Yöntem makalesi

Nanopartikül Aşılama sonrası analizi antijene özgü CD8 + T hücresi tepkileri için tüm hayvan Görüntüleme ve Akış Sitometrisi Teknikleri

12.3K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/52771

⸱

29 Nisan 2015

 , 
1Department of Pharmaceutical Sciences, University of Michigan, 2Biointerfaces Institute, University of Michigan, 3Department of Biomedical Engineering, University of Michigan

Bu makalede

Özet

Bir murin aşılama modelinde nanopartiküllerle bağışıklamaya yanıt olarak antijene özgü CD8+ T hücrelerinin genişlemesini izlemek için tüm hayvan görüntüleme ve akış sitometrisi tabanlı teknikleri açıklıyoruz.

Özet

Şap gibi geleneksel aşı adjuvanları, suboptimal CD8+ T hücresi yanıtlarını ortaya çıkarır. Aşı geliştirmedeki bu büyük zorluğun üstesinden gelmek için, drene lenf düğümlerine antijen iletimini iyileştirmek ve antijen sunan hücreler tarafından antijen alımını artırmak için patojenlerin özelliklerini taklit etmek üzere çeşitli nanopartikül sistemleri tasarlanmış ve antijene özgü CD8+ T hücresi yanıtlarının indüksiyonu için optimize edilmiş yeni aşı formülasyonlarına yol açmıştır. Bu makalede, alt birim antijenlerin ve immünostimülatör ajanların birlikte verilmesi ve güçlü sitotoksik CD8+ T lenfosit (CTL) yanıtlarının ortaya çıkarılması için etkili bir aşı taşıyıcısı olarak hizmet edebilen iki tabakalı çapraz bağlı çok katmanlı veziküller (ICMV'ler) olarak adlandırılan "patojeni taklit eden" bir nanopartikül sisteminin sentezini açıklıyoruz. Dinamik ışık saçılımı ve zeta potansiyel analizörü ile aşı nanopartiküllerinin hidrodinamik boyutunu ve yüzey yükünü karakterize etmek için yöntemleri açıklıyoruz ve drene lenf düğümlerine nanopartikül aracılı antijen iletimini analiz etmek için konfokal mikroskopi tabanlı bir prosedür sunuyoruz. Ayrıca, lusiferaz eksprese eden, antijene özgü CD8 + T hücrelerinin alıcı farelere evlat edinici transferini ve ardından CTL'lerin genişleme ve kaçakçılık modellerinin gerçek zamanlı olarak non-invaziv sorgulamasına izin veren nanopartikül aşılamasını kullanan yeni bir biyolüminesans tam hayvan görüntüleme tekniği gösteriyoruz. Ayrıca, nanopartiküllerle aşılanmış farelerde endojen T hücresi yanıtlarının uzunlamasına kantitifikasyonu için periferik kan mononükleer hücrelerinin tetramer boyamasını ve akış sitometrik analizini de tanımladık.

Giriş

Geleneksel aşı geliştirme ağırlıklı deneme-yanılma ampirik bir yaklaşım uygulamaktadır. Ancak, biyomalzeme ve immün aktivasyon moleküler belirleyicileri keşif geniş bir yelpazeye son gelişme ile, bu rasyonel patojenlerin 1,2 türetilen biyofiziksel ve biyokimyasal ipuçları ile aşı formülasyonları tasarlamak artık mümkün. Özellikle, çeşitli parçacık halinde ilaç iletim platformları, lenf içinde bulunan bozunmadan, aşı bileşenleri korumak ve antijen sağlayan hücrelere (APC) kendi eş sevkini iyileştirmek, bu alt birim antijen ve immünostimülatör maddelerle birlikte yüklenebilecek aşı taşıyıcıları olarak incelenmiştir düğümler (LN), böylece bağışıklık uyarımı ve aktivasyonunu 3-5 maksimize. Daha önce güçlü bir aşı platfor olarak gösterilmiştir, bu yazıda, bir "patojen taklit eden" nanopartikül sisteminin sentezini tarif adlandırılan interbilayer-çapraz bağlanmış çok-lamelli veziküller (ICMVs),Sağlam sitotoksik T lenfosit (CTL) ve sistemik ve mukoza dokusu bölümlerinde 6-9 hem de humoral bağışıklık karşılıklarının ortaya çıkartıldığını m. Özellikle, ICMVs ile aşılama büyük oranda geleneksel yardımcı maddeler (örneğin, şap ve Montanide) 7 ile aşılama ile karşılaştırıldığında, bir sıtma antijene karşı serum IgG düzeyleri gelişmiş ve aynı zamanda tümör hücreleri ve fareler 9 viral meydan modellerine karşı güçlü CTL yanıtları ortaya başararak. Burada bir model aşı nanoparçacık sistemi olarak ICMVs kullanarak, biz partikül büyüklüğü ve zeta potansiyeli ölçümleri ve boşaltma LN parçacık ticareti izleme cryosectioned dokuların 7 konfokal görüntüleme kullanan (dLNs dahil) aşı nano-formülasyonlar karakterizasyonu için yöntemler açıklanmaktadır. Buna ek olarak, lusiferaz sentezleyen bir antijen-özgül CD8 + T hücrelerinin 9,10 adoptif nakli sonrasında farelerde CTL yanıtlarının genişleme analiz bir bütün hayvan görüntüleme tabanlı bir yöntem sunulmaktadır. Son olarak biz denanopartiküller 6,9 ile aşılanmış farelerde endojen T hücresi tepkilerinin uzunlamasına ölçümü için periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC), çizici tetramer boyaması.

