Yöntem makalesi

Otomatik Jel Boyut Seçimi Çevre Su Örneklerinden hazırlanmıştır nesil Sıralama Kütüphaneler Kalitesi Geliştirmek için

10K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/52685

⸱

17 Nisan 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Faculty of Medicine, The University of British Columbia, 2Coastal Genomics, 3British Columbia Public Health Microbiology and Reference Laboratory

Bu makalede

Özet

Bu el yazması, yeni nesil dizileme için DNA parçalarını saflaştırmak için otomatik bir jel boyutu seçim yaklaşımını açıklamaktadır. Ranger Teknolojisi, agaroz jel yükleme, elektroforetik analiz ve hedeflenen DNA parçalarının geri kazanılması sürecinin tamamının tam otomasyonunu sağlayarak yüksek verimli ve yüksek kaliteli yeni nesil dizileme kitaplıklarına olanak tanır.

Özet

Çevresel örneklerin yeni nesil dizilimi, bu örneklerdeki değişken DNA miktarı ve kalitesi nedeniyle zor olabilir. Yeni nesil dizilemeden en iyi sonuçları almak için yüksek kaliteli DNA kütüphanelerine ihtiyaç vardır. Su gibi çevresel numuneler, düşük kalite ve miktarlarda DNA'nın yanı sıra DNA ile birlikte çökelen kirleticilere sahip olabilir. Ekstraksiyon ve kütüphane hazırlamada yer alan mekanik ve enzimatik süreçler DNA'ya daha fazla zarar verebilir. Jel boyutu seçimi, dizileme uygulamaları için tanımlanmış bir boyuttaki DNA fragmanlarının saflaştırılmasını ve geri kazanılmasını sağlar. Bununla birlikte, bu görev, DNA kütüphanesi hazırlama iş akışındaki en çok zaman alan adımlardan biridir. Burada açıklanan protokol, agaroz jel yüklemesinin, elektroforetik analizin ve hedeflenen DNA parçalarının geri kazanılmasının tam otomasyonunu sağlar.

Bu çalışmada, tatlı su örneklerinden diğer çevresel örneklere de uygulanabilecek yüksek kaliteli DNA kütüphaneleri hazırlamak için yüksek verimli bir yaklaşım tanımlanmıştır. Çevresel tatlı su örneklerinden bakteri hücrelerini konsantre etmek için dolaylı bir yaklaşım kullandık; DNA, ticari olarak temin edilebilen bir DNA ekstraksiyon kiti kullanılarak ekstrakte edildi ve DNA kütüphaneleri, ticari transpozon tabanlı bir protokol kullanılarak hazırlandı. 500 ila 800 bp'lik DNA fragmanları, otomatik bir elektroforez iş istasyonu olan Ranger Teknolojisi kullanılarak seçilen jel boyutundaydı. Boyut olarak seçilen DNA kütüphanelerinin dizilenmesi, dizileme okumalarının okuma uzunluğu ve kalitesinde önemli gelişmeler gösterdi.

Giriş

Metagenomik, mevcut mikrobiyal toplulukları karakterize etmek için bir örnekteki tüm genetik materyalin dizilenmesini içerir. Ekstrakte edilen nükleik asitlerin DNA kütüphanelerine dönüştürülmesini ve ardından yeni nesil dizilemeyi içeren karmaşık ve pahalı bir süreçtir. Maksimum veri çıktısı ve doğru metagenomik analiz için yüksek kaliteli kütüphaneler gereklidir. Su örnekleri gibi çevresel örnekler,1-3 oranında bozunabilen düşük miktarda DNA ve PCR4-6 inhibitörlerinin varlığı nedeniyle genellikle yüksek kaliteli kütüphaneler oluşturmada önemli zorluklar oluşturur.

