Çoklu-parametre floresans ile aktive edilen hücre sınıflandırma İnsan lenfatik endotel hücreleri İzolasyonu

Summary

Bu protokolün amacı floresans ile aktive edilen hücre sınıflandırma (FACS) kullanılarak insan lenfatik malformasyon kiste benzer damarları ve derisini astar lenfatik endotel hücreleri izole etmektir. Daha sonra hücre kültürü ve bu hücrelerin genişlemesi, genetik proteomik, işlevsel ve hücre farklılaşması çalışmaları için deney sofistike yeni bir düzeyde izin verir.

Abstract

Primer lenfödem, lenf malformasyonlar ve lenfatik tümörler gibi lenfatik sistem bozuklukları önemli morbidite nedeni ama az onların biyoloji hakkında bilinen nadir durumlardır. Hastalıklı ve sağlıklı dokudan son derece saf insan lenfatik endotel hücreleri (LECS) Ayırma, genetik, moleküler ve hücresel düzeyde lenfatik endotel çalışmalarını kolaylaştıracaktır. Bu araştırmalar, bu durumların klinik yönetimi değişebilir yeni tedaviler için hedefler ortaya çıkarabilir tahmin edilmektedir. LECS ve lenfatik malformasyon lenfatik endotel hücreleri (LM LECS) sünnet derisi insan izolasyonunu açıklayan bir protokol sunulmuştur. Elde etmek için tek bir hücre süspansiyonu dokusu kıyılmış ve enzimatik dispase II ve kollajenaz II kullanılarak tedavi edildi. Elde edilen tek bir hücre süspansiyonu daha sonra farklılaşması (CD) belirteçleri CD34, CD31, Vasküler Endotelyal Büyüme Faktörü-3 (VEGFR-3) ve podoplanin kümelenmesinde antikorlar ile işaretlenmiştir. Stained canlı hücreler diğer endotelyal ve non-endotel hücrelerinden CD34 ^Düşük CD31 ^Pos VEGFR-3 ^Pos podoplanin ^Pos LM LEC nüfusu ayırmak için bir floresan aktif hücre sıralayıcı (FACS) üzerinde sıralanır. kriteri LM LECS kültüre ve daha deneysel kullanım için fibronektin kaplı şişeler üzerinde genişletti.

Introduction

Lenfatik damar sisteminin önemli bir fonksiyonu, lenf, lipidler, proteinler ve hücre bileşenleri içeren bir aşırı interstisyel sıvı emer ve kan venöz sisteme yapmaktır. Lenfatik kapilerlerin bir ağ yabancı antijenlere immün gözetim ve yabancı antijenleri nötralize etmek için beyaz kan hücrelerinin dağıtım önemli bir işlem varlığı için taranmıştır lenf düğümlerine lenf yönlendirir.

tek yönlü lenfatik sistem ilk lenfatik kılcal lenf girişini ^1,2 izin özelleşmiş hücre kavşaklar ince duvarlı düz endotel hücreleri süreksiz tek tabaka ile benzersiz bir yapıya sahip dokularda başlar. Bu kılcal artan interstisyel basınç ³ mevcudiyetinde damar çökmesini engellemek için filamanların ankraj ile komşu bağ dokusu matrise bağlıdır. lenfatik kılcal toplama içine boş ilk lenfatik kılcalO büyük lenfatik damarların veya damarlar içine birleşerek. Karşılaştırıldığında lenf damarları daha kalın kap duvarları, ikili lenf valfleri olan ve bir kaç düz kas hücreleri, ⁴ gömülü olduğu bir süreksiz bir temel zar ile kapatılmış olan toplama lenf kılcal damarlar başlangıç. Düz kas hücrelerinin koordineli açılması ve lenfatik valf kapağı ve daralma lenf ³ akışını kolaylaştırır. Torasik kanal ve sağ lenfatik kanal: İnsanlarda, vücudun çeşitli bölgelerinden lenfatik damarlar iki lenfatik kanallar oluşturacak şekilde birleştirmek lenfatik gövdelerine oluşturmak için katılın. Torasik kanal göğüs altında vücudun sol tarafında ve sağ taraftan lenf drene olurken, baş, boyun ve toraks sağ kol ve sağ taraftan sağ lenfatik kanal drene lenf. Her iki kanallar boyun ⁵ subklavyen damarlar içine lenf yapıyoruz.