ICMVs daha sonra kimyasal olarak çapraz bağlayıcı ditiyol 6 lipid tabakaları içinde çapraz bağlama maleimid-işlevselleştirilmiş fosfolipid baş grupları tarafından stabilize edilir çok katmanlı yapılar, içine basit lipozomlar kontrol füzyon tarafından sentezlenen bir lipid bazlı nanopartikül formülasyonu vardır. ICMVs sentez edildikten sonra, nano partiküllerin küçük bir kısmı parçacık boyutuna ve zeta potansiyeli, dinamik ışık saçılımı (DLS) sistemi ve zeta potansiyeli analizcisi ile (parçacıkların, yani, yüzey yükü) belirlemek için kullanılabilir. Difüzyon katsayısı belirlenmesi ve parçacıkların 11 hidrodinamik boyutu izin parçacık süspansiyonları ışık saçılması DLS ölçer değişiklikler. Toplu sentezine toplu tutarlı parçacık büyüklüğü sağlanması önemlidirparçacık boyutu yana APCler 12,13 tarafından dLNs ve daha sonra hücre içine kabul edilmesine aşı parçacıkların lenf boşaltma etkileyen ana faktörlerden biridir. Buna ek olarak, zeta potansiyeli partikülleri ve partikül yüzey yükünün 11 elektroforetik hareketlilik belirlenmesini sağlayan bir elektrik akımı uygulanır parçacık hızını ölçerek elde edilebilir. Parçacıkların yüzey yükü depolama sırasında ve in vivo uygulama 14,15 sonra parçacık dağılım üzerinde doğrudan etkisi vardır koloidal istikrarı belirler çünkü parçacıkların tutarlı zeta potansiyeli değerlerin sağlanmasında çok önemlidir. DLNs partikül yerelleştirme izlemek amacıyla, ICMVs lipofilik boyalar ve kovalent etiketli antijenler de dahil olmak üzere istenilen floroforlar ile etiketli olabilir. Aşılamadan sonra, fareler, dLNs rezeke, çeşitli zaman noktalarında ötenazi cryosectioned ve konfokal mikroskobu ile analiz edilebilir. Bu teknik lenfatik DraI görselleştirme sağlarnanoparçacık aşı taşıyıcıları ve dLNs antijenin hem eğirme. Daha önce 7 gösterildiği gibi doku bölümleri ilave olarak antijen ve germinal merkezlerin oluşumu ile bağlantılı hücre türleri gibi floresan etiketli antikorlar ve daha fazla bilgi elde etmek için kullanılan ile boyanmış olabilir.

Parçacık sentezi optimize edilmiştir ve dLNs insan ticareti onaylandıktan sonra, in vivo CTL genişleme aydınlatılması doğrulamak için önemlidir. Nanoparçacık aşılamaya verdikleri yanıt olarak antijene özgü CD8 + T hücrelerinin ortaya konmasını analiz etmek amacıyla, detaylı bir immünolojik analizler sağlar OVA 257-264 peptit (SIINFEKL) immünodominant CD8 + T hücre epitopu ile bir model antijen, ovalbümin (OVA) kullanmıştır Başlangıç ​​aşı geliştirme 16,17 için antijen-spesifik T hücresi tepkilerinin. Özel olarak, genleşme ve antijene özgü CD8 + T hücrelerinin göç dinamiklerini sorgulamak için, biz oluşturulan adresT-hücresi reseptörü (H-2K ile birlikte b) SIINFEKL için spesifik (TCR) ile CD8 + T hücreleri sahip OT-I transgenik farelerin transgenik fareler (Luc), lusiferaz sentezleyen ateşböceği geçerek çift transgenik fare modeli. Bu OT-I / Luc Farelerden, lusiferaz sentezleyen, OT-I, CD8 + T hücreleri, izole edilebilir ve saf C57BL / 6 farelerine adoptif transfer için hazırlanmıştır. Tohumlanmış sonra, OVA-içeren nanopartiküller ile başarılı bir aşı, bir bütün hayvan görüntüleme sistemi 9,10 ile biyoışıldama sinyalinin izlenmesi ile takip edilebilir şekilde nakledilen T hücrelerinin genişlemesine neden olur. Bu non-invazif tüm vücut görüntüleme tekniği uzunlamasına bir şekilde periferal dokularda T hücresi lenfoid dokularda genişleme ve yayılması ilgili işlemleri ifşa son 18-20 diğer viral veya tümör antijenleri ile kullanılmıştır.