Yüksek kaliteli kütüphaneler ideal olarak dar bir uzunluk aralığında daha uzun DNA segmentlerinden oluşur. Dizileme çalışması başına üretilen yararlı veri miktarını en üst düzeye çıkarmak için, kitaplıktaki DNA'nın uzunluğu en az kullanılan dizileme yönteminin maksimum okuma uzunluğu kadar uzun olmalıdır. Illumina MiSeq gibi bir sentez yoluyla dizileme teknolojisi kullanıldığında, DNA parçalarının boyutu, akış hücresinde kümelerin oluşturulma verimliliğini etkiler. Örneğin, bir kütüphane hem daha kısa hem de daha uzun DNA parçaları içerdiğinde, daha kısa olanlar dizileme verilerinde aşırı temsil edilecektir7,8. Buna karşılık, benzer büyüklükte DNA parçalarına sahip bir kütüphane, dizileme verilerinde orantılı olarak temsil edilecektir. Birçok kütüphane hazırlama kiti, DNA parçalarına adaptörler eklemek için ligasyon tabanlı yöntemler kullanır ve bir ek içermeyen adaptör dimerlerini çıkarmak için boyut seçimi gereklidir9,10. Bunu başarmak için çok sayıda yöntem11,12 vardır, ancak en tutarlı sonuçları veren teknik, DNA'nın elektroforetik olarak ayrılması ve ardından istenen DNA uzunluklarının geri kazanılmasıdır13,14. Bu işlem az sayıda numune için manuel olarak gerçekleştirilebilir, ancak yüzlerce numunenin işlenmesiyle karşı karşıya kalındığında otomatik çözümler gereklidir. Otomatik jel boyutu seçimi için şu anda mevcut olan platformlar düşük verimlidir ve dizileme için çok sayıda numuneyi işlemek için yeni platformlara ihtiyaç vardır. Ranger Teknolojisi, günümüzün yüksek verimli ortamını karşılayan bir ölçekte boyut seçimi ve analitik amaçlar için agaroz jel elektroforezinin kullanılmasını sağlamak için mevcut sıvı işleme iş istasyonlarıyla entegre edilebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Su Toplama ve Filtrasyon

  1. Çeşitli sitelerde (Şekil 1) tatlı su örnekleri toplamak. Bir filtre dizi örnekleri belirtilebilir: 1 mikron filtre, 0.2 um'lik bir filtre ve 30 kDa kesme teğetsel akış filtresi, sırasıyla sistematik olarak ayrılması ökariyotik ve bakteriyel ve viral ölçekli parçacıkları için.
    Not: sadece saflaştırma ve 0.2 um filtre (serbest yaşayan bakteriler) karşılanan malzemenin analizi, bu raporda tarif edilmektedir, ancak benzer yaklaşımlar filtreleri elde diğer partiküller için kullanılabilir.

