Yöntem makalesi

İnsan A53T aşırı eksprese eden transjenik farelerin beyninde Geliştirilmiş ELISA ile Hastalık ile ilişkili α-sinüklein tespiti α-sinüklein Mutasyona uğramış

DOI:

10.3791/52752

⸱

30 Mayıs 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Neurodegenerative Diseases Unit, ANSES - French Agency for Food, Environmental and Occupational Health & Safety, 2Indicia Production, 3AJ Roboscreen GmbH, 4Epidemiology Unit, ANSES - French Agency for Food, Environmental and Occupational Health & Safety, 5Experimental Facilities, ANSES - French Agency for Food, Environmental and Occupational Health & Safety

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yeni bir kantitatif yaklaşım sunan bir ELISA açıklanmaktadır. Spesifik olarak, bir transgenik fare modeli (M83) içindeki (M83) sinoleinopatide, Ser129 fosforile αS formu veya proteinin C-terminal kısmına karşı çeşitli antikorlar kullanarak hastalıkla ilişkili α-sineulini (αSD) tespit etmektedir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Western blot gibi bilinen metotlara ek olarak, yeni yöntemler hızlı ve kolay bir sinükleopatiler deneysel modellerinde hastalıkla ilişkili α-sinüklein (aS D) ölçmek için ihtiyaç vardır. Aşırı ifade eden insan A53T aS ve kendiliğinden kilo kaybı, bitkinlik, ve ağır motor bozukluğu dahil olmak üzere semptomlarla karakterize Sekiz ve 22 ay arasında bir dramatik klinik fenotip üreten bir transjenik fare soyu (M83), bu çalışmada kullanılmıştır. Bu farelerde aS D (hastalıkla ilişkili aS) moleküler analiz için, bir ELISA, özellikle hasta farelerde aS D ölçmek için tasarlanmıştır. Bu fare modeli, merkezi sinir sistemi analizi esas kaudal beyin bölgelerinde ve omurilikteki aS D varlığını göstermiştir. Yani klinik hastalığa yol açan farklı deneysel koşullar arasında aS D dağılımında farklılıklar uninocul de vardıated ve normal transgenik fareler yaşlanma ve hastalık farelerden alınan beyin özleri ile aşılanmış farelerde. Ser129 karşı bir antikor kullanılarak aS D imünoreaktivite spesifik tespiti esas olarak Western Blot ve immünohistokimya ile elde edilen korelasyon ELISA ile aS fosforile. Beklenmedik bir şekilde, benzer bir sonuç aS C-terminal kısmına karşı birkaç diğer antikorlar ile gözlendi. Bir "prion gibi" mekanizmasının rolünü düşündürmüştür aS D yayılması, böylece kolayca izlenebilir ve bir ELISA yaklaşımı kullanarak bu fare modelinde belirlenebilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Parkinson hastalığı (PD) ile ilişkili α-sinükleinin (αSD) tespiti için mevcut yöntemlerin çoğu, immünohistokimya veya Western blot gibi, deneysel modellerde zaman alıcıdır ve nicel değildir. Bu nörodejeneratif hastalık, normalde çözünür presinaptik protein olan αS1,2 (Lewy cisimcikleri ve Lewy nöritleri) olan agrega formlarını içeren inklüzyonlar şeklinde alfa-sinüklein agregasyonu ile karakterizedir. Normalde sadece marjinal olarak fosforile edilen αS, bu inklüzyonlarda3 serin 129 residösünde hiperfosforile edilir ve Ser129 fosforile edilmiş αS'ye özgü antikorlarla izlenebilir, böylece patolojinin güvenilir bir belirtecini sağlar.