Adoptif transfer antijene özgü CD8 + T hücre analizi, tamamlayıcı, endogenoBize T hücresi tepkileri kullanıldığında, aşılama dört florofor ile işaretlenmiş MHC-sınıf I molekülleri içeren bir peptit-MHC kompleksi tetramer, peptit epitopları ile yüklü olan peptid ana histokompatibilite kompleksi (MHC) tetramer denemesi 21 ile incelenebilir yayınlamak bir antijen-spesifik bir şekilde, TCR ve etiket, CD8 + T hücrelerini bağlamak için. peptid-MHC tetramer denemesi lenfoid ve periferik dokularda antijen spesifik CD8 + T hücrelerini teşhis etmek için, terminal Otopsi çalışmaları ya da seri kan çekilir elde edilen periferal kan mononükleer hücreleri (PBMC) ile uzunlamasına çalışmalarda da gerçekleştirilebilir. Peptid-MHC tetrameri ile lenfositlerin boyama sonra, akış sitometri analizine CD8 + T-hücreleri arasında kendi frekans CTL'lerin fenotipinde veya nicelenmesine detaylı analizler için gerçekleştirilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu protokol açıklanan tüm deneyler belirlenen politika ve kurallarına göre Kullanımı ve Michigan Üniversitesi'nde Hayvanlarının Bakımı (UCUCA) Üniversite Komitesi tarafından onaylandı ve yapıldı.

1. Sentezi ve Karakterizasyonu Protein ICMVs Antijen ve Adjuvan Moleküller ile Co-yüklü

  1. Karışım 1: 1,2-dioleoil-sn--glisero-3-fosfokolin (DOPC) ve 1,2-dioleoil-sn--glisero-3-phosphoethanolamine- N 1 mol oranı - [4- (p -maleimidophenyl) bütiramit] kloroform (MPB), yığın başına 1.26 umol toplam lipit miktarı tutulması (örneğin, DOPC, 500 ug ve MPB 630 ug) 20 ml bir cam şişe (çap = 28 mm, yükseklik = 61 mm).
  2. Istenilen konsantrasyonda lipit solüsyonuna, örneğin monofosforil lipid A (MPLA) ya da lipofilik boyalar (örneğin, yaptığımız) gibi lipofilik ilaçlar, ekleyin. İyice ekstra kuru nitroge ile tasfiye ederek organik çözücü kaldırmakn gaz ve vakum O / N altında örnekler yerleştirerek.
  3. Suda çözünür ilaçlar (örneğin, protein antijenleri) ihtiva eden 10 mM Bis-Tris propan (BTP, pH 7.0), 200 ul ekleyerek lipid filminin hidratı. 10 saniye oda sıcaklığında 1 saat süre ile, her 10 dakika vorteksleyin.
  4. Cam içeriği, bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içine ufak şişe yer örnekleri, bir buz-su banyosu içinde, 125 W / 20 kHz prob ucu sonikatör ayarı% 40 yoğunluk kullanılarak 5 dakika boyunca sürekli olarak sonikasyon aktarın.
  5. Her parti (çalışma konsantrasyonu 2.4 mM), girdap ve masa mikro santrifüj kullanılarak kısa bir süre santrifüje 150 mM ditiyotreitol (DTT), 4 ul ekle.
  6. 200 mM CaCI2 40 ul ekleyin ve pipet (çalışma konsantrasyonu 33 mM) ile karıştırın. DTT ile lipit katman MPB-ihtiva eden çapraz bağlanmasını sağlamak için 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  7. Santrifüj numuneleri 15 dakika için 20,000 x g'de, ddiH 2 O 200 ul supernatant, ve tekrar süspansiyon kaldırma
  8. Adımı yineleyin 1.7 ve santrifüj yeniden ikinci ddiH 2 O yıkamadan sonra süpernatanından CaCl 2, reaksiyona girmemiş DTT ve kapsüllenmemiş kargo malzemelerini çıkarmak için.
  9. DdiH 2 O 2 kDa polietilen glikol-tiol (PEG-SH), 10 mg / ml hazırlayın PEG-SH çözeltisi 100 ul her bir ICMV örnek yeniden süspanse edin ve 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  10. İki ddiH 2 O yıkar (adım 1.7) gerçekleştirin ve 4 ° C'de son ICMV PBS pelet ve mağaza tekrar süspansiyon. Parçacıklar uzun süreli depolamadan sonra dibe olabilir önce ICMV süspansiyonu karıştırmak, kullanmak için.
  11. Partiküllerin karakterizasyonu için, her partiden ICMVs küçük bir kısım (~% 10) kaldırıp ddiH 2 O, 1 ml bir toplam hacim içinde ayrı ayrı seyreltik Bir Zetasizer hücresi ve ölçü parçacık boyutu, polidispersite indeksi ve DLS ve (imalatçının protokolüne göre) zeta potansiyeli ölçüm sistemi kullanılarak numunelerin zeta potansiyeli tek bir örnek yerleştirin.

