Method Article

Ekstrasellüler Veziküller Yalıtım ve Karakterizasyonu için kağıt tabanlı cihazlar

DOI:

10.3791/52722

⸱

April 3rd, 2015

 ,  ,  , 
1Institute of Nanoengineering and Microsystems, National Tsing Hua University, 2Taichung Veterans General Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, 10 kadar ul serum örneklerinden, hücre dışı veziküller (EVS), hücrelerden salınan küçük zar parçacıkları izole etmek için bir yöntem göstermektedir. Bu yaklaşım, ultra-santrifüj ihtiyacını önlediği deney süresi sadece birkaç dakika sürer ve sınırlı hacim örneklerinden EV'lerin izolasyonunu sağlar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ekstrasellüler veziküller (AGH), hücrelerin çeşitli salınan zar parçacıklar, klinik uygulamalar için büyük bir potansiyele sahip. Onlar nükleik asit ve protein kargo içeren ve giderek ökaryotun ve prokaryot hücreler hem tarafından kullanılan arası bir iletişim aracı olarak kabul edilmektedir. Bununla birlikte, küçük boyutları için, EV'lerin izolasyonu için mevcut protokoller genellikle, zaman alıcıdır, zaman alıcıdır, ve bu, bir ultra santrifüj gibi büyük örnek hacimleri ve pahalı ekipman gerektirmektedir. Bu sınırlamaları gidermek için, biz, kolay, verimli ve 10 ul kadar düşük örnek hacimleri gerektiren EVs alt grupları ayırmak için kağıt tabanlı imünoafinite platformu geliştirdi. Biyolojik numuneler, kimyasal olarak belirli EV yüzey belirteçleri yüksek afiniteye sahip yakalama molekülü ile değiştirilmiş kağıdı test bölgeleri doğrudan pipetle edilebilir. Biz taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile tahlil doğrulamak, kağıt-tabanlı enzim-bağlı immunosorbent tahlilleri (p-ELISA) ve transcriptome analizi. Bu kağıt-tabanlı cihazlar sağlık ve hastalık EV fonksiyonları anlayışımızı ilerletmek yardımcı klinik ve araştırma ortamında EVs çalışma sağlayacaktır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre dışı veziküller (EV'ler), boyutları 40 nm ile 5.000 nm arasında değişen ve farklı biyogenez yolları1-9 yoluyla birçok hücre tipi tarafından aktif olarak salınan heterojen membranöz parçacıklardır. Ebeveyn hücrelerden benzersiz ve seçilmiş DNA, RNA, protein ve yüzey belirteçleri alt kümelerini içerirler. Hücreler arası iletişim10, bağışıklık modülasyonu11, anjiyogenez12, metastaz12, kemorezistans13 ve göz hastalıklarının gelişimi9 gibi çeşitli hücresel süreçlere katılımları giderek daha fazla tanınmakta ve tanısal, prognostik, terapötik ve temel biyoloji uygulamalarındaki faydalarına büyük ilgi uyandırmaktadır.

EV'ler klasik olarak biyogenezlerine veya hücresel kökenlerine göre eksozomlar, mikro-parçacıklar, apoptotik cisimler, onkozomlar, ektozomlar, mikropartiküller, telerozomlar, prostatozomlar, kardiyozomlar ve veksozomlar vb. olarak kategorize edilebilir. Örneğin, eksozomlar multiveziküler cisimlerde oluşurken, mikro-parçacıklar doğrudan plazma zarından tomurcuklanarak üretilir ve apoptotik veziküller apoptotik veya nekrotik hücrelerden gelir. Bununla birlikte, isimlendirme, kısmen EV'lerin kapsamlı bir şekilde anlaşılmaması ve karakterizasyonunun olmaması nedeniyle hala rafine edilmiştir. EV'leri saflaştırmak için ultrasantrifüj14, ultrafiltrasyon15, manyetik boncuklar16, polimerik çökeltme17-19 ve mikroakışkan teknikler20-22 dahil olmak üzere çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. EV'leri saflaştırmak için en yaygın prosedür, büyük döküntüleri ve diğer hücresel kirleticileri gidermek için bir dizi santrifüjleme ve/veya filtrelemeyi ve ardından pahalı, sıkıcı ve spesifik olmayan bir işlem olan son bir yüksek hızlı ultrasantrifüjlemeyi içerir14,23,24. Ne yazık ki, EV'lerin tatmin edici saflık ve verimlilikle hızlı ve güvenilir bir şekilde izole edilmesine yönelik teknolojik ihtiyaç henüz karşılanmamıştır.