Lenfatik sistem bozuklukları geniş edinilen a halinde gruplandırılmışnd, konjenital (Tablo 1). Edinilen durumların örnekleri lenfanjit ve ikincil lenfödem vardır. Lenfanjit bakteriyel enfeksiyona lenfatik damar iltihabıdır. Etkilenen lenfatikler dilate ve eksuda içeren polimorfonükleer hücreleri ile doldurun. Deride, bu lenf sıklıkla ilişkili lenf düğümüne (lenfadenit) ⁶ genişlemesi ile birlikte, kırmızı, ağrılı deri altı çizgiler olarak görünür. İkincil lenfödem lenfatik damar veya lenf nodu tıkanıklığı hasar veya tıkanma sonucu olarak ortaya çıkar. Bu hasar veya tıkanma lenf distalinde birikimi kronik ilerleyici şişme yol açar. Gelişmiş ülkelerde, sekonder lenfödem en yaygın metastaz tümörlerin lenf damarlarına veya bölgesel lenf nodları engel ya da anti-kanser tedavisinin bir sonucu olarak, lenf düğümleri, radyasyon sonrası fibroz ve post-enflamatuar trombositemili cerrahi olarak çıkarılması, aşağıdaki habislik ile bağlantılı olanBosis ve skar ^7. Dünyanın diğer bölgelerinde, ikincil lenfödem gibi Wuchereria bancrofti ⁶ olarak parazitik kurtlar neden lenfatik obstrüksiyona sekonder olabilir.

Lenfatik damar sistemi bozuklukları,
Edinilen	Doğuştan
Lenfadenit İkincil lenfödem	İlköğretim Lenfödem 10	Sporadik Lenfatik Malformasyonlari 13	Sendromları 13 Lenfatik malformasyonlar İlişkili
	örneğin Milroy Sendromu Meige Sendromu	Basit: Lenfatik malformasyonlar	örneğin Klippel-Tranaunay Sendromu Parklar Weber Sendromu Sturge-Weber Sendromu
		Kombine: Kılcal-lenfatik malformasyonlar Kılcal-lenfatik-venöz malformasyon Kılcal-lenfatik-arteriyovenöz malformasyon Kılcal-lenfatik venöz-arteriyovenöz malformasyon

Lenfatik damar sistemi hastalıklarının Tablo 1. Genel Bakış.

Lenfatik sistemin konjenital hastalıklar, genetik mutasyonlar, lenfanjiektazi ve lenfatik sistem ^8,9 anomalileri neden olduğu düşünülen birincil (idiopatik) lenfödem sayılabilir. Birincil lenfödem muhtemelen de novo mutasyonlar sonucu oluşan veya miras sporadik olabilir. Lenfatik bozukluklar ayrıca izole edilmiş olabilir ya da daha genel bir sendrom ¹⁰ bir kısmını ihtiva edebilir. Lenf pediatrik popülasyonda% 97ödem bölgesel lenf drenajı ¹¹ bozan lenfatik damar yapısında anormallikler sporadik. Milroy hastalığı doğumda belirgin ya da kısa bir süre sonra ¹² VEGFR-3 genindeki mutasyon neden birincil lenfödem bir örnektir. Çoğunlukla ailesel durumda olmasına rağmen, Milroy hastalığı da Milroy hastalığının ³² aile öyküsü olmayan bebeklerde tespit edilebilir. Herhangi bir lenfödem şiddeti lenf üretimi ve venöz dolaşımı ⁶ lenf geri taşıma yeteneği miktarına bağlıdır.

Klinik bulgular ve yerinde endotel hücre çoğalmasında dayanarak, lenfatik sistemin anomalileri lenfatik tümörler veya lenfatik malformasyon ¹³ olarak sınıflandırılır. Kaposiform lenfanjiomatozis bir LEC tümör ¹⁴ örneğidir. Lenfatik malformasyonlar embriyonik gelişim sırasında ortaya çıkan ve çocuğa ^15,16 oranında büyümeye düşünülmektedir. Onlar nadiren gerileme ama remai edebilirsinizn asemptomatik travma veya enfeksiyon klinik komplikasyonlara yol açan hızlı büyüme çöker kadar. Yukarıda tarif edilen venöz dolaşıma dokudan lenfatik ağ ve lenf iletiminin düzenli yapısı lenfatik sıvı ile dolu kistik anormal yapılar lokalize koleksiyonları oluşan lenfatik malformasyon olarak tedirgin olduğunu. Bu kistik gemiler de fonksiyonel lenfatik vanaları içeren lenfatik dolaşıma bağlı veya olduğunu hiçbir klinik veya deneysel kanıtlar olsa da, onların lenfatik kimlik gibi podoplanin, CD31, Lenf Gemi Endotel Reseptör 1 olarak lenfatik hücre belirteçleri aralığının ifadesi tarafından onaylandıktan (LYVE-1), Prospero homeobox protein 1 (PROX-1) ve VEGFR-3 ^15,17,18. Bu kistik yapılar, ya küçük (mikrokistik) veya büyük (makrokistik) olabilir, ama en lenfatik malformasyonlar mikrokistik ve makrokistik bileşenleri (Şekil 1) ¹⁶ her ikisini de içerir. Ameliyat sonrasında, injection skleroterapi ve / veya radyofrekans lenfatik malformasyonlar genellikle yeniden ortaya çıkması ablasyona.