Ve Lenf Nodu Boşaltma 2. Sınav Konfokal Mikroskopi ile ICMVs Floresan-etiketli

  1. ICMVs hazırlanması florofor-etiketli antijen ve lipofilik bir floresan boya ile yüklenir
    1. Üreticinin talimatlarına uygun olarak, ovalbümin Alexa Fluor 555-süksinimidil ester ile reaksiyona sokulmaktadır gibi florofor-etiketli protein, hazırlayın.
    2. Lipid kabuk fluorofor ile etiketlenmiş ICMVs hazırlamak için, lipofilik floresan boya (örneğin, 1,1-dioktadesil-3,3,3 ', 3'-Tetramethylindodicarbocyanine, () yaptı) (lipit filmin hazırlanması sırasında Adım ekleme 1.2)% 0.05 molar lipid miktarda. Lipid filmi hidrasyon (Basamak 1.3), florofor etiketli antijen ihtiva eden kullanımı tamponu ve tam ICMV sentezi için adımlar 1,4-1,11 belirtildiği gibi.
  2. Kuyruk dibinde nanopartiküllerin deri altı uygulama
    1. Indüksiyon odasında u ile donatılmış kontrollü bir akış buharlaştırıcı kullanılarak fare anestezisiIACUC göre% 3 izofluran ve oksijen akışının 1.5 L / dak tilizing hayvan protokolü onayladı. Fare bilinçsiz sonra, enjeksiyon yerinde optimal erişime izin ve hayvan rahatsızlığı en aza indirmek için kapalı giyen anestezi hızlı bir şekilde önce aşağıdaki adımları uygulayın. Alternatif olarak, anestezi korumak için uygun bir uydurma burun konisi kullanın. Farenin uzunluğu 5 dakika için anestezi uygulanır ise, işlemden sonra tahrişi en aza indirgemek için gerekli olan göz madeni uygulanır.
    2. Sterilize ve deri altına iğne görselleştirmek için kullanılabilir görebilir deri, küçük bir yama ortaya çıkarmak için kürk Bölüm ıslak saç ıslak% 70 etanol ile kuyruğun tabanına püskürtün.
    3. Istenen antijen miktarı ve PBS içinde aşı dozu, 100 ul başına yardımcı madde ihtiva eden parçacık püskürtme süspansiyonu hazırlayın (örneğin, 10 ug OVA ve enjeksiyon doz 100 ul başına 0,3 ug MPLA son 6,9 kullanılmıştır).
    4. Parçacık süspansiyon int Beraberlikoa bir 27-29 G iğne ile şırınga ve kuyruk dibinde iğneyi (~ çizgisi 5 mm) eğim ile yukarı bakacak ve partikül süspansiyonu 22 50 ul enjekte edilir.
    5. Aşırı geri akışı önlemek ve iğneyi çekin eşitlemek için baskı için birkaç saniye bekleyin. Her iki drenaj kasık LN hedef kuyruk tabanının diğer tarafta enjeksiyon tekrarlayın.
  3. Konfokal mikroskobu ile lenf nodu cryosections hazırlanması ve incelenmesi.
    1. Bir IACUC hayvan protokolü onayladı göre uyarılan pnömotoraks ardından CO 2 boğulma ile fare, Euthanize. Bedoya 23 gösterilen protokole uygun olarak kasık lenf nodları ekstrakte edin ve 4 ° C'de PBS içinde 1 ml dokuları yerleştirerek kan yıkayın.
    2. Dokularıyla dokulardan PBS emilmesini ve doku cryomolds doku yer (10 x 10 x 5 mm3) Ekim ortamı 24 donan üstüne önceden doldurulmuş. Yapış tis dondurmak30 saniye için sıvı azot içinde blok dava. Seçenek olarak ise, 30 dakika boyunca kuru buz üzerinde doku bloğu yerleştirin. ° C derin dondurucuda -80 dondurulmuş doku saklayın.
    3. -20 ° C'de 24 ayarlanmış bir kriyostat 5-10 mikron kalınlığında doku bölümleri kesin.
    4. Gerekirse, immunofloresan etiketleme gerçekleştirmek ve daha önce 24 gösterildiği gibi konfokal mikroskobu ile doku inceleyin.

