Burada murin peritoneal makrofajları izole etmek için basit bir protokolü açıklıyoruz. Bu prosedürü, Toll benzeri reseptörlerin uyarılması üzerine gen ekspresyon analizi yapmak için RNA ekstraksiyonu takip eder.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Fare Periton Makrofagların izolasyonu Toll-benzeri reseptörler Uyarım üzerine Gen İfadesi Analizi Yapacak
Bu makalede
Özet
Özet
Enfeksiyon ve inflamasyon sırasında dolaşımdaki monositler kan dolaşımına bırakın ve onlar makrofajlar içine ayırt dokulara, göç. Makrofajlar mikroorganizmaların geniş bir yelpazede evrimle korunmuş moleküler şekilleri tanıyan yüzey Toll-benzeri reseptörler (TLR), ifade eder. TLR genellikle gen ekspresyonu değiştirilmesi ile ilişkili makrofaj aktivasyonunda önemli bir rol oynar. Makrofajlar pek çok hastalıkta önemli ve tedavisi için çekici bir hedef olarak ortaya çıkmıştır. Aşağıdaki protokol, bira, tiyoglikolat vasatı kullanılarak sıçan periton makrofajları, izole edilmesi için bir prosedür açıklanmaktadır. İkincisi buna göre bu 10 kat makrofaj verim çıkaracağız, periton içine monosit göçü artıracak. Pek çok çalışma, kemik iliği, dalak veya periton türetilmiş makrofajlar kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Ancak, periton makrofajlar izolasyon üzerine daha olgun olduğu gösterilmiştir ve bunların fonksiyonel olarak daha kararlı edildiSığ ve fenotip. Böylece, fare periton boşluğuna izole makrofajlar farklı immünolojik ve metabolik çalışmalarda hizmet verebilir önemli bir hücre popülasyonu sunuyoruz. İzole bir kez, makrofajlar farklı TLR ligandları ile uyarıldı ve dolayısıyla gen ifadesi değerlendirildi.
Giriş
retiküloendotelyal fagositik sistemi, kemik iliği, kan, karaciğer ve dalak gibi çeşitli dokularda ve organlarda hücrelerden oluşmaktadır. Makrofajlar yoğun bunlar, özellikle doğuştan katılmak ve kontrol bağışıklık tepkilerini ve net enfeksiyonları uyarlamalı vücudun etrafında dağıtılır. Host savunmasında rollerine ilave olarak, makrofajlar, yara iyileşmesi ve doku homeostazını 1,2 muhafaza edilmesinde önemli bir rol oynamaktadır. Ayrıca, makrofajlar bağışıklık işlevi sadece önemli değil, aynı zamanda aktif demir homeostazda 3 katılacak. Vücutta demir yaklaşık% 80'i yaşlanmış makrofajlar tarafından fagosite 4 hangi zaman, eritrosit....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm işlemler Centre de recherche du Centre Hospitalier de l'Université de Montréal kurumsal Hayvan Bakım Komitesi (CRCHUM) tarafından onaylandıktan sonra Hayvan Bakımı yönergelere Kanada Konseyi'ne göre yapıldı.
1. İzolasyon, Kimlik ve Kültür Kemirgen Periton Makrofagların
- % 3.8 bira tiyoglikolat orta hazırlayın. Bunu yapmak için, damıtılmış su içinde 1000 ml tiyoglikolat vasatı içinde 38 g askıya almak için. Tamamen orta çözmek için kaynamaya çözüm getirin. 15 dakika boyunca 121 ° C'de otoklav ile sterilize edin. RT 18 at, karanlıkta 3 aya kadar saklayabilirsiniz.
NOT: Bulanıklık bakteriyel kontam....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
İlk akış sitometrisi ile izole edilmiş sıçan periton makrofajları, karakterize edilir. Bunu yapmak için, özellikle yalnızca makrofajlar tarafından ifade edilen markerler tanır (F4 / 80) antikorları kullanılmıştır. Bu karakterizasyon izole makrofaj yüzdesini belirlemek için ve izolasyon işlemi sırasında elde edilen hücreler arasında onları ayırmak için gereklidir. (Şekil 1) gösterildiği gibi, hücrelerin yüzdesi F4 / 80 sürekli olarak% 95 üzerinde olduğu tespit edilmiştir antijeni eksprese eden. Daha sonr.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Makrofajlar hayatta kalmak için çok önemlidir ve immünolojik hedefler için ana işlemek için cazip bir hedef sağlar. TLR ve diğer tanıma moleküllerinin keşfi immünolojik tartışmaların merkezine makrofajlar yaptık. Makrofajlar sitokinler, hasar ile ilişkili molekül model molekülü (DAMPS), 20 ve patojenlerin (PAMPs) 21 grupları ile ilişkili moleküller de dahil olmak üzere çeşitli uyaranlara, yanıt. Bu farklı uyaranlara yanıt makrofaj aktivasyonu seyrini temsil etmektedir ve genellikle gen ekspresyonu .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların birbiriyle rekabet eden hiçbir mali çıkarı yoktur.