İnsan lenfatik damarların ve lenfatik malformasyonlar Şekil 1. Morfoloji. Normal insan lenfatik (A) ve podoplanin antikor ile etiketlenmiş lenfatik malformasyon damarları (B ve C) (kahverengi etiket, ok). İnsan lenfatik malformasyon damarları belirgin dilatasyon ve lümen boyutu önemli değişim ile karakterizedir. Bu lokalize anormal kistik yapıları küçük (mikrokistik, *) (B), ya da büyük (makrokistik, #) (C) olabilir. En lenfatik malformasyonlar hem mikrokistik ve makrokistik bileşenleri içerir. rakamın büyük halini görmek için tıklayınız.

Bazı araştırmacılar lenfatik malformasyonlar LECS anormal büyüme potansiyeli yok ama onun yerine, normal dolaşıma ¹⁹ bağlamak için başarısız olan lenfatik damar gelişimsel bozukluğu temsil ileri sürmüşlerdir. Bununla birlikte, LM LECS hızlı çoğalan ve LECS ¹⁵ LM LECS bir defekt olduğunu düşündürmektedir sünnet daha apoptoza karşı daha dirençli olduklarını bulduk. LM LECS fare ksenograft modelinde implante edilir, bunlar lenfatik malformasyon ¹⁵ hatırlatan yapılar oluştururlar. Bu lenfatik malformasyonlar, fetal gelişim sırasında LM LECS doğan bir veya daha fazla somatik mutasyonlar neden olabilir bir hipotezini desteklemektedir. Gerçekten, son raporlar fosfoinositid 3-kinaz (PIK3CA) geni ²⁰ p110α katalitik alt birim bu tür bir mutasyon tespit ettik.

DNA dizileme teknolojisinin, ilgili mutasyonlar c gelişmeler göz önüne alındığındaOuld daha kolay bu durumların gelecekteki çalışmalara rehberlik, izole LM LECS tanımlanabilir. canlı LECS izolasyonu azalmış besin durumunu veya pro-apoptotik ajanları ¹⁵ tepki olarak bu hareketi, çoğalması, tüp oluşturma yeteneği ve hayatta kalma gibi tahlillerde anormal ve normal LECS arasında karşılaştırmalar kolaylaştıracaktır. İzole LECS daha yeni LEC alt popülasyonlarını belirginleştiren, hücreye özgü gen ifadesi ve proteomik çalışmalar yapmak için bize izin ve lenfatik malformasyonlar klinik yönetimi için uygun yeni farmakolojik ajanlar keşfetmek istiyorum.

Biz daha önce yenidoğan sünnet derisi ve lenfatik malformasyonlar ¹⁵ den LECS manyetik boncuk ayrılması dayalı bir LEC izolasyon yöntemi yayınladık. Bu CD31 pozitif seçime CD34 ^Neg hücre fraksiyonunun tabi tutarak, ardından CD34 ekspresyonunun bulunmaması, göre, vasküler endotel hücrelerinden normal ve hastalıklı LECS ayrılması için bir strateji bildirilmiştir.Bununla birlikte, bu yöntem artık olmayan endotel hücrelerinin mevcudiyeti ile engellenmiştir. Bu daha sonraki bağ dokusu sindirim öncesinde epidermise kaldırarak bağımsız oldu. Bu kirleticiler genellikle daha hızla çoğaldı ve böylece sonunda LEC izolasyon tekrarlamak sonraki girişimlerine rağmen endotel hücre kültürleri overgrew. Gerçekten de,% 5 ile% 2 kadar düşük olmayan endotel hücrelerinin bir başlangıç ​​kirlenmesi LEC nüfusu ¹⁵ bastırmak için yeterli olmuştur. Bu LEC hücre verim ve saflık geliştirmek için bir seçenek olarak floresan aktif hücre sıralama yöntemi keşfetmek için bize istenir. Buna ek olarak, CD34, CD31 ^{Düşük Pos} VEGFR-3 ^Pos podoplanin ^Sıra LECS tespit etmek seçim markörleri için VEGFR-3 ve podoplanin ilave LEC popülasyonlarının özgüllüğünü geliştirmek için sıralama çok parametre kullanılmıştır.