2. Bakteriyel Konsantrasyon, DNA Ekstraksiyon ve Arıtma

  1. Su filtre sisteminden (şematik bir diyagramı, Şekil 2) 0.2 um membran filtre (ler) çıkarın. Yarısında 0,2 mikron disk filtre katlayın ve açık tarafı yukarı bir 50 ml tüp içine yerleştirin. Içine 1x Fosfat tamponlu solüsyon 5 ml (PBS) ve% 0.01 Tween, pH 7.4 eklemetüp. Birden fazla filtre işlemi sırasında kullanıldığında, filtre başına farklı bir tüp kullanır. 4 ° C'de filtreyle deposu boru (lar) kadar işlendi. Aksi takdirde, 2.2 adıma geçin.
  2. Steril forseps ile 50 ml tüp 0.2 mikron membran filtreyi çıkarın. Bir petri üzerine yerleştirin filtre (ler) (tüp PBS tampon bırakın).
    1. Steril forseps ve steril makaslar ile küçük şeritler halinde filtre (1 cm x 1 cm) kesildi. % 70 izopropanol nemlendirici bir DNA yüzey temizleyici ile silinerek farklı numuneler arasında tip 1 aşırı saf su ile durulama ile Forseps ve makas dezenfekte.
  3. Tekrar aynı 50 ml tüp içine şeritler halinde kesilmiş filtreyi yerleştirin. 50 ml tüp içinde tampon, 15 ml olmak üzere toplam yani filtreye 1x PBS, 10 ml ve% 0.01 Tween, pH 7.4 ekleyin.
  4. Her 50 ml tüp 6 temiz tungsten boncuk (3 mm çapında) ekleyin 20 dakika (50 ml tüpler vorteks adaptörü kullanın) için şiddetle Parafilm ile tüp, ve vorteks kapsayacak. Daha fazla Eğeriple filtreleri temiz bir 50 ml tüp içine bir örnek, transfer ve havuz tüm homojenattan işlenir. 4 ° C'de 15 dakika boyunca 3300 x g'de tüpler santrifüjleyin.
  5. 1.7 ml mikrosantrifüj tüplerine pelet ve kısım bakteriyel hücreler (~ 1 ml'lik eş payları,) yeniden süspanse edin. Numune başına 5 mikrosantrifüj tüpleri olacağını not edin.
  6. 10 dakika boyunca 10.000 x g'de mikrosantrifüj tüpler aşağı Spin ve 200 ° 'ye kadar ul işareti aşağı süpernatant en çıkarmak.
  7. -80 ° C'de örnekleri saklayın, ya da üreticinin talimatlarına göre bir piyasada mevcut DNA izolasyon kiti kullanılarak bakteriyel DNA ayıklayın geçin. Bakteriyel DNA ekstraksiyon kullanımı ya PBS veya su negatif kontrol olarak ekstraksiyon ve E. sırasında Pozitif kontrol olarak ekstraksiyon coli.
  8. Birden tüpler DNA ayıklanır ediliyor Çünkü, bir 2 ml tüp içine aynı örnekten paralel alt alikotları havuz. Daha sonra 0.1 müteşekkil bir çözelti kullanılarak bir O / N çökelmesini yapmak3 M sodyum asetat,% 100 etanol içinde 2 hacim ve 5 ug / ml doğrusal akrilamid 5 ul hacmi. İyice karıştırın ve mağaza örnekleri -80 ° C'de.
  9. 4 ° C'de 30 dakika maksimum hızda (17,000 xg) santrifüjleyin. 10 mM Tris-Cl, pH 8.5, 34 ul en fazla 5 dakika ve tekrar süspansiyon DNA pelet bir biyo-güvenlik kabini içinde buz-soğuğu% 70 etanol, kuru hava içinde 1 ml pelet yıkayın.
    Not: Doğrusal akrilamid O / N yağış sonrası DNA pelet görselleştirmek için yardımcı olacaktır.
  10. Üreticinin talimatlarına (Malzeme Tablo bakınız), sırasıyla, yüksek hassasiyet floresan nükleik asit kantitasyon tahlil ve microvolume spektrofotometre kullanarak aşağıdaki DNA miktarını ve kalitesini belirleyin.
    Not: birden çok numune anda hazırlanır, dsDNA ve plaka bazlı florimetre / spektrofotometre ölçülmesi için ultra-hassas bir floresan nükleik asit tahlil bunun yerine kullanılabilir.

3. DNA Kütüphanesi hazırlanması

  1. 0.2 ng / ul ~ bir konsantrasyona su örneklerinden çıkarılan genomik bakteriyel DNA normalize edilir.
  2. Bir transpozon-tabanlı bir yöntem (tagmentation) kullanılarak bakteriyel DNA'nın enzimatik fragmanı bir nanogram. Üreticinin talimatlarına takip parçalanmış DNA üzerine adaptör ve dizin dizileri ekleyin. Dizileme endeksler dahil edilmiştir, bu noktada, üreticinin talimatlarına, belirtildiği gibi tabi PCR 12 döngü numuneleri tagmented.

