi ve destekleyici primer insan mezenkimal hücreler kullanarak, insan MM hücre hatları için yeni 3D, in vitro kültür modellerinde kuruldu (Şekil 1A, B). EGFP transgenik MM hücre hatları küremsilerde 3D büyüme sonrası görselleştirme ve MM tümör ki.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Refrakter MM için yeni terapötik maddelerin geliştirilmesi ilaçların insan MM hücrelerinin duyarlılığını değerlendirmek için daha az zaman alıcı ve pahalı in vivo sistemlerini gerektirmektedir. Şimdiye kadar, sadece birkaç in vivo sistem yeni bir anti-miyeloma terapisi klinik öncesi değerlendirilmesi için kullanılabilir. Bunların hepsi birleşik kütüphaneler 29 büyük ölçekli tarama için kendi sınırlamaları vardır.
İnsan MM hücreleri için en iyi güncel modeller oldukça bağışıklık eksikli.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını var
Teşekkürler
Yazarlar, immünohistokimya ve tavuk embriyolarının hazırlanmasındaki mükemmel teknik yardımı için Bayan Cornelia Heis'e teşekkür etmek istiyor. Bu çalışma, Avusturya Bilim Fonu (FWF Hibe No. P19552) ve Avrupa Birliği (AB FP7 projesi Optatio No: 278570) tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| RPMI-8226 hücreleri | DSMZ | ACC 9 | STR profilli |
| OPM-2 hücreleri | DSMZ | ACC 50 | STR profilli |
| İnsan mezenkimal kök hücreleri | PromoCell | PC-C-12974 | |
| HEK293FT hücreleri | Invitrogen | R700-07 | |
| RPMI1640 Orta Sigma | Aldrich | R0883 | |
| Fetal Sığır Serumu HyClone | ThermoScientific | SH30070.03 | |
| L-Glut-Pen-Strep solüsyonu | Sigma | G6784 | |
| DMEM Medium | Gibco | 31966 | |
| NEAA | Sigma Life Sciences | M7145 | |
| Transfeksiyon Ortamı/Opti-MEM | Gibco | 51985 | |
| eGFP lentiviral partiküller | GeneCopoeia | LPP-EGFP-LV105 | Kullanıma hazır viral partiküller |
| pLenti6/V5Dest6 eGFP vektörü | Invitrogen | PN 35-1271 | yazarlardan |
| ViralpowerTM ambalaj karışımı | Invitrogen | P / N 35-1275 | |
| Transfeksiyon reaktifi / Lipofectamin 2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
| Blasticidin | Invitrogen | R210-01 | |
| Neomisin Biochrom | A2912 | ||
| Kollajen Tipi1 Sıçan Kuyruğu | BD Biosciences | 354236 | |
| DMEM tozu | Yaşam Teknolojileri | Art.Nr. 10338582 | |
| plitidepsin | Pharmamar | ||
| bortezomib | LKT Lab., Inc. | B5871 | |
| SPF-beyaz tavuk yumurtası | Charles Nehri | Döllenmiş beyaz Leghorn tavuk yumurtası | |
| Plastik tartı tekneleri | neoLab | Art.Nr. 1-1125 | ex-ovo kültürü için |
| Petridish kare (Kapaklar) | Simport | Ex-ovo kültürü için | D210-16 |
| RIPA Tamponu (10x) | Hücre Sinyali | #9806 | |
| Proteaz İnhibitör Tabletler | Roche | 11 836 170 001 | |
| Komple Mini EDTA içermeyen | |||
| GFP ELISA | Cell Biolabs, Inc. | AKR-121 | |
| Histocette II | İthalat | M493-6 | |
| PFA %37 | Roth | 7398.1 | |
| DPBS | Lonza | BE17-512F | |
| Etanol absolut | Normapur | 20,821,321 | |
| Roti-Histol | Roth | Art.Nr.6640.4 | |
| Paraplast | Sigma | A6330 | |
| SuperFrost Mikroskop Slaytları | R. Langenbrinck | Ürün No. | |
| Labor- u. Medizintechnik | 03-0060 | ||
| DakoCytomation Yıkama Tamponu 10x | DakoCytomation | Code-No-Nr. | |
| S 3006 | |||
| Hedef Alma Çözeltisi (10x) pH 6,1 | DAKO | Kod-Nr. | |
| S 1699 | |||
| H2O2 | Merck | ||
| m-a-hu ASMA klonu 1A4 | DAKO | M0851 | |
| m-a-hu CD138 klonu MI15 | DAKO | M7228 | |
| m-a-hu Vimentin klonu V9 | DAKO | M0725 | |
| m-a-hu Desmin klonu D33 | DAKO | M0760 | |
| m-a-hu Ki67 klon MIB-1 | DAKO | M7240 | |
| biyotinile keçi anti-fare IgG | Vektör Laboratuvarları A.Ş. | BA-9200 | |
| Vectastain Elite ABC Kiti | Vektör Laboratuvarları A.Ş. | # PK-6100 | |
| HIZLI DAB Tablet Seti. | Sigma Biyokimyasallar | # D4293 | |
| Mayer' s haemalaun solüsyonu | Merck | 1,092,490,500 | |
| Roti Histokitt | Roth | Art.Nr.6638.2 | |
| Tezgah üstü döner mikrotom | Thermo Electron, Shandon Finesse ME+ | ||
| Doku gömme istasyonu | Leica, TP1020 | ||
| Yumurta Kuluçka Makinesi | Grumbach | BSS160 | |
| Stereo floresan mikroskobu, bir dijital kamera (Olympus E410) ve esnek soğuk ışık ile donatılmıştır. | Olympus, SZX10 | ||
| Ultra Turrax | IKA T10 | Homojenizatör |
Kaynaklar
- Kuehl, W. M., Bergsagel, P. L. Multiple myeloma: evolving genetic events and host interactions. Nat.Rev.Cancer. 2 (3), 175-187 (2002).
- Kumar, S. K., Gertz, M. A. Risk adapted therapy for multiple myeloma: back to basics. Leuk.Lymphoma. , (2014).
- Prideaux, S. M., Conwa....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