Son araştırmalar, etkilenen bir hastanın sinir sistemi içinde αS agregasyonunun yayılmasında bir "prion benzeri" mekanizmanın rol oynayabileceğini öne sürmektedir4,5. Bu çalışmalar, A53T mutasyonlu bir insan αS proteini ile ilişkili ciddi bir motor bozukluğu olan (M83) transgenik bir fare modeline (M83) αSD içeren beyin ekstreleri enjekte ederek bir sinükleinopatinin hızlandığını bildirmiştir6. Aynı şekilde, aynı M83 fare modeline agregalı rekombinant αS'nin intraserebral enjeksiyonu agregasyonun hızlandığını doğrulamıştır5. Fosforile αS tortularının indüksiyonu, C57Bl/6 vahşi tip farelere fibriller rekombinant αS veya insan DLB hastalarından elde edilen beyin ekstreleri enjekte edildikten sonra da rapor edilmiştir7,8. Sacino et al.9 son zamanlarda, fibriller insan αS'nin enjeksiyonu sonrasında M83 farelerinde yaygın ve ilerleyici bir serebral αS inklüzyon oluşumunun indüklenebileceğini, ancak E46K transgenik farelerinde veya indüklenen αS inklüzyonlarının geçici ve çoğunlukla enjeksiyon bölgesine kısıtlı olduğu non-transgenik farelerde bu oluşumun indüklenemeyeceğini belirttiler. Son zamanlardaki maymunlar üzerinde yapılan çalışmalar, PD türevli ekstrelerin insanlara daha yakın türlere enjeksiyonu sonrasında αS agregalarının yayıldığını doğrulamıştır10.

αS değişiklikleri ve Parkinson hastalığı arasındaki bağlantı, αSD'nin Parkinson hastalığı için potansiyel bir biyobelirteç olduğunu öne sürmektedir11. Son zamanlarda yapılan bir çalışma, oligomerik çözünür α-sinüklein agregalarının insan serebrospinal sıvısı (CSF) ve plazmasında, konvansiyonel bir sandviç sistemi ELISA kullanarak αS'yi yakalamak ve tespit etmek için aynı antikoru kullanarak Parkinson hastalığı için potansiyel bir biyobelirteç olarak tespit edildiğini göstermiştir12. Aynı yönteme dayanarak, biyolojik numunelerde, dahil olmak üzere beyin, birleştirilmiş formlarda mevcut olan çoklu epitop kopyaları olduğu için multimerik proteinler tanınmıştır13. Çok yakın zamanda, Lewy cisimciği patolojisi kanıtlanmış hastaların CSF'sinde patolojik αS, hem αSD (5G4)’ye karşı oldukça spesifik bir antikoru içeren bir ELISA kiti ile hem de bir immünopresipitasyon analizi kullanılarak tespit edilmiştir14. Bu yöntemler, PD/DLB olan hastaları diğer demans tiplerinden ayırt edebilir.

αS agregasyonunun "prion benzeri" yayılması, M83 transgenik fare modelinde, özellikle αSD'yi tanımlamak için tasarlanmış bir ELISA yaklaşımı kullanarak daha da çalışılmıştır15. Bu çalışmada, hasta M83 farelerinden αSD ile aşılanmış olsun ya da olmasın, özellikle bu M83 transgenik fare modelinde patolojik sürece özgü olarak hedef alan beyin bölgelerine göre αSD'yi kantitatif olarak tespit etmek için kullanılan detaylı ELISA protokolünü rapor etmekteyiz4.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm prosedürler ve hayvanları da içeren protokoller EC Direktifi 86/609 / EEC ve Cometh, hayvan deneyleri (protokol 11-0043) etik dikkate Fransız ulusal komitesi tarafından onaylanmış uygun idi. hayvanların barındırıldığı ve Anses en (0801 69387 onay B) Lyon deneysel tesisleri onaylı bakım için.

