Protein sentezi kontrolü esas olarak translasyon başlatma adımında gerçekleşir, eksiklikler çeşitli bozukluklarla bağlantılıdır. Etiyolojilerini daha iyi anlamak için, burada translasyon başlatma faktörü eIF4G1'in bir mutantının varlığında mos transkriptinin translasyonunu değerlendiren Xenopus laevis oositlerini kullanan bir protokol tanımladık.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Ksenopus Translation Düşüklüğü Belirlemek için Bir Model Olarak laevis
Bu makalede
Özet
Özet
Protein sentezi, çeşitli biyolojik süreçleri çevresel koşullara özellikle adaptasyon etkileyen gen ifadesi temel bir süreçtir. MRNA başlangıç kodonu da dahil olmak üzere ilgili eIF4G1 başlatma faktörü ribozomal alt birimlerinin düzenlenmesine içeren başlangıç aşaması. Çevirinin bu oran sınırlayıcı bir aşama kusurlar, çeşitli bozuklukları ile bağlantılıdır. Bu tür özerkleştirmeler olası sonuçlarını incelemek için, Xenopus oositler insanla temel hücresel ve moleküler mekanizmaları korunması yüksek derecede çekici bir model teşkil laevis. Buna ek olarak, mayoz olgunlaşma sırasında, oosit transkripsiyonel bastırılmış ve gerekli tüm proteinleri önceden var, maternal mRNA'lardan çevrilir. Bu ucuz modeli etkin bir çeviri ile mükemmel entegre olmak için eksojen mRNA sağlar. Burada (eIF4G1 here) ilgi konusu bir faktör ile çeviri değerlendirmek stor kullanmak için bir protokol açıklananİlk olduklarını anne mRNA ed poliadenile ve fizyolojik okuma olarak oosit olgunlaşması sırasında tercüme edilecek. İlk başta, mRNA ilgi plazmidler (buradan eIF4G1) in vitro transkripsiyonu ile sentezlenmiş oluşum safhası torbacığı yarılmasının tespiti ile oosit ve oosit olgunlaşma kinetiği enjekte edilir belirlenir. Çalışılan anne mRNA hedef, serin / treonin protein kinaz mos olup. Bu poliadenilasyon ve daha sonraki için oosit olgunlaşmasında yer alan sinyalleme kaskadında mos proteinlerinin ekspresyonu ve fosforilasyon ile birlikte incelenmiştir. Geçerli protokol Varyasyonları ortaya koymak için öteleme kusurları da genel uygulanabilirliğini vurgulamak için önerilmiştir. Anormal protein sentezinin nörolojik bozuklukların patogenezinde olabilir dair kanıtlar ortaya ışığında, böyle bir model kolayca bu bozukluğunu değerlendirmek ve yeni hedefler belirlemek için bir fırsat sunuyor.
Giriş
Proteinler organizmanın daha büyük ölçekte temel hücresel yaşam elemanları ve bu nedenle bulunmaktadır. Onlar yapısı, ulaşım, reaksiyon kataliz, yönetmelik, gen ifadesi vb Onların ifade protein içine bir mRNA'nın dönüşümünü sağlayan çeviri karmaşık bir mekanizmanın sonucudur içeren hücresel fonksiyonlarının çoğunu sağlamaktadır. Için uyarlamak ve gelişme ve farklılaşma, yaşlanma, fizyolojik baskılara ya da patolojik seyri sırasında, hücre ihtiyaçlarına göre gen ifadesini düzenlemek için çeşitli kontroller tabi tutulur.
Kap-bağımlı, kap-bağımsız İç Ribozom Giriş Segment (IRES) yapıları ve kap-Bağımsız Çeviri arttırıcılar (via:....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm Xenopus deneyleri laboratuvar hayvanları deney için Avrupa Topluluğu Konseyi yönergelerine (86/609 / EEC) kurallarına göre Lille 1 Üniversitesi'nin hayvan tesisinde gerçekleştirildi. Hayvan protokolü (Comité d'Ethique en Deneme Animale Nord-Pas-de-Calais CEEA 07/2010) yerel kurumsal inceleme kurulu tarafından onaylanmıştır.