Bu belirteçler seçme gerekçesi raporlarına dayandığını LECS ve kan vasküler endotelyal ce iseKan, vasküler endotel hücrelerinin ^21-23 ile karşılaştırıldığında LLS örneğin CD31 gibi ortak bir çok hücre yüzeyi işaretçileri vardır LECS CD34, podoplanin ve VEGFR-3 hücre yüzeyi marker salgılamasında fenotipik değişim gösterir. CD31 aynı zamanda trombosit endotel hücre adhezyon molekülü 1 (PECAM-1) olarak bilinen bir 130 kDa transmembran glikoproteindir. Bu kan ve lenf damarlarının ^21,24,25 her türlü ifade çünkü bir pan-endotelyal hücre belirteci olarak kabul edilir. CD34 en hematopoietik progenitör hücreler üzerinde 110 kDa transmembran glikoprotein mevcut olması ve hücreler, vasküler endotel hücrelerinin ve lenf damarlarına ²⁶ kaynaklanır.

VEGFR-3, vasküler endotelyal büyüme için alıcı, C ve D faktörleri fare embriyo gelişen damarları başlangıçta mevcut olmakla birlikte, transkripsiyon düzenlenir lenf tarifnamede aşağıdaki gibidir (SOX) -18, Cı Hicken SRY ilişkili HMG-kutusu faktörleri o valbumin u pstream.p. romoter t ranscription f aktör 2 (COUPTF-II) ve PROX-1, VEGFR-3 venöz sentezleme kaybolur ve embriyonik LECS ^25,27 sınırlı hale gelir. Podoplanin, 38 kDa zar mukoprotein, ilk fare embriyonik gelişim ²⁸ yaklaşık embriyonik lenfatik damarların gün 11 (~ E11.0) üzerine kaydetti ve şiddetle mikrovasküler lenf damarları, lenf malformasyonlar makrokistik lenfatik endotele göre podoplanin ifade ile ifade edilir iken ¹⁵ daha değişkendir. Deneyler en azından bazı CD34 ^Yüksek CD31 ^Pos endotel hücreleri lenfatik işaretleyici podoplanin ²⁹ ekspres öneririz Flow sitometri. İnsan lenfatik malformasyonlar LYVE-1 ve podoplanin boyama sistematik değerlendirme hem LYVE-1 ilk lenfatik güçlü mevcut olduğu bildirilmiştir, normal dokularda, lenfatik malformasyon endotelyumu ³⁰ boyama etkili olduğunu göstermesine rağmenkılcal endotel ancak azaltılmış ve toplama lenfatik endotele ³¹ bile yok. Amacımız izole etmek olduğundan hem biz seçtiniz başlangıç ​​ve toplama lenfatik endotel hücreleri, bizim hücre seçimi stratejisinin bir parçası olarak LYVE-1 kullanmak için değil. Son olarak, bu belirteçler kullanılması kararı da mikroskopik görüntülemesi için lenf damarlarına etiketlenmesi için, teşhis amacıyla kullanılır antikorların mevcudiyeti, akış sitometrisi ve imünoflöresan çalışmalar arasındaki ilişki olanak sağlayabilecek bir özelliği dayanıyordu.

Bu makale sünnet derisi ve lenfatik malformasyon gelen CD34 ^Düşük CD31 ^Pos VEGFR-3 ^Pos podoplanin ^Pos LECS başarılı izolasyonu yanı sıra CD34 ^Yüksek CD31 ^Pos VEGFR-3 ^Pos podoplanin ^Pos endotel hücreleri için gerekli doku sindirim yöntemi, hücre boyama ve FACS ayarlarını anlatacağız dokusu.

Protocol

Etik bildirimi: lenfatik malformasyon ve üstderi dokuların toplanması için etik onay Kraliyet Çocuk Hastanesi, Melbourne, Avustralya İnsan Araştırmaları Etik Kurullarının alındı. İmzalı rıza ameliyat öncesinde hastanın ebeveynleri alındı. Doku örnekleri seçmeli sünnet geçiren klinik yönetiminin bir parçası olarak cerrahi girişim geçiren İcracı ve hastaların tanısı olan hastalarda toplandı. Tüm deneyler Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi, Avustralya esaslara uygun olarak yapıldı.