Fareler 1. Hazırlık

  1. Sodyum pentobarbital öldürücü dozun intraperitoneal enjeksiyonu ile farelere Euthanize.
  2. Fare kafatası tüm beyin almak ve ekstraksiyon kadar buz üzerinde 35 mm plastik Petri kabı yerleştirin.
  3. Servikal spinal kord ayıklayın.
    NOT: Özü aS ya Tablo 1'de listelenen deneyler sonra kullanılabilir sagital kesit sonra veya disseke fare beyinleri beyin yarım birinden gelen.
Experiment Fareler
Aşı (beyin eşdeğeri) 		Survival dönemi
(Dpi) 		Medyan / maksimum sağkalım
(Gün eski) 		ELISA ile D algılama aS
/ WB / İHK
1 Aşılanmamış fareler 441 ± 166 419/736 8/8
2 Aşılanmış fareler (0.2 mg), 150 ± 52 140/241 9/9

M83 fareler üzerinde gerçekleştirilen deneylerin Tablo 1. listesi. Aşılama sonrası, (glikoz içinde% 1 ağırlık / hacim,% 5), hasta bir fare beyin homojenatının 20 ul ile striato-kortikal bölgede Deney 2 6 hafta uygulandı % 3 izofluran inhalasyon yoluyla 6 haftalık homozigot M83 farelerin anestezi. dpi: gün inokülasyonu sonrasıtirme.

Beyin Yarısı 2. aS Ekstraksiyon

  1. Sagittally iki yarısını elde etmek için beyin kesti. Öğütme topları içeren bir ribolysis tüp içinde her yarım tartılır.
  2. 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 750 mM NaCI, 5 mM EDTA, 1 mM DTT,% 1 fosfataz ve proteaz inhibitörü kokteyli içeren yüksek tuz (HS), tampon hazırlayın. % 20 (ağırlık / hacim) homojenatları elde etmek için, beyin yarısı yüksek tuz tamponu ekleyin.
  3. 6.0 m mekanik homojenleştirici kullanarak beyin yarıları örnekleri hazırlayın / s 23 sn kez. Ilk 23 saniye homojenize edildikten sonra ikinci bir 23-sek çevriminden önce 2 dakika için buz üzerinde homojenatları içeren tüpleri.
  4. 5 dk öğütülmemiş beyin parçalarını ortadan kaldırmak için 1000 xg'de örnekleri santrifüj. 200 ul alikotlara bölünür ve daha sonra ELISA analizi için -80 ° C'de saklayın, süpernatantlar kurtarmak.