1. Oosit İşleme
- Anestezik hazırlayın: steril su, bir 1 L tricaine metan sülfonat tozu 1 g çözülür.
- Kadın Xenopus bu çözüm içine laevis Dalma, kaçış önlemek ve hayvan tamamen (bir bacak tutam herhangi bir tepki olmadan) sedasyon olmak için yaklaşık 45 dakika be....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
PG stimülasyon 24 saat (Şekil 2B, 2C) sonra, Xenopus oositlerde ve yüzde oosit GVBD belirlenmesi kinetik olgunlaşma
EIF4G1-DN mutasyon translasyon sonuçlarını incelemek için, Xenopus PG'ye yanıtı (2 H, O, GFP) eIF4G1-WT ve diğer kontrol koşulları mukayese edilir cRNA eIF4G1-DN microinjected oosit laevis. Kontroller bakılmaksızın enjekte cRNA veya eIF4G1 aşın doğanın oosit mikroenjeksiyon insidansını değerlendirmek için etkinleştirin........
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Tercüme birkaç nörodejeneratif hastalıklar dahil olmak üzere sayısız insan bozukluklarının patofizyolojisinde rol bir mekanizmadır. Parkinson hastalığında Örneğin çeşitli raporlar kalıtsal mutasyonlara 8,12,13 ile bağlantılı tercüme edilen değer göstermiştir.
Çeşitli hücresel modeller çeviri incelemek için kullanılabilir. Burada, eIF4G1 ve eIF4E mümkün 8 arasındaki etkileşimi azaltmak gibi baskın negatif mutasyonu hareket eIF4G1 bir mutasyon translasyonel sonuçlarını in.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Teşekkürler
Bu araştırma, INSERM, Lille Üniversitesi 1, Lille Üniversitesi, Lille 2 Üniversitesi, Lille Bölge Hastanesi Merkezi (CHR de Lille) tarafından desteklenmiştir. MCCH, Fondation de France'ın desteğini kabul eder ve IRCL'ye, V5-plazmitlerin hediyesi için Pr. Sonenberg'e, anti-GFP antikorlarının hediyesi için Dr. Dissous'a (Pasteur Enstitüsü, Lille), Xenopus oositlerinin satın alındığı UMS 3387'ye (Rennes Üniversitesi) ve el yazması metnin eleştirel okuması için Dr Taymans'a (JPArc, Lille) teşekkür eder.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Trikain metan sülfonat | Sandoz | MS-222 | oosit taşıma |
| Forseps | Moria | Dumont MC40 | |
| Streptomisin / penisilin | Sigma | 781 | |
| Sodyum piruvat | Sigma | P2256 | |
| Soya fasulyesi tripsin inhibitörü | Sigma | T9128 | |
| Tetrasiklin | Sigma | T7660 | |
| Veteriner emilebilir Vicryl ipliği | Johnson & Johson Intl | JV1205 | |
| Kollajenaz A | Roche teşhisi | 10103586001 | |
| PmeI | New England Biolabs | R0560S | Sentetik mRNA |
| DNAse/RNAse içermeyen H2O | Life Technologies'in | 10977 | |
| Sodyum Asetat | Merck | 6268 | |
| Mutlak etanol | Sigma | 02854 | |
| Nano Damla | Termo Bilimsel | ||
| TBE 10X | Eppendorf | 0032006.507 | |
| Etidyum bromür 10 mg / ml | Yaşam Teknolojileri | 15585-011 | |
| mMESSAGE mMACHINE Kiti | Ambion by Life Technologies | AM1344 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| EDTA | Fluka | 03609 | |
| Agarose | Life Technologies | 16500-500 | |