Teşekkürler
Bu eser Doğa Bilimleri ve Kanada'nın Mühendislik Araştırma Konseyi bir hibe ile desteklenmiştir (NSERC, hayır 298515-2011 hibe). AL doktora almıştır Doğa Bilimleri ve Kanada'nın (NSERC) Mühendislik Araştırma Konseyi ve MS burs (hayır verin. MOP123246 CIHR), Kanada Sağlık Araştırma Enstitüleri bir hibe desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| C57BL / 6 fareler | Charles River Laboratories, Inc. (Wilmington, MA, ABD) | 475 | |
| Tiyoglikolat | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 19032-500G | |
| 70 etanol | |||
| 10 sodyum pentobarbital (Fare anestezisi için kullanılır (80 mg / kg, ip)) | |||
| Dulbecco' Fosfat tamponlu salin (DPBS), buz üzerine yerleştirilir ve makrofajların hasat edilmesine hizmet eder | WISENT INC Canada (QC) | 311-425-CL | |
| RPMI ortamı 1640 (Penisilin, streptomisin, L-glutamin ve% 10 fetal buzağı serumu ile takviye | WISENT INC Kanada (QC) | 350-000-CL | |
| 1 ve 5 ml şırıngalar | BD ABD (NJ) | ||
| 6 oyuklu plakalar | Corning Incorporated (NY, ABD) | MCT-150-C | |
| Bakteriyel lipoprotein Pam3CSK4 (0.5 mg / ml) | InvivoGen (San Diego, ABD) | TLRL-pm25 | |
| Poliiyonozin– polisitidlik asit (Poli(I:C)) (10 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, ABD) | Escherichia | |
| flagellin Salmonella typhimurium (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, ABD) | TLR-FLIC-10 | |
| HIV-1 uzun terminal tekrarından türetilen ssRNA, ssRNA40 (1 & mu; g/ml) | InvivoGen (San Diego, ABD) | TLR-LRNA-40 | |
| Tip B CpG oligonükleotid ODN1826 (1 & mu; M) | InvivoGen (San Diego, ABD) | 11B16-MM | |
| TRIzol | Invitrogen, (Burlington, ON, Kanada) | 15596-026 | |
| 20 G ve 23 G iğneler | BD ABD (NJ) | ||
| Makaslı | |||
| Forseps | |||
| 50 ml buz üzerine yerleştirilmiş konik tüpler | Sarstedt (Newton, MA, ABD) | 62.547.205 | |
| Kırmızı Kan Hücreleri Lizis Tamponu | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | R7757-100ML | |
| Soğutmalı santrifüj | |||
| Hemositometre | |||
| F4 / 80 antikor | BIO-RAD (CA, ABD), | ||
| CD16 / CD32 antikorları | Pharmingen, {Mississauga, ON, CA) | 553141 | |
| Akış sitometresi | Coulter Epics Elite sayacı, Coulter, (Hialeah, FL, ABD) | ||
| 1.5 ml Eppendorf tüpleri | Axygen Scietific (CA, ABD) | 3516 | |
| Chloroform | Fisher Scientific (ON, Kanada) | UN1888 | |
| İzopropil alkol | JT Baker (PA, ABD) | 70566 | |
| % 75 etanol (DEPC ile arıtılmış suda) | Ticari Alchohols (QC, Kanada) | 17394 | |
| % 0.01 dietil pirokarbonat (DEPC) ile arıtılmış su (gece boyunca bekletilsin ve otoklav) | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 216.542.8 | |
| Omniscript RT-PCR sistemi | Qiagen, (Mississauga, ON, Kanada) | 205113 | |
| Rotor Gene 3000 | Montreal Biotech, (Kirkland, QC, Kanada)QuantiTect | ||
| SYBR Green I PCR kitleri | Qiagen, (Mississauga, ON, Kanada) | 204141 |
Kaynaklar
- Pollard, J. W. Trophic macrophages in development and disease. Nat Rev Immunol. 9 (4), 259-270 (2009).
- Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat Rev Immunol. 3 (1), 23-35 (2003).
- Koury, M. J., Ponka, P.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