Dissected Beyin Bölgeler 3. aS Ekstraksiyon

  1. Teşrih biruçları, hipokampus kesme dışında bir arada tutulur, iki forcipes kullanarak düşük güç büyüteç (8 x büyütme) ile buz üzerinde 35 mm'lik plastik Petri tabağı içine tüm beyin. Beyin bütünlüğünü korumak için 10 dakika aşmayın. Beyin yerleştirin sağ yan ve bu sırayla şu beyin bölgelerinin almak:
    1. Sadece ampul arkasına yerleştirilen forseps kullanılarak iki koku ampuller Ayrı biri. Bir aşağı hareket ile beyinden ayırmak. İkinci ampul bu işlemi tekrarlayın.
    2. Yavaşça iki kortekste arasında forseps kama ve iki korteks ayrılmasını kolaylaştırmak için ileriye doğru hareket ettirin. Bir forseps ile yerine beyin tutulması, hipokampus gelen korteks ayırmak için başka kullanabilirsiniz.
    3. Forseps korteks altında 2 mm yerleştirin. Hipokampus üst görünür oluncaya kadar forseps üzerinde hafif bir baskı koruyun. Korteksin ilk bölümü soyulabilir ve ikinci bölümü ile tekrarlayın. İki korteks ayırmak için forseps kullanabilirhipokampus başlayan ve beynin ön tarafına doğru hareket.
    4. Hippocampi biri etrafında açık forseps yerleştirin. Daha sonra yavaşça mümkün olduğu kadar geri kazanılması, çıkarmak hipokamp altındaki forseps kapatın. İkinci hipokampus için prosedürü tekrarlayın.
    5. Striatasından birinin altındaki açık forseps yerleştirin ve yavaşça beynin ayırın. Striatum kalan korteks kaldırmak için forseps kullanın. İkinci striatum için bu yordamı yineleyin.
    6. Yavaşça beyin beyincik ayrılmasını kolaylaştırmak için, 2 mm beyincik konturu tarafından bastırmak için forseps kullanın. Sadece beyincik arkasında forseps yerleştirin ve ileri forseps hareket ettirerek çıkarın.
    7. Beyin sapını birleştiği yerde açıkça görmek için mesencephalon yükseltmek için forseps geniş kısmını kullanın. Kavşakta dikey kesi daha sonra beyin sapı çıkarın olun.
    8. , Mezensefalona arkasındaki forseps yerleştirin hangi idört yuvarlak yapılardan oluşur s. Mezensefalon tamamen geriye kalan beyin ayrılmış kadar dikey olarak İnsizyon.
  2. Değişken% HS tampon maddesi içinde (ağırlık / hacim), mevcut dokuların miktarına bağlı olarak, örneğin, 10 ve 30 mg arasında bir ağırlık için% 5 homojenat, 30 ve 80 mg arasında bir ağırlık için% 10 ve% 20 arasında homojenatları hazırlanması 80 mg üzerinde bir ağırlık.
    1. Homojenat beklenen% elde etmek için parçalandı beyin bölgelerine HS tamponu yeterli hacim.
    2. Vortex ve dokular tamamen HS tamponu dalmış olup olmadığını kontrol edin.
    3. Borosilikat cam tüp ve iki havan tokmaklarının, A ve B oluşan bir doku öğütücüsüyle kesilerek beyin bölgelerinde veya servikal spinal kord hazırlanabilir örnekleri homojenize
    4. Tüp içine doğrudan ezilmiş olan her beyin bölgesini dökün. Tüpe havaneli A yerleştirin ve geri çekin. Doku ayırmak Bu hareketi yaklaşık on kez tekrarlayın. Ardından c havaneli B kullanınBir başka 20 hareketleri ile doku taşlama ontinue. 1 ml transfer pipet ile 1.5 ml tüp içine homojenatları aktarın.
  3. Herhangi bir öğütülmemiş beyin parçaları ortadan kaldırmak için 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1000 x g'de örnekleri santrifüjleyin. Süpernatanlar Al 200 ul alikotları bunları ayırmak ve daha sonra ELISA analizi için -80 ° C 'de muhafaza edin.

ELISA ile aS 4. Algılama

  1. 0.01 ng / ml kaplama antikorları sulandırmak. 50 mM Na-2 CO 3 / NaHCO 3 tamponu (pH 9.6), anti-aS tavşan poliklonal ya da monoklonal antikor klon 42 kullanın.
  2. Ceket 96 oyuklu mikro-plakalar bu kaplama çözeltisi, oyuk başına 100 ul ve 4 ° CO / N bırakın. Saptama antikorları syn514 kullanılarak ELISA kaplama çözeltisi içinde, anti-aS tavşan poliklonal antikoru kullanarak 42, LB509, AS11, 4D6 ve 8A5 klonu. Bir kaplama solüsyonu gibi anti-aS monoklonal antikor klon 42 kullanınAnti-pSer129 aS algılama antikoru ile kombinasyon halinde.
    Not: plakalar ELISA önce bir hafta boyunca 4 ° C'de muhafaza edilebilir, gerekli ise gerçekleştirilir.
  3. Oyuk başına% 0.05 Tween 20 (PBST) ile fosfat tamponlu tuz çözeltisi, 300 | il ile beş kez yıkamak için bir levha yıkayıcı kullanın. Başlar ve bu adımdan, inkübasyon, oda sıcaklığında yer almaktadır.
  4. T20 PBS kuyu başına tampon engelleme 200 ul ekleyin. 150 rpm'de 1 saat boyunca çalkalanır. PBST ile plakalar beş kez yıkayın.
  5. (% 20 homojenatlarının 100,% 10 homojenatlarının 1:50 ve PBST BSA% 1% 5 homojenatlarının 1:25 seyreltme 1) ve her bir kuyucuğa 100 ul Beyin homojen seyreltilir. 150 rpm'de çalkalanarak daha sonra 2 saat süreyle inkübe edin. PBST ile plakalar beş kez yıkayın.
  6. Malzeme Listesi'nde belirtilen sulandırmalarda BSA ile PBST% 1 farklı aS algılama antikorları ekleyin. 150 rpm'de 1 saat süreyle inkübe edin. PBST ile plakalar beş kez yıkayın.
  7. Anti-ya Ekle150 rpm'de çalkalanarak 1 saat boyunca% 1 BSA ile desteklenmiş PBST içinde 8000: -fare ya da anti-tavşan IgG HRP konjügatları 1 seyreltilmiştir. PBST ile plakalar beş kez yıkayın.
  8. Her oyuğa, 5,5'-tetrametilbenzidin (TMB) çözeltisine 3,3 '100 ul ilave edin ve 150 rpm'de çalkalanarak karanlıkta 15 dakika boyunca inkübe edin.
  9. De o zaman mikro levha okuyucusu ile 450 nm'de absorbans ölçümü için 1 N HCI, 100 ul ilave ederek reaksiyonu durdurun.
  10. Veri analizi için, analiz edilen örneklerin her biri için, ölçülen OD değerleri herhangi bir fare beyin örneklerindeki (boş oyuk) dışındaki tüm reaktifleri ile iyi olarak elde edilen OD değerini çıkarın.