EV'lerin alt gruplarını izole etmek ve karakterize etmek için basit, zaman ve maliyet tasarrufu sağlayan, ancak verimli bir yol sağlayan kağıt tabanlı bir immünoaffinite cihazı geliştirdik22. Belirli bir şekle kesilmiş selüloz kağıt, kayıtlı açık deliklere sahip iki plastik levha kullanılarak düzenlenebilir ve lamine edilebilir. Hidrofobik balmumu veya polimerler25-27 basarak kağıt bazlı cihazlarda sıvı sınırını tanımlamaya yönelik genel stratejinin aksine, bu lamine kağıt desenleri etanol de dahil olmak üzere birçok organik sıvıya karşı dirençlidir. Kağıt test bölgeleri, EV alt grupları üzerindeki spesifik yüzey işaretleyicilerine yüksek afiniteye sahip yakalama moleküllerinin (örneğin, hedefe özgü antikorlar) kararlı ve yoğun bir şekilde kapsanmasını sağlamak için kimyasal olarak modifiye edilir. Biyolojik numuneler doğrudan kağıt test bölgelerine pipetlenebilir ve saflaştırılmış EV'ler durulama adımlarından sonra tutulur. İzole edilmiş EV'lerin karakterizasyonu SEM, ELISA ve transkriptomik analiz ile gerçekleştirilebilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Operasyon prosedürünün genel şeması Şekil 1'de verilmiştir. Etik uygulamaları kullanarak, (sağlıklı bireylerde kan örnekleri toplandı ve İDD protokolleri onayladı Tayvan altında Taichung Gaziler General Hospital (TCVGH), Taichung aracılığıyla hastaların sulu mizah örnekleri elde KİK TCVGH No CF11213-1).

Kağıt Cihazların İmalatı 1.

  1. 96 oyuklu bir mikrotitre plakası gibi aynı düzeni sağlamak için, çapı 5 mm olan daireler halinde kromatografi kağıdı kesin. Kayıtlı geçiş delikleri, ve laminat iki polistren levhalar ile bu kağıt parçalarını sandviç.
  2. Aşağıdaki 28 adımları açıklanan kimyasal konjugasyon yöntemi kullanarak kağıt cihazları değiştirin.
    1. Bir plazma odasında oksijen plazmanın (100 mW, 1% oksijen, 30 sn) ile kağıt cihazları davranın.
      DİKKAT: 3-merkaptopropil trimetoksisilan ve N -γ-maleimidobutiriloksi sukkinimid ile çalışırken özel dikkat alınmalıdıresteri (GMBS), her ikisi de neme duyarlı ve zehirli olduğundan. Koruyucu eldiven giyin ve solumaktan kaçının veya deri ve göz ile temas. Sıkıca kapalı stok şişe tutun ve su yoğunlaşmasını önlemek için açmadan önce oda sıcaklığına gelmesini bekleyin. Seçenek olarak ise, bir azot doldurulmuş eldiven torbası ya da kutu içinde hazır şişe açın. Küçük şişelere içine kısım stok şişe sık açılmasını önlemek için.
    2. Hemen 30 dakika süreyle etanol (200 proof) içinde 3-merkaptopropil-trimetoksi silan bir% 4 (hacim / hacim) çözeltide kağıt cihazları tedavi inkübe edin.
    3. Etanol ile kağıt cihazları yıkayın ve 15 dakika boyunca etanol içerisinde 0.01 umol / ml GMBS ile inkübe edilir.
    4. Etanol (200 proof) içinde yıkayın ve 4 ° C 'de 1 saat süre ile, fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde 10 ug / ml avidin çözeltisi ile kağıt cihazları inkübe edin. 4 ° C'de muhafaza eğer ihtiyaç ve 4 hafta içinde kullanın.
  3. (BSA 10 ul PBS sığır serumu albümini (ağ / hac),% 1 ihtiva eden her kağıdı test bölgeleri Islak) 3 x 10 dakika için yakalama molekülü biyotinile edilmiş 10 ul tespit önce 3 x 10 dakika karıştırıldı. Veya anneksin V (01:20, anneksin V bağlanması tampon içinde hac / hac), anti-CD63 antikoru kullanarak (PBS ağırlık / hacim) BSA ve% 0.09 (a / h) sodyum azid (w% 1 ihtiva eden 20 ug / ml) yakalama molekülleri.
  4. PBS sırasıyla, 3 x 1 dakika süreyle tampon çözeltileri bağlayıcı BSA veya anneksin V (ağ / hac),% 1 ihtiva eden tekabül eden 10 ul kullanılarak bağlanmamış anti-CD63 antikoru ya da bunun anneksin V molekülleri durulayın.