4. Otomatik Jel Boyut Seçimi

  1. Üreticinin talimatlarına açıklanan standart PCR sonrası temizleme adımı atlayın (Malzeme Tablo bakınız). Boyut seçin PCR sonrası numuneler doğrudan otomatik jel bazlı boyutu seçimi platformu kullanarak.
    1. Her bir örnek için yükleme tamponu 3.5 ul ekleyin.
    2. Imalatçının protokolü izlenerek, 300 ul özü, 500-800 bp'lik bir boyut seçim hedefi belirterek, elektroforez iş istasyonunda örnekleri yükBir ön-döküm% 1.5 agaroz kaseti kullanarak iyon hacmi,.
    3. Etanol çökeltme ile 25 ul kadar ham çıkış malzemesi (300 ul) konsantre edin.
      Not: Alternatif olarak, filtre plakası ve vakum manifoldunun yoluyla örneklerin büyük sayılar için konsantrasyonu otomatikleştirmek için elektroforez iş istasyonu kullanın.
      1. 3 M sodyum asetat ve 0.1 hacminde,% 100 etanol içinde 2 hacim ve 5 ug / ml doğrusal akrilamid 5 ul kullanarak ham elüsyon hacmi çökeltilmesi. -80 ° CO / N de, iyi bir yerde örnekleri karıştırın. Santrifüj numuneler 30 dakika için 17,000 x g'de.
      2. Süpernatantlar atın ve buz gibi soğuk% 70 etanol 1 ml DNA pelet yıkayın geçin.
      3. Santrifüj numuneleri yine 30 dakika süre ile 17,000 x g de, üst fazlar, kuru hava atmak ve son olarak 10 mM Tris-Cl, pH 8.5, 25 ul DNA pelletini.
  2. (İsteğe bağlı) bir beş yapmak için otomatik jel boyutu seçimi platformu ile seçilen DNA kütüphaneleri boyutu 1 ul kullanınTris-EDTA tampon çözeltisi, pH 8.0 kullanılarak kat seyreltme. Üreticinin talimatlarına göre dsDNA kalitesini analiz etmek için bir çip tabanlı kapiller elektroforez aleti kullanılarak kütüphaneleri analiz.

5. Kütüphane Normalleştirme ve Sıralama

  1. Üreticinin hazırlık kılavuzunda açıklandığı gibi (transpozon-tabanlı kütüphane hazırlık seti dahil) kütüphane normalleştirme boncuklar kullanarak örnekleri normalleştirmek için devam edin.
    1. Seçenek olarak ise, 2 nM'lik, bir nihai konsantrasyona ulaşmak için dsDNA eşit molar oranlarda bir araya getirerek ve ardından, yüksek hassasiyetli floresan nükleik asit niceleme deneyi kullanılarak dsDNA kütüphaneleri ölçer. Toplanmış kütüphaneler 10 ul ve 0.2 N NaOH, 10 ul kullanarak kütüphane denatüre etmek için devam oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edilir. 11:05 son bir 1 ml hacmi ve konsantrasyonu (transpozon tabanlı hazırlık seti ile birlikte) melezleme tamponu kullanılarak denatüre kütüphaneleri sulandırmak.
  2. Yük örneğiüreticinin standart sıralama protokollerini takip ederek bir nesil dizileme platformu s.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

DNA Konsantrasyon ve Kalite Değerlendirmesi

Bakteriyel DNA konsantrasyonları 0.01 ila 0.11 ng ​​/ farklı havza sitelerinin su numune başına mi (Tablo 1) arasında değişmektedir. Bakteriyel fraksiyondan izole edilmiş DNA sırası ile, 1.6 A 260/280 ve 1,4-1,8 arasında bir 260/230 oranı ve 0.3 vardı. Bir 260/230 oranları bazı nispeten düşük iken, belirgin bir inhibisyon hazırlanan kütüphane ve diğer alt uygulamalarda görülmektedir...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