5. Epitop Haritalama

  1. Osman 16 tarafından tarif edilen metoda göre, epitop eşleme gerçekleştirin. Kısaca, 10 üst üste binen amino asitlerin nitroselüloz üzerinde 12 amino asidini ihtiva eden insan α-sinüklein dizisinin Noktası peptidler.
  2. 50 mM Tris / 150 mM NaCl tamponu, pH 1 ile bloke0% 0.05 Tween 20 ve% 5 süt tozu ihtiva etmektedir. 2-10 ° CO / H de ml başına 2 ug antikorun bir konsantrasyonda çözelti engelleme antikor inkübe edin.
  3. Membranı 50 mM Tris / 150 keçi anti-fare IgG HRP konjügatı ile% 0.05 Tween 20 ihtiva eden inkübe mM NaCI tampon pH 10 ile üç kez yıkayın. Daha sonra aynı tampon kullanarak başka beş kez bir Western Blot TMB boyama kiti kullanılarak leke membran yıkayın.

6. İstatistiksel Analiz

  1. OD model karışık etkiler regresyon gerçekleştirmek için R yazılım ve nlme paketi kullanın. Her bir karşılaştırma için, karışık bir etkisi regresyon modeli yerine getirir. Asemptomatik gruplardan semptomatik ayırt etmek için bir sabit efektini kullanın.
  2. Belirli bir fare tekrarlar değişkenliği yansıtacak şekilde rastgele efektini kullanın. Artıklar inceleyerek homoscedasticity edin ve gerekirse Pinheiro ve Bates 1 doğrultusunda grup içi hataların varyans yapısını modellemek için varyans işlevlerini kullanın7. P. önemi eşiği olarak 0.05 ayarla

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada kullanılan ELISA özel hasta M83 farelerden yüksek tuz tamponu içinde hazırlanan beyni homojenatlarında hastalıkla ilişkili aS (aS D) tanımlanmıştır. Özellikle pSer129 aS (p = 0,0074) tanıyan bir antikor kullanarak, ELISA kolaylıkla genç (eski 2-5 ay), sağlıklı M83 farelerde (Şekil 1) eski, hasta farelerin (> 8 aylık) ayırır. Birkaç diğer antikorlar benzer şekilde yüksek sinyaller sadece hasta farelerin beyin homojenatlanndaki (> 0.6 OD) gösterdi. Bu 4D6 durum (p = 0.01) pro...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

bir ELISA kullanımı özellikle M83 transjenik fare modelinde hastalıktan sırasında fare beyni homojenatlarında şirketinden aS D tespit etmek için ortaya konmuştur. Nitekim, bu ELISA kolayca Yüksek Tuz tamponunda sadece tüm beyin homojenatları kullanarak sağlıklı M83 farelerden elde edilen hasta M83 fareler ayırt olabilir.