Sünnet derisinin ve Lenfatik Malformasyon Dokular Hücre Süspansiyon 1. Hazırlık

1. Tamponlar ve Medya hazırlanması.
   1. EGM-2 medya ısınma ve yavaşça 37 ° C su banyosunda kit bileşenlerini çözülme piyasada mevcut EGM-2 MV Bullet Kit kullanarak tam endotel hücre ortamı hazırlayın. Sınıf II biyogüvenlik kabini içinde, aseptikEGM-2 medya her bileşeni ekleyin. Tüm bileşenler ortama ilave edilir, 'tam endotel hücre medya' olarak medyaya bakın. Kullanımdan önce muhtevanın karıştırılması için steril 50 ml pipet kullanın.
      Not: hücre kültüründe ilgili tüm adımlar bir sınıf II biyolojik tehlike kabini içinde gerçekleştirilir. Bütün çözeltiler, üreticinin talimatlarına uygun olarak 4 ° C'de muhafaza edilir ve kullanımdan önce, oda sıcaklığına kadar ısıtılır. Tam endotel hücre ortamı, hücre kültürü tampon ve enzim çözeltiler kullanımdan önce 20 dakika boyunca 37 ° C'de ısıtılır.
   2. 50 ng / ml VEGF-C ile birlikte endotel hücre ortamı Supplement. Kullanılana kadar 4 ° C 'de 50 ml steril tüp ve deposuna ilave endotelyal hücre ortamı kısım. 4 ° C'de depolanan ortam, en az 4 hafta süreyle stabildir.
   3. 8,752 g NaCl, 1.416 gr Na ₂ HPO çözülmesiyle kalsiyum ve magnezyum içermeyen fosfat tamponlu salin (PBS) Hazırlama ₄ .2H ₂ O veSu 1000 ml 0.395 gr KH ₂ PO _4. 7.4'e pH ayarlayın. Filtre 4 ° C'de 0.22 mikron filtre ve mağaza kullanarak PBS sterilize edin. (: 100 1 kullanılan) antibiyotik / antimikotik solüsyon ilave Kullanımdan önce.
   4. Insan fibronektin hazırlanması steril su, 10 ml fibronektin, 1 mg eritin. Mağaza -20 ° C'de 100 ul hacimde çözüm yeniden. Kullanım gün fibronektin kısım 100 ul steril PBS 10 ml üzerinde (10 ug / ml'lik bir son çalışma konsantrasyonu vermek üzere).
   5. Enzim ortam için, steril PBS içinde% 0.04 Dispase II,% 0.25 kollajenaz II ve 0.01% DNase I içeren bir solüsyon hazırlanır. İlk olarak, steril bir 50 ml tüp içinde dispaz ve kolajenaz, yer ağırlığı PBS gerekli hacmi ilave edin ve eritmek için, 37 ° C'de çalkalama ile 30 dakika boyunca inkübe edin. Bir kez biyogüvenlik kaput filtre sterilize (0.22 mikron filtre) dispase / kollajenaz çözümü, çözünmüş. Aseptik olarak 37 ° C 'de, DNase I depola kadar enzimatik çözeltisini ekleyinkullanın.
      NOT: DNase I steril iyofilleştirilmiş toz halinde temin edilebilen bir ticari bir hücre kültürü dereceli reaktifidir.

