Nikotinik asetilkolin reseptörlerinin (nAChR'ler) aracılı sinaptik iletimin presinaptik mekanizmalarını analiz etmek için doğrudan canlı görüntülemeye izin veren in vitro ventral hipokampal - accumbens devresinin gen-kimerik bir preparatını geliştirdik. Bu hazırlık aynı zamanda sinaptik plastisitenin sinaptik öncesi ve sonrası mekanizmalarını incelemek için bilgilendirici bir yaklaşım sağlar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Nikotin Kaynaklı Kalsiyum Sinyali ve ventral Hipokampal Aksonlar boyunca Nörotransmitter Release Canlı Görüntüleme
Bu makalede
Özet
Özet
Pre-sinaptik nikotinik asetilkolin reseptörlerinin (nAChR'ler) aktivasyonu ile aksonal sinyallemenin sürekli artması ve nörotransmitter salınımının artması, asetilkolin (ACh) tarafından nöromodülasyon için önemli bir mekanizmadır. Hem in vitro hem de in vivo olarak sağlam aksonlar ve sinir terminallerindeki sinyal mekanizmalarının araştırılmasına erişimdeki zorluk, sinaptik plastisitenin pre-sinaptik bileşenlerinin çalışmasında sınırlı ilerlemeye sahiptir. Burada, pre- ve post-sinaptik nöronların genetik profilini seçici olarak değiştirirken, iletimin hem pre- hem de post-sinaptik bileşenlerini analiz etmek için doğrudan canlı görüntülemeye izin veren in vitro ventral hipokampal (vHipp)-accumbens (nAcc) devresinin gen-kimerik bir preparatını tanıtıyoruz. Pre-sinaptik aksonal girdi olarak vHipp mikro dilimlerinden gelen projeksiyonların, nAcc'den dağılmış nöronlar olan post-sinaptik hedeflerle çoklu, güvenilir glutamaterjik sinapslar oluşturduğunu gösteriyoruz. nAChR'lerin çeşitli alt tiplerinin pre-sinaptik lokalizasyonu tespit edilir ve pre-sinaptik nikotinik sinyalleme aracılı sinaptik iletim, eşzamanlı elektrofizyolojik kayıt ve canlı hücre görüntüleme ile izlenir. Bu hazırlık aynı zamanda in vitro glutamaterjik sinaptik plastisitenin sinaptik öncesi ve sonrası mekanizmalarını incelemek için bilgilendirici bir yaklaşım sağlar.
Giriş
Devre uyarılabilirliğinin Kolinerjik modülasyon biliş temel yönlerine katkıda bulunur ve değişmiş kolinerjik modülasyonu Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı, şizofreni ve bağımlılık 1-4 olmak üzere nörodejeneratif ve nöropsikiyatrik bozuklukların bir özelliğidir. CNS'de sinaptik iletim kolinerjik kolaylaştırılması kurulan bir mekanizma, ön-sinaptik olarak lokalize nAChR'lerin doğrudan aktivasyonu yoluyla olmaktadır. Dolaylı olarak bazı nAChR alt tipleri ve nispeten yüksek kalsiyum iletkenlik hem doğrudan, bağlı ile hücre içi sinyal iletim - bu pre-sinaptik reseptörlerinin aktivasyonu, hücre içi Ca + 2 ([Ca2 +] i)
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm hayvan deneyleri (2012 revize NIH Yayınları No. 80-23) Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Sağlık Rehberi National Institutes uyarınca yürütüldü ve çalışmalar Kurumsal Hayvan Bakım tarafından onaylanmış ve Stony Araştırma Komiteleri için kullanın edildi Brook Üniversitesi (# 1618 ve # 1792).
1. vHipp-NACC Sinaptik Co-kültürler
- Kurban fareleri (doğum sonrası gün 0 - vahşi tip (WT) ya da α7 nAChRs transgenik fare hattı 3) CO2 ile. Her yavru başını kesmek ve post facto genotipleme için 1,5 ml santrifüj tüpüne kuyruk kaydedin. Steril kaputu aşağıdaki adımları uygulayın.