Bu ELISA kullanılarak başarılı sonuçlar için en kritik adımlar şunlardır: doğru diseksiyon sırasında zarar görmesini önlemek için gerekli el becerisi geliştirerek...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açığa çıkarılacak hiçbir çelişkili çıkarı yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar aşılar için Damien Gaillard teşekkür ve takibinde hayvan deneyleri istiyoruz. Bu eser Anses (Gıda, Çevre ve İş Sağlığı ve Güvenliği Fransız Ajansı) tarafından ve Vakıf Fransa Parkinson bir hibe ile desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
LB509Abcamab27766Tespit antikoru 1/2.000
AS11Produced at AnsesTespit antikoru 1/1.000
4D6Abcamab1903Tespit antikoru 1/2.000
PSer129Abcamab59264Tespit antikoru 1/3.000
PSer129 EP1536YAbcamab51253Tespit antikoru 1/1.000
syn514Abcamab24717Tespit antikoru 1/500
clone 42BD Biosciences610787Kaplama ve tespit antikoru (1/2.000)
8A5Provided by Dr. AndersonTespit antikoru 1/2.000
polyclonal anti-αsyn antikoruMilliporeAB5038PKaplama antikoru
Anti-mouse IgG HRP konjugesiSouthern Biotech1010-05
Anti-rabbit IgG HRP konjugesiSouthern Biotech4010-05
Goat anti-mouse IgG HRP konjugesiDianova115-035-164
HS tamponupH 7,5'te ayarlanmış, 4 °C'de muhafaza
  • Tris-HCl 50 mM
Euromedex26-128-3094-B
  • NaCl 750 mM
Euromedex1112-A
  • EDTA 5 mM
EuromedexEU0007-B
  • DTT 1 mM
Sigma43815
PBSpH 7,5'te ayarlanmış
  • Na2HPO4 1 mM
Euromedex1309
  • KH2PO4 1.5 mM
Euromedex2018
  • NaCl  137 mM
Euromedex1112-A
  • KCl 2.7 mM
EuromedexP017
Tween 20Euromedex2001-C
BSASigmaA7906
DTT 1 mMSigma43815Stoka 100 mM, toksik
1% fosfataz kokteyliPierce78428
1% proteaz inhibitör kokteyliRoche04 693 132 00150x konsantre
Microplate MaxiSorpTMThermo Scientific442404
Karbonat tamponu 50 mM pH 9,6
  • Na2CO3, 10H2O
Sigma713602,86 g/L
  • NaHCO3
Merk63293,36 g/L, pH 9,6
Superblock T20 PBS blokaj tamponuPierceE6423H10x konsantre
TMBSigmaT0440ELISA için kullanılır
TMBAnalytik Jena AG847-0104200302Epitop haritalaması için kullanılır
HCl 1 NChimie plus40030
RibolyserThermoFast prep FP120bu adımda buz üzerinde muhafaza
Ezme tüpleriBiorad355-1197
Plaka yıkayıcıTecanColumbus Pro
Plaka okuyucuBioradModel 680
Düşük güçlü büyüteç VWR630-10628X büyütme
Dumont#7 forsepsWPI14097Diseksiyon adımları için
Transfer pipeti 1ml SamsoSamso043231
1,5 ml tüplerDutscher033290