2. Serum ve Sulu Mizah Örnek Toplama ve İşleme

  1. Serum koleksiyon.
    1. Serum ayırma tüpleri Venipunktür periferik kan 10 ml toplayın ve hafifçe tüpü beş kez ters çevirin. Dikey konumda tüp ayarlama ve 30 dakika boyunca bekleyin.
    2. 15 dakika boyunca 1.200 × g santrifüj. 30 dakika süre ile 3000 x g 'de daha temiz bir tüpe üst tabakadan serum, ve santrifüj aktarın.
    3. 0.8 mikron fil ile süpernatant geçmekter. Kullanılana kadar -80 ° C'de örnek tutun.
  2. Sulu mizah koleksiyonu: kullanana kadar -80 ° C'de doğrudan prosedürler ve mağaza örnekleri invaziv aracılığıyla bir göz hekimi tarafından tanısı konulan hastalarda sulu mizah örnekleri toplamak.

Ekstrasellüler Veziküller 3. İzolasyonu

  1. 5 ul / dakikalık bir oranda, her bir kağıt test bölgesi üzerine Noktası örnekler.
  2. BSA veya anneksin V sırasıyla, anti-CD63 antikoru ya da bunun anneksin V molekülleri ile işlevselleştirilmiş kağıt cihazlar için 3 x 1 dakika süreyle tampon çözeltileri bağlanması (w / v) PBS,% 1 ihtiva eden tekabül eden 10 ul bağlanmamış EV'lerini durulayın. Aşağıdaki mansap deneyler yapın.

4. Alt Analiz Örneği 1: Tarama Electromicrographs

  1. 10 dakika için 10 ul 0.5 × Karnovsky en fiksatif kullanarak Fonksiyonlu kağıt testi bölgesinde çekilen AGH Fix.
  2. 2 × 5 dakika için yeterli PBS ile örnekleri durulayın.
  3. Kurutmak10 dakika sonra 2 x 10 dakika boyunca% 50 etanol, 2 x 10 dakika boyunca% 70 etanol, 2 x 10 dakika boyunca% 95 etanol ve 4 x 10 dakika boyunca% 100 etanol daha sonra% 35 etanol ile örnekler.
  4. Kuru Kritik ve kaplamaz paladyum / altın örnekleri sputter ve düşük elektron ivme geriliminde çalışan bir taramalı elektron mikroskobu kullanarak incelemek (~ 5 kV).

5. Aşağı Analiz Örneği 2: Paper-based ELISA

  1. 1 de, anti-CD9 birincil antikor ihtiva eden bir 5 ul çözeltisi ekleyin: 1000 seyreltme, PBS içinde yakalanan EV'lerini ihtiva eden, her bir test bölgesine. 1 dakika bekleyin.
  2. PBS 30 saniye boyunca 100 rpm'de çalkalandı ml 30 ile örnekleri durulayın.
  3. 5 ul çözüm içeren yaban turpu peroksidaz (HRP) 1 ikincil antikor -bağlanmış ekle: PBS 1.000 seyreltme ve 1 dakika bekleyin.
  4. PBS 30 saniye boyunca 100 rpm'de çalkalandı ml 30 ile örnekleri durulayın.
  5. Hidrojen peroksit An 1 hacim oranı: 1 ihtiva eden bir 5 ul kolorimetrik alt-tabakanın eklemed 3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidin (TMB) ve bir masaüstü tarayıcı kullanarak tarayın.