adaptör dimerleri ve tercihen mevcut platformlarda sıralandı olan küçük ekleme boyutları kümelenme varlığı kullanılabilir verimleri ve altı-kullanımı cihazlarının kapasitesi 15 bir azalma temsil eder. kitaplıkları hazırlanması için bir transpozon bazlı yaklaşım ile birlikte damla çırpma yöntemlerin kullanılması ekstre 4,5 'diğer yöntemlere kıyasla daha fazla DNA kesme neden olabilir. Dizileme dağılımı 8,16 okur Yine, ekstraksiyon ve kütüphane hazırlık tüm yöntemler potansiyel önyargı...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Jared R. Slobodan ve Matthew J. Nesbitt hem Kıyı Genomics, Ranger Teknolojisi sunan bir özel sektöre ait British Columbia şirketin hisse sahibi.

Teşekkürler

Bu çalışma Genome BC, Genome Canada ve Coastal Genomics tarafından finanse edildi. Yazarlar, numune toplama ve işleme konusundaki yardımları için Kirby Cronin ve Michael Chan'a teşekkür eder. Ayrıca biyoinformatik yardımları için Thea Van Rossum ve Dr. Fiona Brinkman'a teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Peristaltik pompa Masterflex P/S 1400 SerisiThermo Scientific 1400-1620
0.2 ve mikro; m Supor MembranVWRCA28143-969Pall Corporation, Ann Harbor, MI
Tungsten karbür boncuklar 3 mm (200)Qiagen69997
İzopropil alkol %70Jedmon Ürünleri825751Healthcare Plus
DNA uzaktaVWR7010Molecular BioProducts, Inc. San Diego, CA
Milli-Q su arıtma sistemiFisher ScientificZMQS6VF0YMerck Millipore. Bu sistem kullanımdan kaldırıldı.
20x PBS pH 7.5VWRE703-1LAmresco, Inc., Solon, OH
Tween 20Fisher ScientificBP337-100Fisher kimyasalları
2 için Vorteks adaptörü (50  ml) tüplerVWR13000-V1-50MoBio, Carlsbad, CA
Vortex-Genie 2, 120  V (Model G560)VWRSI-0236Bilimsel Endüstriler, Inc.
Beckman SantrifüjRaeyco Lab Equipment Systems Management LtdModel J-6B
PowerLyzer Powersoil DNA izolasyon kitiVWR12855-100MoBio, Carlsbad, CA
24 (1.5-2 ml) tüp için vorteks adaptörüVWR13000-V1-24MoBio, Carlsbad, CA
Mikrofüj 18 santrifüjBeckman Coulter367160
Nimbus Select iş istasyonu ile Ranger TechnologyHamilton Robotics92720-01Sıvı işleme iş istasyonunu ve entegre Ranger Tech (elektroforez donanımı) içerir
Ranger reaktif kitiCoastal GenomicsCG-10600-150-12-21Yükleme tamponu ve kasetleri içerir
Etil alkol (susuz)Ticari AlkollerP016EAANGreenfield
Etanol Sodyum asetatSigma-AldrichS2889-250G
Lineer akrilamid (5  mg / ml)Yaşam TeknolojileriAM9520Ambion
Eppendorf soğutmalı santrifüjRaeyco Lab Equipment Systems Management Ltd.5417R
Tampon EB (250 ml)Qiagen19086
NanoDrop 1000 SpektrofotometreThermo ScientificND-1000
Qubit florometreYaşam TeknolojileriQ32857Invitrogen. Bu ürünün üretimi durduruldu.
Qubit dsDNA HS tahlil kitiYaşam TeknolojileriQ32854Invitrogen
Yüksek hassasiyetli DNA reaktifiAgilent Technologies5067-4626
Yüksek hassasiyetli DNA çipleriAgilent Technologies5067-4626
Agilent 2011 BiyoanalizörAgilent TechnologiesG2938B
Nextera XT DNA numune hazırlama kitiIlluminaFC-131-1024
Nextera XT indeks kitiIlluminaFC-131-1001
MiSeq reaktif kiti v2 (500 döngü)IlluminaMS-102-2003
Miseq sistemiIlluminaSY-410-1003