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Goedert, M., Spillantini, M. G., Del Tredici, K., Braak, H. 100 years of Lewy pathology. Nat Rev Neurol. 9, 13-24 (2013).
  2. Waxman, E. A., Giasson, B. I. Specificity and regulation of casein kinase-mediated phosphorylation of alpha-synuclein. J Neuropathol Exp Neurol. 67, 402-416 (2008).
  3. Anderson, J. P., et al. Phosphorylation of Ser-129 is the dominant pathological modification of alpha-synuclein in familial and sporadic Lewy body disease. J Biol Chem. 281, 29739-29752 (2006).
  4. Mougenot, A. L., et al. Prion-like acceleration of a synucleinopathy in a transgenic mouse model. Neurobiol Aging. 33, 2225-2228 (2012).
  5. Luk, K. C., et al. Intracerebral inoculation of pathological alpha-synuclein initiates a rapidly progressive neurodegenerative alpha-synucleinopathy in mice. J Exp Med. 209, 975-986 (2012).
  6. Giasson, B. I., et al. Neuronal alpha-synucleinopathy with severe movement disorder in mice expressing A53T human alpha-synuclein. Neuron. 34, 521-533 (2002).
  7. Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338, 949-953 (2012).
  8. Masuda-Suzukake, M., et al. Prion-like spreading of pathological alpha-synuclein in brain. Brain : a journal of neurology. 136, 1128-1138 (2013).
  9. Sacino, A. N., et al. Amyloidogenic alpha-synuclein seeds do not invariably induce rapid, widespread pathology in mice. Acta neuropathologica. 127, 645-665 (2014).
  10. Recasens, A., et al. Lewy body extracts from parkinson's disease brains trigger alpha-synuclein pathology and neurodegeneration in mice and monkeys. Ann Neurol. , (2013).
  11. Foulds, P. G., et al. Phosphorylated alpha-synuclein can be detected in blood plasma and is potentially a useful biomarker for Parkinson's disease. FASEB J. 25, 4127-4137 (2011).
  12. El-Agnaf, O. M., et al. Detection of oligomeric forms of alpha-synuclein protein in human plasma as a potential biomarker for Parkinson's disease. Faseb J. 20, 419-425 (2006).
  13. Lee, H. J., et al. Enzyme-linked immunosorbent assays for alpha-synuclein with species and multimeric state specificities. J Neruosci Meth. 199, 249-257 (2011).
  14. Unterberger, U., et al. Detection of disease-associated alpha-synuclein in the cerebrospinal fluid: a feasibility study. Clin Neuropathol. 33, 329-334 (2014).
  15. Betemps, D., et al. Alpha-synuclein spreading in M83 mice brain revealed by detection of pathological alpha-synuclein by enhanced ELISA. Acta Neuropathol. (Berl). 2, 29(2014).
  16. Osman, A. A., et al. A monoclonal antibody that recognizes a potential coeliac-toxic repetitive pentapeptide epitope in gliadins). Eur J Gastroenterol Hepatol. 13, 1189-1193 (2001).
  17. Pinheiro, J. C., Bates, D. M. Ch. 5. Mixed-Effects Models in S and S-PLUS. Chambers, J. 5, Springer. 206-225 (2000).
  18. Mougenot, A. L., et al. Production of a monoclonal antibody, against human alpha-synuclein, in a subpopulation of C57BL/6J mice, presenting a deletion of the alpha-synuclein locus. J Neruosci Meth. 192, 268-276 (2010).
  19. Specht, C. G., Schoepfer, R. Deletion of the alpha-synuclein locus in a subpopulation of C57BL/6J inbred mice. BMC Neurosci. 2, 11(2001).
  20. Lee, B. R., Matsuo, Y., Cashikar, A. G., Kamitani, T. Role of Ser129 phosphorylation of alpha-synuclein in melanoma cells. J Cell Sci. 126, 696-704 (2013).
  21. Perrin, R. J., et al. Epitope mapping and specificity of the anti-alpha-synuclein monoclonal antibody Syn-1 in mouse brain and cultured cell lines. Neurosci Lett. 349, 133-135 (2003).
  22. Emmanouilidou, E., et al. Assessment of alpha-synuclein secretion in mouse and human brain parenchyma. PLoS One. 6, e22225(2011).
  23. Mougenot, A. L., et al. Transmission of prion strains in a transgenic mouse models overexpressing human A53T mutated alpha-synuclein. J Neuropathol Exp Neurol. 70, 377-385 (2011).
  24. Foulds, P. G., et al. A longitudinal study on alpha-synuclein in blood plasma as a biomarker for Parkinson's disease. Sci Rep. 3, 2540(2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Alfa Sinklinein TespitiELISA Y ntemiHastal kla li kili Alfa SinklineinBeyin Homojenat Haz rlamaWestern Blot Kar la t rmasFosfo Ser129 AntikoruOmurilik AnaliziMezensefalon Beyin SapPrion Benzeri Yay l m

İlgili makaleler