Üstderi ve Lenfatik malformasyonlarından hücre süspansiyonu 2. Hazırlık

1. DMEM /% 2 antibiyotik antimikotik çözelti 10 ml içeren 50 ml'lik bir tüp tartılır. Bu tüp, doku toplanması için kullanılır.
2. Lenfatik malformasyon ve üstderi dokuların cerrahi olarak çıkarılması ardından, aseptik hücre kültürü laboratuvarında buz üzerinde tüp ve transfer doku örneği ekleyin.
3. Doku içeren tüp tartılır ve doku ağırlığı hesaplayın. Doku sindirmek için gerekli enzimatik solüsyon hacmini hesaplamak için bu ağırlık kullanın.
4. Sınıf II biyogüvenlik kabini, 100 mm doku kültürü kabına doku ve medya aktarmak için steril forseps kullanabilir. Ince ~ 1 mm ³ parçaya doku kıyma steril makas kullanın.
5. Aktarım kıyılmış doku medya i ile karıştırılırSteril, DMEM /% 2 antibiyotik antimikotik solüsyon ek bir 10 ml içeren 50 ml'lik bir tüp nGoogle'a. Doku yeniden askıya tersine çevirerek karıştırın. 5 dakika boyunca 300 xg'de örnek santrifüjleyin.
6. Süpernatantı. Doku ağırlığı üzerine dayalı olarak, önceden ısıtılmış (37 ° C), kolajenaz II kıyılmış 100 mg doku başına düşen / DNase I / II sindirimi Dispase çözeltisi 1 ml. Genel olarak, kıyılmış dokusunun yaklaşık 1 g enzim çözeltisinin 10 ml kullanımı.
7. Sabit 200 rpm'de çalkalayarak 20-90 dakika boyunca 37 ° C kuluçka makinesi içinde doku inkübe edin. Bu sürenin sonunda, neredeyse tüm doku ince parçalara sindirilir emin olun.
   Not: birincil dokular etkiler, hücre hayatta kalması ile ilgili izolasyon zamanda kolajenaz ve dispase hücrelerin maruz kalma. Biz fibrotik lenfatik malformasyon örnekleri sindirim 60-90 dk gerektirebilir oysa çoğu yenidoğan sünnet derisi örnekleri optimal sindirim 20-30 dk gerektiren deneysel bulduk. LM LEC verims Mevcut fibrozis miktarı etkilenir, daha fibröz doku muhtemelen kolajenaz II ve dispase II uzun süre maruz kalmanın zararlı etkilerine daha az hücre elde edilmiştir.
8. Sindirme işlemini takiben, biyo-güvenlik kabinine tüp transferi ve steril bir 50 ml tüp içine yerleştirilmiş, bir 70 mikron süzgecinden Sindirilmiş doku çözeltisi geçmektedir. Hücre dışı matriks sadece küçük izleri gözlenmektedir kadar lastik piston ile 3 ml şırınga pistonu kullanarak, kalan doku eziyet.
9. Elekten geçirilmesi ve enzimleri inaktive yapışmış hücreler geri enzim orta ayrışan hacmine endotel hücre ortamı eşdeğer bir hacmi ile hücre süzgecinden yıkayın. Örneğin, kıyılmış doku sindirmek için enzim orta ayrışan 2 ml için, enzimleri inaktive endotel hücre orta 2 ml ekleyin.
10. 5 dakika boyunca 300 xg'de hücre çözümü Santrifüj ve süpernatant aspire. R> 10 ml PBS hücreler, e-askıya. 300 xg'de Santrifüj hücreleri5 dakika boyunca, daha sonra iki kez hücre yıkama tekrarlayın süpernatant kaldırmak. > Endotel hücre ortamının 20 ml hücre pelletini. Tripan mavisi daha sonra, tohum ile hücre sayımı, 2 x 10> 150 cm ⁶ hücre> ² şişeye endotel hücre ortamının 20 ml lik bir nihai hacim içinde, fibronektin ile önceden kaplanmış. Nemlendirilmiş kuluçka makinesi içinde% 5 CO> ₂ 37 ° C 'de kültür.>
    Not: Bu, tripan mavisi eksklüzyonu ile tahmin edildiği üzere çekirdekli hücrelerin% 75 -90% Doku sindirimi hayatta beklenmektedir. Başlangıç ​​hücre sayısı, hücre süspansiyonu içinde tüm çekirdekli hücreleri (yani keratinositler, lökositlerin, makrofajların, bağ dokusu hücreleri ve kan daman hücrelerinin) yansıtır. 5-7 gün hücre sayımı, ekli atlattı ve hücre kültürü sırasında çoğaldı hücreleri yansıtır. Fibronektin ile doku kültürü şişeleri Kaplama ayrıca müteakip LEC ve LM LEC sağkalım geliştirir.
11. Gece boyunca inkübasyondan sonra, P ile üç yıkamadan uzak bağlanmamış hücreleri yıkamakBS /% 1 antibiyotik-antimikotik çözelti ve taze endotel hücre ortamı ilave edin. Etkin bir şişede bulunan bağlanmamış hücreleri ve kırmızı kan hücreleri çıkarmak için üç yıkar yürütmek. Her ikinci gün medya değiştirin. Hücreler 5-7 gün sonra ~% 80 konfluent olacaktır.

Akım Sitometrisi için Lenfatik Endotel Hücre Yüzey markerleri Hücreleri 3. Antikor Boyama