Antijen-spesifik 3. İzleme Genişleme, Tüm Hayvan Görüntüleme ile Nanopartikül Aşı sonrası CD8 + T Hücreleri Lusiferaz-ifade

  1. OT-I / Luc transgenik farelerden OVA257-264-spesifik, lusiferaz sentezleyen CD8 + T hücrelerinin izolasyonu
    1. CO 2 boğulma ile bir OT-I / Luc transgenik fare Euthanize ve bir IACUC göre pnömotoraks hayvan protokolü onayladı neden olur. Pankreas 23 doku ayrılmakta dikkatle periton boşluğuna erişim ve steril bir şekilde dalak Hasat vedoku kültürü kaputu transferi için 4 ° C PBS +% 2 FBS içinde 5 ml bir yer.
    2. (Bir seferde 3 dalak kadar) 50 ml konik santrifüj tüpü üzerinde 70 mikron naylon süzgeç üzerinde dalak yerleştirin. 3 ml şırınga bir dalgıç kullanarak, süzgeç vasıtasıyla hücrelere eziyet.
    3. Piston ve PBS +% 2 FBS ile süzgeç yıkayın ve atın. 300 x g, 10 dakika boyunca, 10 ml / 50 ml tüp içinde dalak toplam hacmi getirmek hemositometre ile saymak için hücre süspansiyonu küçük bir örnek alır ve santrifüjlenir.
    4. Ticari olarak mevcut olan manyetik negatif seçim seti kullanılarak, imalatçının talimatları izlenerek CD8 + T hücre popülasyonu izole eder.
    5. Hücrelerin PBS ile yıkandıktan sonra, izole edilmiş CD8 + T hücrelerinin sayısı. Izole edilmiş CD8 + T hücrelerinin saflığını değerlendirmek için, daha sonra αCD8 APC antikorun 20 ul, 10 dakika süre ile, fare CD16 / 32 antikoru (0.025 mg / ml) 20 ul ~ 20.000-30.000 hücrelerin inkübe (0.005 mg / ml) ve 30 dakika boyunca inkübe edin. PeBSA a / h PBS içinde 4 ° C'de +% 1 Bütün inkübasyonlar, rform. Akım sitometri analizi 25 gerçekleştirin.
  2. Genişleme sonrası aşılama evlatlık izole CD8 + T hücrelerinin transferi ve görselleştirme
    1. Intravenöz kuyruk damarından 22 (gün -1) ile PBS içinde 200 ul hacim içinde 1-10 x 10 5 hücre uygulanmasıyla saf C57BL / 6 farelerine izole OT-I / Luc CD8 + T hücrelerinin adoptif transferini gerçekleştirir. C57BL / 6 farelerde bu kürk ve siyah deri yamaları dikkate alındığında bioluminescent sinyal engel olabilir, traş albino C57BL / 6 fareler bu çalışmalar için idealdir.
    2. Daha önce (bölüm 2.2) açıklandığı gibi bir gün (gün 0) sonra aşı yönetmek.
    3. Intraperitonal PBS 300 ul hacim içinde kg fare vücut ağırlığı başına luciferase 150 mg uygulayın. 10 dakika sonra, (aşama 2.2.1 gibi) izofluran fareler anestezi ve 5-10 dakika w biyoışıldama sinyali alarak OT-I / Luc CD8 + T hücreleri görselleştirmekBir bütün hayvan görüntüleme sistemi i (IVIS, detaylı talimat Wilson 26 bakınız). Uzunlamasına çalışmalar için gerekli tekrarlayın.

Analiz PBMC'ler 4. Peptid-MHC tetramer boyama antijene özgü CD8 + T hücreleri,

Not: Aşağıdaki protokol prosedürü adoptif adoptif transfer olmadan OT-I / Luc CD8 + T hücreleri ya da C57BL / 6 fareler ile transfer C57BL / 6 fareleri kullanılarak gerçekleştirilebilir.

  1. Aşılamadan sonra, arzu edilen bir zaman noktasında, K 2 EDTA ile kaplanmış bir tüp içine submandibuler kanama tekniği 27 vasıtasıyla farelerden kan yaklaşık 100 ul (4-6 damla) toplamak ve pıhtılaşmayı önlemek için birkaç kez ters çevirin.
  2. Bir mikrosantrifüj tüpüne kan 100 ul aktarma liziz tamponu için 1 ml ekleyin ve kırmızı kan hücrelerini (RBC) ortadan kaldırmak amacıyla 2 dakika ila 3 inkübe edin. Santrifüj örnekleri 1,500 xg'de 5 dakika boyunca ve supernatant çıkarın. Yine de pelet halinde(RBCs eksik kaldırılmasını belirtir) kırmızı ppears, lizis tamponu kısa bir inkübasyon (<1 dakika) ile parçalama adımı tekrarlayın.
  3. 5 dakika boyunca 1,500 x g'de 1 (/ hac BSA, PBS +% 1) FACS tamponu ilave edildi ve santrifüj ile geriye kalan PBMC'ler yıkayın.
  4. Aspire süpernatan ve spesifik olmayan ve FcR aracılı antikor engellemek için fare CD16 / 32 antikorunun 20 ul örnek (0.025 mg / ml) yeniden süspanse edin. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin.
  5. 4 ml yuvarlak dipli FACS tüpler içine mikrosantrifüj tüpler hücreleri aktarın. Her bir örnek için, üreticinin spesifikasyonlarına göre OVA Tetramer-SIINFEKL-PE çözelti B, H-2K 20 ul eklenir ve buz üzerinde 30 dakika inkübe edilir.
  6. Antikor kokteyli hazırlayın (örneğin, αCD8-APC, αCD44-FITC ve αCD62L-PECy7 antikorlar (sırasıyla 0.005, 0.005, ve 0.002 mg / ml konsantrasyon)). Her bir deney örneği 20 ul ekleyin ve buz üzerinde 20 dakika inkübe edilir. La tarafından tek fluorofor kontrolleri hazırlayınYukarıda belirtilen konsantrasyonda her florofor ile işaretlenmiş tetramer veya antikor ile hücreler Beling.
  7. FACS tamponu ile 2 kez yıkanır ve DAPI 2 ug / ml ihtiva eden FACS tamponu nihai pelletini. analizi (ayrıntılar ve örnekler Scheffold 25 bulunabilir) sitometri hücreleri artık akışı için hazırız.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