6. Alt Analiz Örneği 3: RNA İzolasyon

  1. Yakalanan AGH parçalamak için bağlayıcı tampon / polivinilpirrolidon-tabanlı RNA izolasyonu yardımı 35 ul ve lizis 265 ul örnekleri daldırın. Vortex şiddetle.
  2. Lizata izolasyon kiti sağlanan 30 ul Homojenat ekleyin. Vortex şiddetle ve 10 dakika süreyle buz koymak.
  3. Aşağıdaki adımlarda tarif edilen asit, fenol-kloroform ayırıcısı kullanılarak RNA ekstrakte edin.
    1. Şişenin alt tabakasından fenol-kloroform 330 ul alın ve homojenat / lizat ekleyin. Vortex şiddetle.
    2. 5 dakika boyunca 10,000 x g'de santrifüjleyin. Temiz bir tüp sulu (üst) faz aktarın ve kaldırıldı hacmi not.
  4. Önceki adımda ve co uzaklaştırıldı, sulu faz 1.25 katı hacim hacim% 100 etanol ile total RNA çökeltilmesi95 ° C'ye kadar ön ısıtmaya tabi elüsyon çözeltisi RNA'yı llect.
  5. Konsantre hale getirin ve bundan başka, imalatçının protokolüne göre bir RNA temizleme kiti kullanılarak RNA'yı saflaştırmak.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EVs alt grupları izole kağıt cihazın yeteneği verimli EV yüzey belirteçlerinin onun duyarlı ve özgül tanıma dayanır. yakalama molekülü ile kağıt liflerinin stabil bir modifikasyonunun başka bir yerde tarif edildiği gibi 28-30 avidin-biyotin kimyası kullanılarak elde edilir. fiziksel adsorpsiyon yöntemi kimyasal birleşme etkinliği ve floresans bazlı Bilgilerini kullanılarak değerlendirilir. Kağıt test bölgeleri aşama 1.3'de 20 ug / ml florofor R-fikoeritrin-konjüge biyotin-molekülü (PE-biyotin) ile değiştirild...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

dışı keseciklerin alt başarılı izolasyonu için en kritik adımlar şunlardır: kağıt 1) iyi bir seçim; Kağıt liflerinin yüzeyi üzerinde yakalama moleküllerinin 2) sabit ve yüksek kapsamı; 3) Numunelerin doğru kullanımı; ve 4), genel laboratuar hijyen uygulaması.