1. Hücreler PBS ile% 80 izdiham, aspire orta ve durulama hücrelerini ulaşmıştır sonra.
2. Örneğin 150 cm, 37 ° C'de 5-7 dakika boyunca ² şişesi başına Accutase hücre ayrılma çözeltisi 7 ml ile inkübe edilmesi ile yapışmayan hücreler ayırın.
3. Hasat Ayrılan hücreler, endotelyal hücre ortamının 3 hacim ilave edilerek hücre kopması çözeltisi inaktive ve yeni bir steril tüpe hücre süspansiyonu aktarın.
4. 5 dakika boyunca 300 xg'de hücreleri santrifüjleyin.
5. Süpernatant aspire ve PBS 5 ml hücreleri yeniden askıya. 5 dakika boyunca 300 xg'de Santrifüj hücreleri, s kaldırmakupernatant daha sonra hücre yıkama tekrarlayın. PBS 5 ml hücrelerin yeniden askıya.
6. Canlı hücre sayısını. % 0.4 tripan mavisi 90 ul hücre süspansiyonu, 10 ul karıştırın. Bu süspansiyonun Transferi 10 ul sayım için hemasitometre.
   NOT: Nihai hücre verimi işlenmiş örneklem büyüklüğü bağlıdır. canlı hücreler 7 x 10 ^5-1,2 x 10 ⁶ 150 ^cm2 şişeye aralıkları her zamanki hücre verimi.
7. Hücre boyama antikor çözeltileri hazırlanır.
   Not: Aşağıdaki seyreltmeler 100 ul'lik bir boyama hacminde 1 x 10 ⁶ lekeleme için titre edildi.
   1. Seyreltik PE konjuge fare anti insan VEGFR-3 (01:50); PE-Cy7 konjüge fare anti insan konjuge CD34 (1: 200); APC-konjuge fare anti-insan CD31 (1: 100) ve Alexa 488-konjüge sıçan anti insan podoplanin (1: 200), 100 ul, doku numune başına steril% 5 FBS / PBS solüsyonu, toplam hacim içinde. Hazırlanması aşağıdakıAntikor çözeltisi, kullanılana kadar buz üzerinde tutun. Aynı şekilde kapılar akış sitometrisi ayarını kolaylaştıracak seyreltilmiş izotip kontrol antikor karışımı hazırlandı.
8. Antikorların bağlanma, spesifik olmayan azaltmak için, santrifüj hücreler 2 dakika boyunca 300 x g'de, yüzer madde daha sonra steril bir% 5 FBS / numune başına PBS çözeltisi lekeli 100 ul hücrelerin süspansiyonu çıkarın. 4 ° C'de 20 dakika süreyle buz üzerinde inkübe hücreleri.
9. 5 dakika boyunca 300 xg'de Santrifüj hücreleri, konjuge antikor kokteyli hücreleri askıya sonra yeniden süpernatant kaldırmak. Ayrıca 100 ul izotip kontrol antikor karışımı hücreleri (1 x 10 ⁵⁾ daha küçük bir kısım leke. 20 dakika boyunca buz üzerinde inkübe hücreleri.
10. , Bağlanmamış antikor kaldırmak 5 dakika boyunca 300 xg'de FBS / PBS çözüme ve Santrifüj hücreleri% 2 2 ml ekleyin. Süpernatantı aspire ve yıkama tekrarlayın.
11. Izotip kontrolü ve antikor lekeli örnek hücre pelletini / ml propidyum io 0.5 mg 300 ul sıralanacakdide /% 2 FBS / PBS solüsyonu. Sıralama kadar buz üzerinde tüpler yerleştirin.

4. Hücre Ayırma

1. Cihazı kurmak için aşağıdaki malzemeleri kullanın; örneğin Accudrop flüoresan boncuklar gibi ticari olarak temin edilebilen, floresan parçacıkların, fosfat-tamponlu tuzlu su bazlı kılıf sıvısı ve bırakma geciktirme boncuklar gibi hizalama boncuklar.
2. Çok parametreli floresans ile aktive edilen hücre tasnif cihazı üzerinde saflaştırılmış insan LECS izole edin. Cihazı Kurma ve üreticinin önerilerine göre hizalayın. Buna ek olarak, tazminat matris oluşturmak için her tür tek leke tazminat kontrolleri çalıştırmak ve böylece bu tür PE-Cy kanal içine PE olarak fluorochromes emisyon yoluyla önemli kanama ortadan kaldırmak için.
   NOT: 100 mikron nozul kullanılır ve hücreler endotel hücre ortama sıralanır eğer hücreler sıralanmış FACS daha yüksek bir oranda izolasyon hayatta.

5. Hücre Kültürü Mesaj FACS sıralaing

1. 5 dakika boyunca 300 xg'de sıralama, santrifüj hücreleri ardından. Süpernatantı aspire ve (hücrenin tohum için kullanılan balonun bağlı olarak) medya 5-10 ml hücreleri tekrar süspansiyon. En az 50.000 hücre kriteri ise, hücreler fibronektin kaplı 25 ^cm2 şişeye kültürlenmiştir.
2. Aksi takdirde, kültür% 5 _CO2, hava ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de 75 ^cm2 fibronektin kaplı şişede hücreleri. 2 gün sonra ortam değiştirin.
   NOT: Ortam değişiklikleri arasındaki süreyi uzatmak olmayan endotel hücrelerinin hayatta lehine görünüyor çünkü Hücre ortamı her ikinci gün değiştirilir. Hücreler daha fazla genişleme ¹⁵ ilk bölünmüş zaman PROX-1, VEGFR-3, podoplanin, CD34 ve CD31: Biz belirteçlerin immünohistokimyasal algılama kullanarak lenfatik endotel hücre fenotipi doğrulamak.