ICMVs sentezinde yer alan basamaklar, Şekil 1 '6'da tasvir edilmiştir. Kısaca, bir lipofilik ilaçlar ya da floresan boyalar ihtiva eden bir lipid filmi hidrofilik ilaçların mevcudiyetinde hidratlanır. Örneğin Ca2 + gibi iki değerli katyonlar, çok katmanlı vezikülleri içine anyonik lipozomların füzyon sürmek için ilave edilir. DTT gibi, yağ katmanları apposing, ve son olarak, dış maleimid grupları, kalan "elyaf" maleimid işlevselleştirilmiş lipidlere eklenir ditiyo...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu makalede sağlanan protokol ICMVs olarak adlandırılan sentezi ve yeni bir lipid bazlı nanopartikül sisteminin karakterizasyonu açıklanmaktadır, ve antijene spesifik CD8 + T hücresi tepkilerini indükleme nanopartikül bazlı aşı formülasyonlarının etkinliğinin doğrulanması için bir işlem sağlar. ICMV sentezi genellikle kaybı ile sonuçlanan, tipik olarak hazırlanması için, organik çözücüler gerektiren diğer yaygın olarak kullanılan polimer nano partikül sistemleri (örneğin, poli (laktid-ko-glikolit) asit parçacık...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Perkin Elmer, bu makalenin yayınlanması sırasında katlanılan üretim maliyeti sağladı.

Teşekkürler

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüsü 1K22AI097291-01 hibe tarafından desteklenen ve Ödül Numarası UL1TR000433 altında Ulusal Sağlık Enstitüleri Translasyonel Bilimler ilerlemek için Ulusal Merkezi tarafından yapıldı. Biz de aşı nanopartiküller ve OT-I / Luc transgenik fareler üzerinde ilk çalışmaları katkılarından dolayı Fred Hutchinson Kanser Merkezi'nde MİT ve Prof. Matthias Stephan Prof. Darrell Irvine kabul etmiş sayılırsınız.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

3. Tüm hayvan görüntüleme ile nanopartikül aşılamasından sonra antijene özgü, lusiferaz eksprese eden CD8 + T hücrelerinin genişlemesinin izlenmesi
Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1. Protein antijeni ve adjuvan moleküllerle birlikte yüklenmiş ICMV'lerin sentezi ve karakterizasyonu
1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin-N-[4- ( p < / em >-maleimidofenil) butiramide] (sodyum tuzu) (MPB)Avanti Polar Lipids, INC.
1,2-dioleoil- sn< / em>-glisero-3-fosfokolin (DOPC)Avanti Polar Lipids, INC.
Monofosforil Lipid A (Sentetik) (PHAD™) (MPLA)Avanti Polar Lipids, INC.699800
20 ml cam şişelerWheaton0334125D
Symphny Vakumlu FırınVWR414004-580
Ovalbumin (OVA)Worthington3054
Bis-Tris Propan (BTP)FisherBP2943
Q125 Sonikatör (125 & nbsp; W/20  kHz)QsonicaQ125-110
Dithiothreitol (DTT)FisherBP172
2 kDa Tiyollenmiş Polietilen Glikol (PEG-SH)Laysan BioMPEG-SH-2000-1g
Malvern ZetaSizer Nano ZSP Malvern
ZetaSizer KüvetleriMalvernDTS1070
2. Floresan işaretli ICMV'lerin lenf nodu drenajının konfokal mikroskopi ile incelenmesi
1,1'-Dioktadesil-3,3,3',3'-Tetrametilindodikarbosiyanin, 4-Klorobenzensülfonat Tuzu (DID)Life TechnologiesD-7757
Alexa Fluor 555-süksinimidil ester (AF555-NHS)Life TechnologiesA37571
Doku-Tek OCT dondurma ortamı VWR25608-930
Doku KriyokalıplarıVWR25608-922
C57BL/6 farelerJackson000664
Albino C57BL/6 farelerJackson000058
OT-1 C57BL/6 farelerJackson003831
70 μ m naylon süzgeçBD352350
EasySep™ Fare CD8+ T Hücre İzolasyon KitiStemCell19853
IVIS® tüm hayvan görüntüleme sistemiPerkin Elmer
4. Antijene özgü CD8+ T hücrelerinin akış sitometrik analizi için periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC'ler) peptit-MHC tetramer boyaması
K2EDTA tüpleriBD365974
ACK lizis tamponuYaşam TeknolojileriA10492-01 
Anti-CD16 / 32 Fc BlokEbioscience14-0161-86
H-2K < sup>b< / sup> OVA TetramerMBLTS-5001-1C
Anti-CD8-APCBD553031
Anti-CD44-FITCBD553133
Anti-CD62L-PECy7Ebioscience25-0621-82
4 & prime;, 6- Diamidino-2-fenilindol dihidroklorür (DAPI)SIGMAD8417-10MG
CyAn Akış SitometresiBeckman Coulter
FlowJo YazılımıFlowJo
870012850375<td colspan="4">