| Formaldehit %37 | Merck | 1.04003.1000 | |
| Formamid | Fluka | 47671 | |
| Jel Doc Görüntüleyici | Biorad | ||
| Oosit Pipeti, 100 8" Cam Kılcal Damarlı | Drummond Scientific Company | 3-000-510-X | mikroenjeksiyon |
| Yedek Cam 8 " | Drummond Scientific Company | 3-000-210-G8 | |
| 0.45 & m filtre | Millipore | SLHA025NB | |
| Progesteron | Sigma | P0130 | |
| Hepes | Sigma | H3375 | Batı Lekesi |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| SDS | Biorad | 161-0301 | |
| MgCl2< / sub> | Sigma | A3294 | |
| Sığır serum albümini | Sigma | A4612 | |
| leupeptin | Sigma | L8511 | |
| aprotinin | Sigma | A1153 | |
| benzamidin | Sigma | B6506 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| sodyum vanadat | Sigma | S6508 | |
| Laemmli tamponu | Biorad | 161-0737 | |
| NuPAGE Novex %4-12 Bis-Tris Protein Jelleri, 1.0 mm, 15 kuyulu | Yaşam Teknolojileri | NP0323BOX | |
| SDS-PAGE elektroforezi, mini-Protean TGX | Biorad | 456-1036 ve -1096 | |
| yatay yarı kuru lekeleme sistemi | W.E.P. Compagny | ||
| Glycine | Biorad | 161-0718 | |
| Tris-HCl | Biorad | 161-0719 | |
| Hybond ECL Membran | Amersham Yaşam Bilimleri | 10401180 | |
| Metanol | VWR | 20846-292 | |
| Ponceau Kırmızı (%0,5) | Sigma | P3504 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| anti-GFP | Yaşam Teknolojileri | A11122 | |
| anti-V5 | Santa Cruz Biyoteknoloji | sc-58052 | |
| anti-Eg2 | Noel Baba Cruz Biyoteknoloji | sc-27884 | |
| anti-Eg2-P | Hücre Sinyalizasyonu | C39D8 | |
| anti-ERK2 | Santa Cruz Biyoteknoloji | sc-1647 | |
| anti-ERK2-P (Tyr204) | Santa Cruz Biyoteknoloji | sc-7976 | |
| anti-RSK | Santa Cruz Biyoteknoloji | sc-231 | |
| anti-mos | Santa Cruz Biyoteknoloji | sc-86 | |
| anti-fare yaban turpu peroksidaz etiketli ikincil antikor | Santa Cruz Biyoteknoloji | SC-2005 | |
| anti-tavşan yaban turpu peroksidaz etiketli ikincil antikor | Santa Cruz Biyoteknoloji | sc-2812 | |
| anti-keçi yaban turpu peroksidaz etiketli ikincil antikor | Santa Cruz Biyoteknoloji | sc-2378 | |
| Gelişmiş ECL Tespit Sistemi | Amershan Yaşam Bilimleri | RPN2135 | |
| PBS 1x | Sigma | P4417 | poliadenilasyon deneyi |
| TRIZOL (Qiazol Lizis Reaktifi) | Qiagen | 79306 | |
| Kloroform | Sigma | 31998-8 | |
| İzopropanol | Sigma | 278475-1L | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74106 | |
| RTL tamponu | Qiagen | 79216 | |
| RNAse serbest DNAse seti | Qiagen | 79254 | |
| Primerler | Eurogentec | ||
| T4 RNA ligaz 1 | New England Biolabs | M0204S | |
| Yüksek kapasiteli c-DNA Ters Transkripsiyon kiti | Uygulamalı Biyosistemler, Yaşam Teknolojileri | 4368813 | |
| Taq polimeraz | Yaşam | Teknolojileri 10342020 |
Kaynaklar
- Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (2), 113-127 (2010).
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol C....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