Gözenekli malzemeler, çok ucuz ve ekipman içermeyen deneylerde kullanılmıştır. Bu ayarlanabilir bir gözenek boyutu, çok yönlü özelliğe, düşük maliyet ve yüksek yüzey-hacim oranı, sıvıların pasif fitillenmesini izin olabilir. Biz esas ol...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını olduğunu beyan ederim.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Tayvan Ulusal Bilim Konseyi grants- MGK 99-2320-B-007-005-my2 (CC) ve MGK 101-2628-E-007-011-My3 (CMC), ve Gaziler Genel kısmen desteklenmiştir Hastaneler ve Tayvan Ortak Araştırma Programı Üniversite Sistemi (CC).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Kromatografi KağıdıGE Healthcare Yaşam Bilimleri3001-861Whatman® 1. sınıf selüloz kağıt
(3-Merkaptopropil) trimetoksisilanSigma Aldrich175617Bu kimyasal su ve nem ile reaksiyona girer ve nitrojen dolu bir eldiven torbası içine uygulanmalıdır. Göz ve cilt temasından kaçının. Dumanları solumayın veya buharları solumayın.
EtanolFisher ScientificBP2818Mutlak, 200 Kanıtlı, moleküler biyoloji sınıfı
Sığır serum albümini (BSA)BioShop Canada Inc.ALB001Genellikle Cohn fraksiyonu V olarak adlandırılır.
N-γ-maleimidobütiriloksi süksinimid ester (GMBS)Pierce Biotechnology22309GMBS, bir amin-sülfhidril çapraz bağlayıcıdır. GMBS neme duyarlıdır.
AvidinPierce Biyoteknoloji31000NeutrAvidin, biyotin için 4 bağlanma bölgesine sahiptir ve pI değeri 6.3'tür, bu da doğal avidin'den daha nötrdür
Biyotinillenmiş fare anti-insan anti-CD63Ancell215-030klonu AHN16.1 / 46-4-5
biyotinile annexin VBD Biosciences556418Annxin V, fosfatidilserin (PS) için yüksek bir afiniteye sahiptir
Birincil anti-CD9 ve ikincil antikorSistemi BiosciencesEXOAB-CD9A-1İkincil antikor yaban turpu perokside konjuge
Serum ayırma tüpleriBD Biosciences367991Pıhtı aktivatörü ve serum ayırma jeli
Annexin V bağlayıcı tamponBD Biosciences55645410x; Kullanmadan önce 1x'e seyreltin.
TMB substrat reaktif setiBD Biosciences555214Set, hidrojen peroksit ve 3,3',5,5'-tetrametilbenzidin (TMB)
[header]
RNA izolasyon kitiiçerir Yaşam TeknolojileriAM1560MirVana RNA izolasyon kiti
Polivinilpirolidon bazlı RNA izolasyon yardımcısıYaşam TeknolojileriAM9690Bitki RNA izolasyon yardımcısı, polisakkaritlere bağlanan polivinilpirolidon (PVP) içerir.
RNA temizleme kitiQiagen Inc.74004MinElute RNA temizleme kiti, 45 'ye kadar saflaştırma için tasarlanmıştır; μ g RNA'dır.
Plazma odasıMarch InstrumentsPX-250
Taramalı elektron mikroskobuHitachi Ltd.S-4300
Masaüstü tarayıcıHewlett-Packard CompanyPhotosmart B1108 bit renkli görüntüler yakalandı. Fotoğraf makineleri ve akıllı telefonlar da kullanılabilir.
Görüntü kayıt sistemiJ& H Technology CoGeneSys G:BOX Chemi-XX816 bit fluroscence görüntüleri yakalandı. Fluroscence mikroskopları da kullanılabilir.
.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Caby, M. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma. Int. Immunol. 17, 879-887 (2005).
  2. Lasser, C., et al. Human saliva, plasma and breast milk exosomes contain RNA: uptake by macrophages. J. Transl. Med. 9, 9(2011).
  3. Raj, D. A. A., Fiume, I., Capasso, G., Pocsfalvi, G. A multiplex quantitative proteomics strategy for protein biomarker studies in urinary exosomes. Kidney Int. 81, 1263-1272 (2012).
  4. Wiggins, R. C., Glatfelter, A., Kshirsagar, B., Brukman, J. Procoagulant activity in normal human-urine associated with subcellular particles. Kidney Int. 29, 591-597 (1986).
  5. Admyre, C., et al. Exosomes with immune modulatory features are present in human breast milk. J. Immunol. 179, 1969-1978 (2007).
  6. Keller, S., Ridinger, J., Rupp, A. K., Janssen, J. W. G., Altevogt, P. Body fluid derived exosomes as a novel template for clinical diagnostics. J. Transl. Med. 9, 86(2011).
  7. Asea, A., et al. Heat shock protein-containing exosomes in mid-trimester amniotic fluids. J. Reprod. Immunol. 79, 12-17 (2008).
  8. Bard, M. P., et al. Proteomic analysis of exosomes isolated from human malignant pleural effusions. Am. J. Resp. Cell Mol. Biol. 31, 114-121 (2004).
  9. Perkumas, K. M., Hoffman, E. A., McKay, B. S., Allingham, R. R., Stamer, W. D. Myocilin-associated exosomes in human ocular samples. Exp. Eye Res. 84, 209-212 (2007).
  10. Anderson, H. C., Mulhall, D., Garimella, R. Role of extracellular membrane vesicles in the pathogenesis of various diseases, including cancer, renal diseases, atherosclerosis, and arthritis. Lab. Invest. 90, 1549-1557 (2010).