Kaynaklar

  1. Siuda, W., Chrost, R. J. Concentration and susceptibility of dissolved DNA for enzyme degradation in lake water - some methodological remarks. Aquatic Microbial Ecology. 21, 195-201 (2000).
  2. Butler, J. M., Hill, C. R. Scientific Issues with Analysis of Low Amounts of DNA. , Available from: http://www.promega.ca/resources/profiles-in-dna/2010/scientific-issues-with-analysis-of-low-amounts-of-dna (2010).
  3. Ficetola, G. F., Miaud, C., Pompanon, F., Taberlet, P. Species detection using environmental DNA from water samples. Biology letters. 4, 423-425 (2008).
  4. Liles, M. R., et al. Recovery, purification, and cloning of high-molecular-weight DNA from soil microorganisms. Applied and environmental microbiology. 74, 3302-3305 (2008).
  5. Bey, B. S., Fichot, E. B., Dayama, G., Decho, A. W., Norman, R. S. Extraction of high molecular weight DNA from microbial mats. BioTechniques. 49, 631-640 (2010).
  6. Tebbe, C. C., Vahjen, W. Interference of humic acids and DNA extracted directly from soil in detection and transformation of recombinant DNA from bacteria and a yeast. Applied and environmental microbiology. 59, 2657-2665 (1993).
  7. Solonenko, S. A., et al. Sequencing platform and library preparation choices impact viral metagenomes. BMC genomics. 14, 320(2013).
  8. Aird, D., et al. Analyzing and minimizing PCR amplification bias in Illumina sequencing libraries. Genome biology. 12, R18(2011).
  9. Quail, M. A., Swerdlow, H., Turner, D. J., et al. Improved protocols for the illumina genome analyzer sequencing system. Current protocols in human genetics / editorial board, Jonathan L. Haines .. [et al.]. 18, 18(2009).
  10. Head, S. R., et al. Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges. BioTechniques. 56, 61-64, 66, 68 (2014).
  11. Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. Library preparation methods for next-generation sequencing: tone down the bias. Experimental cell research. 322, 12-20 (2014).
  12. Grunenwald, H., Baas, B., Caruccio, N., Syed, F. Rapid, high-throughput library preparation for next-generation sequencing. Nature Methods. 7, (2010).
  13. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning : a laboratory manual. , 3rd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (2001).
  14. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of visualized experiments. , (2012).
  15. Quail, M. A., et al. A large genome center's improvements to the Illumina sequencing system. Nature methods. 5, 1005-1010 (2008).
  16. Marine, R., et al. Evaluation of a transposase protocol for rapid generation of shotgun high-throughput sequencing libraries from nanogram quantities of DNA. Applied and environmental microbiology. 77, 8071-8079 (2011).
  17. Rohland, N., Reich, D. Cost-effective high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome research. 22, 939-946 (2012).
  18. Lamble, S., et al. Improved workflows for high throughput library preparation using the transposome-based nextera system. Bmc Biotechnology. 13, (2013).
  19. Picelli, S., et al. Tn5 transposase and tagmentation procedures for massively scaled sequencing projects. Genome research. , (2014).
  20. Rhodes, J., Beale, M. A., Fisher, M. C. Illuminating Choices for Library Prep: A Comparison of Library Preparation Methods for Whole Genome Sequencing of Cryptococcus neoformans Using Illumina HiSeq. PloS One. 9, e113501(2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

DNA K t phanesi Haz rlamaRanger TeknolojisiElektroforez stasyonuBakteriyel DNA Ekstraksiyonu500 800 bp Boyut Se imiY ksek Verimli lemeMikrobiyal Kom nite Analizi

İlgili makaleler