Kaynaklar

  1. Irvine, D. J., Swartz, M. A., Szeto, G. L. Engineering synthetic vaccines using cues from natural immunity. Nature materials. 12, 978-990 (2013).
  2. Moon, J. J., Huang, B., Irvine, D. J. Engineering nano- and microparticles to tune immunity. Advanced materials. 24, 3724-3746 (2012).
  3. Sahdev, P., Ochyl, L. J., Moon, J. J. Biomaterials for nanoparticle vaccine delivery systems. Pharmaceutical Research. , (2014).
  4. Zhao, L., et al. Nanoparticle vaccines. Vaccine. 32, 327-337 (2014).
  5. Riet, E., Ainai, A., Suzuki, T., Kersten, G., Hasegawa, H. Combatting infectious diseases; nanotechnology as a platform for rational vaccine design. Advanced drug delivery reviews. 74C, 28-34 (2014).
  6. Moon, J. J., et al. Interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles as synthetic vaccines for potent humoral and cellular immune responses. Nature Materials. 10, 243-251 (2011).
  7. Moon, J. J., et al. Enhancing humoral responses to a malaria antigen with nanoparticle vaccines that expand Tfh cells and promote germinal center induction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 1080-1085 (2012).
  8. DeMuth, P. C., Moon, J. J., Suh, H., Hammond, P. T., Irvine, D. J. Releasable layer-by-layer assembly of stabilized lipid nanocapsules on microneedles for enhanced transcutaneous vaccine delivery. ACS Nano. 6, 8041-8051 (2012).
  9. Li, A. V., et al. Generation of Effector Memory T Cell-Based Mucosal and Systemic Immunity with Pulmonary Nanoparticle Vaccination. Science Translational Medicine. 5, 204ra130(2013).
  10. Stephan, M. T., Moon, J. J., Um, S. H., Bershteyn, A., Irvine, D. J. Therapeutic cell engineering with surface-conjugated synthetic nanoparticles. Nature Medicine. 16, 1035-1041 (2010).
  11. Murdock, R. C., Braydich-Stolle, L., Schrand, A. M., Schlager, J. J., Hussain, S. M. Characterization of nanomaterial dispersion in solution prior to In vitro exposure using dynamic light scattering technique. Toxicological Sciences. 101, 239-253 (2008).
  12. Manolova, V., et al. Nanoparticles target distinct dendritic cell populations according to their size. European Journal of Immunology. 38, 1404-1413 (2008).
  13. Reddy, S. T., et al. Exploiting lymphatic transport and complement activation in nanoparticle vaccines. Nature Biotechnology. 25, 1159-1164 (2007).
  14. Kaur, R., Bramwell, V. W., Kirby, D. J., Perrie, Y. Manipulation of the surface pegylation in combination with reduced vesicle size of cationic liposomal adjuvants modifies their clearance kinetics from the injection site, and the rate and type of T cell response. Journal of Controlled Release. 164, 331-337 (2012).
  15. Zhuang, Y., et al. PEGylated cationic liposomes robustly augment vaccine-induced immune responses: Role of lymphatic trafficking and biodistribution. Journal of Controlled Release. 159, 135-142 (2012).
  16. Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
  17. Clarke, S. R. M., et al. Characterization of the ovalbumin-specific TCR transgenic line OT-I: MHC elements for positive and negative selection. Immunology and Cell Biology. 78, 110-117 (2000).
  18. Azadniv, M., Dugger, K., Bowers, W. J., Weaver, C., Crispe, I. N. Imaging CD8(+) T cell dynamics in vivo using a transgenic luciferase reporter. International Immunology. 19, 1165-1173 (2007).
  19. Kim, D., Hung, C. F., Wu, T. C. Monitoring the trafficking of adoptively transferred antigen- specific CD8-positive T cells in vivo, using noninvasive luminescence imaging. Human gene therapy. 18, 575-588 (2007).
  20. Rabinovich, B. A., et al. Visualizing fewer than 10 mouse T cells with an enhanced firefly luciferase in immunocompetent mouse models of cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 14342-14346 (2008).
  21. Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274, 94-96 (1996).
  22. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats. Journal of Visualized Experiments. , e2771(2012).
  23. Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin Iii, J. Isolation and Th17 Differentiation of Naive CD4 T Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. , e50765(2013).
  24. Chen, Y., et al. Visualization of the interstitial cells of cajal (ICC) network in mice. Journal of Visualized Experiments. , (2011).