  11. Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119, 756-766 (2012).
  12. Grange, C., et al. Microvesicles released from human renal cancer stem cells stimulate angiogenesis and formation of lung premetastatic niche. Cancer Res. 71, 5346-5356 (2011).
  13. Jaiswal, R., et al. Microparticle-associated nucleic acids mediate trait dominance in cancer. Faseb. J. 26, 420-429 (2012).
  14. Thery, C., Clayton, A., Amigorena, S., Raposo, G. Current protocols in cell biology. Morgan, K. K. (UNIT 3.22), John Wiley. New York, NY. (2006).
  15. Rood, I. M., et al. Comparison of three methods for isolation of urinary microvesicles to identify biomarkers of nephrotic syndrome. Kidney Int. 78, 810-816 (2010).
  16. Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer. Gynecol. Oncol. 110, 13-21 (2008).
  17. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J. Extracellular Vesicles. 2, 20360(2013).
  18. Fernandez-Llama, P., et al. Tamm-Horsfall protein and urinary exosome isolation. Kidney Int. 77, 736-742 (2010).
  19. Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Ravi, R. K., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney Int. 82, 1024-1032 (2012).
  20. Chen, C., et al. Microfluidic isolation and transcriptome analysis of serum microvesicles. Lab. Chip. 10, 505-511 (2010).
  21. Davies, R. T., et al. Microfluidic filtration system to isolate extracellular vesicles from blood. Lab. Chip. 12, 5202-5210 (2012).
  22. Chen, C., et al. Paper-based immunoaffinity devices for accessible isolation and characterization of extracellular vesicles. Microfluid. Nanofluid. 16, 849-856 (2014).
  23. Lamparski, H. G., et al. Production and characterization of clinical grade exosomes derived from dendritic cells. J. Immunol. Methods. 270, 211-226 (2002).
  24. Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. Discrimination between exosomes and HIV-1: Purification of both vesicles from cell-free supernatants. J. Immunol. Methods. 338, 21-30 (2008).
  25. Carrilho, E., Martinez, A. W., Whitesides, G. M. Understanding wax printing: a simple micropatterning process for paper-based microfluidics. Anal. Chem. 81, 7091-7095 (2009).
  26. Dungchai, W., Chailapakul, O., Henry, C. S. Electrochemical detection for paper-based microfluidics. Anal. Chem. 81, 5821-5826 (2009).
  27. Glavan, A. C., et al. Omniphobic 'R-F paper' produced by silanization of paper with fluoroalkyltrichlorosilanes. Adv. Funct. Mater. 24, 60-70 (2014).
  28. Usami, S., Chen, H. H., Zhao, Y. H., Chien, S., Skalak, R. Design and construction of a linear shear-stress flow chamber. Ann. Biomed. Eng. 21, 77-83 (1993).
  29. Murthy, S. K., Sin, A., Tompkins, R. G., Toner, M. Effect of flow and surface conditions on human lymphocyte isolation using microfluidic chambers. Langmuir. 20, 11649-11655 (2004).
  30. Cras, J. J., Rowe-Taitt, C. A., Nivens, D. A., Ligler, F. S. Comparison of chemical cleaning methods of glass in preparation for silanization. Biosens. Bioelectron. 14, 683-688 (1999).
  31. Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nat. Rev. Immunol. 2, 569-579 (2002).
  32. Scanu, A., et al. Stimulated T cells generate microparticles, which mimic cellular contact activation of human monocytes: differential regulation of pro- and anti-inflammatory cytokine production by high-density lipoproteins. J. Leukocyte Biol. 83, 921-927 (2008).
  33. Inal, J. M., et al. Microvesicles in health and disease. Arch. Immunol. Ther. Ex. 60, 107-121 (2012).
  34. Fridley, G. E., Holstein, C. A., Oza, S. B., Yager, P. The evolution of nitrocellulose as a material for bioassays. Mrs Bull. 38, 326-330 (2013).
  35. Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell. Mol. Life Sci. 68, 2667-2688 (2011).
  36. Missoum, K., Belgacem, M. N., Bras, J. Nanofibrillated cellulose surface modification: a review. Materials. 6, 1745-1766 (2013).
  37. Kalia, S., Boufi, S., Celli, A., Kango, S. Nanofibrillated cellulose: surface modification and potential applications. Colloid Polym. Sci. 292, 5-31 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Extracellular VesiclesPaper based DeviceImmunoaffinity IsolationScanning Electron MicroscopyP ELISATranscriptome AnalysisCD63 AntibodyAqueous HumorSerum ProcessingRNA Extraction

Related Articles