- Tüm beyin ortaya çıkarmak için m....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
kullanılan preparat, in vitro olarak vHipp-NACC devreler gen, kimerik ko-kültürler oluşur. VHipp microslices kaynaklanan Projeksiyonlar, pre-sinaptik akson girdi olarak, post-sinaptik hedefler NACC dağılmış nöronlar ile sinaptik kişileri yapabilirsiniz. VHipp tarafından innerve NACC nöronlardan glutamaterjik iletimin bir sürekli (≥ 30 dk) kolaylaştırma kaynaklı nikotin pre-sinaptik α7 * nAChRs aracılığıyla vHipp aksonlar 5 boyunca sinyal 21 ve uzamış kalsiyum aksonları.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
ko-kültür hazırlanması açıklanan yeniden taahhüt eder in vitro ventral hipokampal-accumbens devreleri. pre-sinaptik nAChR'lerin aktivasyon glutamaterjik iletimi 5, 21 gelişmiş ortaya çıkaran hangi mekansal ve zamansal profillerin Bu preparat izin oldukça basit ve güvenilir bir sınav.
Co-kültürlerinde in vivo benzeri işlev göstermek için, in vitro olarak fizyolojik koşulları sağlayan bir çanak içinde farklı spesifik hücre tiplerinin büyümesi .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Teşekkürler
Teknik destek için Yehui Qin ve Mallory Myers'a teşekkür ederiz. Ayrıca Dr. Sigismund Huck'a bize anti-α4-ECD antikorunu sağladığı için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından L. W. R.'ye NS22061 desteklenmektedir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1. Kültür Besiyeri (50 ml) | |||
| Nörobazal | GIBCO | 10888022 | 48 ml |
| B-27 Takviyeleri | GIBCO | 0080085-SA | 1 ml |
| Penisilin-Streptomisin | GIBCO | 10908-010 | 0.5 ml |
| GlutaMAX Takviyesi | GIBCO | 35050-061 | 0.5 ml |
| Beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF) | GIBCO | 15140-122 | 20 ng/ml |
| 2. yıkama ortamı (HBSS, 100 ml) | |||
| HBSS, kalsiyum yok, magnezyum yok, fenol yok kırmızı | GIBCO | 14175-095 | 99 ml |
| HEPES ( 1M) | GIBCO | 15630-130 | 1 ml |
| 3. HEPES tamponlu tuzlu su (HBS) pH=7.3 | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | 135 milyon |
| KCl | Sigma | P9333 | 5 milyon |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | 1 milyon |
| CaCl2, | Sigma | C1016 ve nbsp; | 2 milyon |
| HEPES | Sigma | H3375 | 10 milyon |
| Glukoz | Sigma | G0350500 | 10 milyon |
| 4. Canlı görüntüleme için HBS Kokteyli pH=7.3 | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | 135 milyon |
| KCl | Sigma | P9333 | 5 milyon |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | 1 milyon |
| CaCl2, | Sigma | C1016 ve nbsp; | 2 milyon |
| HEPES | Sigma | H3375 | 10 milyon |
| Glukoz | Sigma | G0350500 | 10 milyon |
| Tetrodotoksin | Tocris | 1078 | 2 & mikro; M |
| bicuculline | Tocris | 131 | 10 & mikro; M |
| D-AP-5 | Tocris | 105 | 50 & M |
| CNQX | Tocris | 1045 | 20 ve mikro; M |
| LY341495 Tocris | 1209 | 10 & mikro; M | |
| 5. Kalsiyum içermez HBS pH=7.3 | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | 135 milyon |
| KCl | Sigma | P9333 | 5 milyon |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | 1 milyon |
| HEPES | Sigma | H3375 | 10 milyon |
| Glukoz | Sigma | G0350500 | 10 milyon |
| 6. 56 mM Potasyum ACSF pH=7.4 | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | 119 mM |
| KCl | Sigma | P9333 | 56 mM |
| MgSO4.7H | Sigma | M1880 | 1.3 mM |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | 2.5 mM |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | 1 mM |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | 26.2 mM |
| Glikoz | Sigma | G0350500 | 10 milyon |
Kaynaklar
- Changeux, J. P., et al. Brain nicotinic receptors: structure and regulation, role in learning and reinforcement. Brain Res Brain Res Rev. 26 (2-3), 198-216 (1998).
- Levin, E. D. Nicotinic receptor subtypes and cognitive function. J Neurobiol.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