Results

Başlangıç ​​Doku sindirimi takiben, bölünmemiş örneklerin kültür 24 saat sonra, ayrı bir endotel hücre kolonileri bir araya fibroblast benzeri hücreler ve yumuşak kas hücreleri (Şekil 2A) gözlenebilir. Izlenerek ayırma ve hücre kültüründe 24 saat sonra CD34 ^Düşük CD31 ^Pos VEGFR-3 ^Pos podoplanin ^Sıra hücreleri ekleyin ve tipik arnavut morfolojisi (Şekil 2B ve C) göstermektedir. Yukarıda tarif edilen FACS yöntemi kullanarak, biz...

Discussion

LECS sıvı homeostazı, yabancı antijenler ve emilim ve bazı besin taşımaya bağışıklık karşılığının muhafaza edilmesinde önemli bir rol oynamaktadır. LEC homeostazı, örneğin bakteriyel enfeksiyonlar ve tümör metastazı gibi hastalık süreçlerinde etkilenebilir fakat LECS etkilenen hastalar için işlevsiz lenfatik damarların oluşumu ve önemli hastalıklara yol açtığı somatik mutasyonlara gelişebilir. In vivo implantasyonu ve ex vivo deney yoluyla lenfatik malformasyon etiyolojisi daha anlayışa ve yeni tedavi ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Yaşam Teknolojileri (Gibco)	11965-092	Ameliyathaneden doku örnekleri toplamak için kullanılır.
EGM-2 MV Bullet	Kit Lonza	CC-3202	EGM-2 MV Bullet Kit, 500 ml EBM-2 besiyeri ve insan EGF, hidrokortizon, gentamisin (GA-1000), fetal sığır serumu (FBS), VEGF, insan FGF-b, R3-IGF-1 ve askorbik asit içerir.
VEGF-C	Ar-Ge D Systems	2179-VC-025	Komple endotel hücre ortamı 50 ng/ml VEGF-C ile desteklenmiştir
Antibiyotik-antimikotik solüsyon (100x)	Life Technologies (Gibco)	15240-062	Bu solüsyon 10.000  U/ml penisilin, 10.000  mg / ml streptomisin ve 25  mg / ml Fungizone antimikotik. 1:100 seyreltmede kullanın.
İnsan plazmasından elde edilen fibronektin	Sigma-Aldrich	F2006	10 mg / ml konsantrasyonlarda kullanılır. 4 'de tutulursa 1 aya kadar tekrar kullanılabilir; ° C ve steril tutulur. 7  kullanın; 150 cm2 şişeyi kaplamak için ml.
StemPro Accutase Hücre ayrışma reaktifi	Yaşam Teknolojileri (Gibco)	A11105-01	StemPro® Accutase® şişenin tüm yüzey alanını kaplamak için cm2 başına 0,05 ml'de kullanılır. Daha az hacim kullanmak, eksik hücre ayrılmasına neden olabilir.
% 0.4 Tripan Mavi boya	Yaşam Teknolojileri (Gibco)	15250-061	Canlılık lekesi olarak kullanılır.
Dispase II	Roche Applied Biosciences	4942078001	0.04
Kollajenaz II'de	Worthington Lab	4176	%0.25 DNaz'da kullanılır
I	Roche Applied Biosciences	11284932001	%0.01
70 mm naylon hücre süzgeçlerinde	BD Falcon	352350
[header]
PE ile konjuge VEGFR-3 klonu 9D9F9, klon WM59	BioLegend	356204	1:50 seyreltmede
kullanılır PE-Cy7 konjuge CD34, klon 581	BioLegend	343516	1:200 seyreltmede
kullanılır APC konjuge fare anti insan CD31, klon WM59	BioLegend	303116,	1:100 seyreltmede kullanılır
Alexa 488 konjuge sıçan anti insan Podoplanin, klon NC-80.	BioLegend	337006	1:200 seyreltmede kullanılır
PE konjuge fare IgG1, k izotip, klon MOPC-21	BioLegend	400112	1:50 seyreltmede kullanılır
PE-Cy7 konjuge fare IgG1, k izotip, klon MOPC-21	BioLegend	400126	1:200 seyreltmede kullanılır
APC konjuge fare IgG1, k izotip, klon MOPC-21	BioLegend	400120	1:100 seyreltmede kullanılır
Alexa 488 konjuge fare IgG2a, k izotipi, klon RATK2758	BioLegend	400525	1:200 seyreltmede kullanılır