  25. Scheffold, A., Busch, D. H., Kern, F. In Cellular Diagnostics Basics, Methods and Clinical Applications of Flow Cytometry. Karger. Sack, U., Tárnok, D. H., Rothe, G. , 476-502 (2009).
  26. Wilson, K., Yu, J., Lee, A., Wu, J. C. In vitro and in vivo Bioluminescence Reporter Gene Imaging of Human Embryonic Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. , e740(2008).
  27. Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Animal. 34, 39-43 (2005).
  28. Tilney, N. L. Patterns of lymphatic drainage in the adult laboratory rat. Journal of Anatomy. 109, 369-383 (1971).
  29. Stivaktakis, N., et al. PLA and PLGA microspheres of beta-galactosidase: Effect of formulation factors on protein antigenicity and immunogenicity. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 70A, 139-148 (2004).
  30. Bilati, U., Allemann, E., Doelker, E. Nanoprecipitation versus emulsion-based techniques for the encapsulation of proteins into biodegradable nanoparticles and process-related stability issues. AAPS PharmSciTech. 6, E594-E604 (2005).
  31. Blander, J. M., Medzhitov, R. Toll-dependent selection of microbial antigens for presentation by dendritic cells. Nature. 440, 808-812 (2006).
  32. Iwasaki, A., Medzhitov, R. Regulation of adaptive immunity by the innate immune system. Science. 327, 291-295 (2010).
  33. Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Quarterly reviews of biophysics. 21, 129-228 (1988).
  34. Vinson, P. K., Talmon, Y., Walter, A. Vesicle-micelle transition of phosphatidylcholine and octyl glucoside elucidated by cryo-transmission electron microscopy. Biophysical Journal. 56, 669-681 (1989).
  35. Schagger, H. Tricine-SDS-PAGE. Nature Protocols. 1, 16-22 (2006).
  36. Chevallet, M., Luche, S., Rabilloud, T. Silver staining of proteins in polyacrylamide gels. Nat Protoc. 1, 1852-1858 (2006).
  37. Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nature Reviews Immunology. 5, 617-628 (2005).
  38. Liu, H., et al. Structure-based programming of lymph-node targeting in molecular vaccines. Nature. 507, 519-522 (2014).
  39. Xu, Z., et al. Multifunctional nanoparticles co-delivering Trp2 peptide and CpG adjuvant induce potent cytotoxic T-lymphocyte response against melanoma and its lung metastasis. Journal of Controlled Release. 172, 259-265 (2013).
  40. Hailemichael, Y., et al. Persistent antigen at vaccination sites induces tumor-specific CD8(+) T cell sequestration, dysfunction and deletion. Nature Medicine. 19, 465(2013).
  41. Slingluff, C. L., et al. Phase I trial of a melanoma vaccine with gp100(280-288) peptide and tetanus helper peptide in adjuvant: Immunologic and clinical outcomes. Clinical Cancer Research. 7, 3012-3024 (2001).
  42. Speiser, D. E., et al. Rapid and strong human CD8(+) T cell responses to vaccination with peptide, IFA, and CpG oligodeoxynucleotide 7909. Journal of Clinical Investigation. 115, 739-746 (2005).
  43. Araki, K., et al. mTOR regulates memory CD8 T-cell differentiation. Nature. 460, 108-112 (2009).
  44. Masopust, D., Vezys, V., Marzo, A. L., Lefrancois, L. Preferential localization of effector memory cells in nonlymphoid tissue. Science. 291, 2413-2417 (2001).
  45. Cuburu, N., et al. Intravaginal immunization with HPV vectors induces tissue-resident CD8+ T cell responses. Journal of Clinical Investigation. 122, 4606-4620 (2012).
  46. Ahlers, J. D., Belyakov, I. M. Memories that last forever: strategies for optimizing vaccine T-cell memory. Blood. 115, 1678-1689 (2010).
  47. Seder, R. A., Darrah, P. A., Roederer, M. T-cell quality in memory and protection: implications for vaccine design. Nature Reviews Immunology. 8, 247-258 (2008).
  48. Barber, D. L., et al. Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection. Nature. 439, 682-687 (2006).
  49. Wherry, E. J., et al. Molecular signature of CD8+ T cell exhaustion during chronic viral infection. Immunity. 27, 670-684 (2007).
  50. Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. Journal of Immunological Methods. 65, 109-121 (1983).
  51. Foster, B., Prussin, C., Liu, F., Whitmire, J. K., Whitton, J. L. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. Current Protocols in Immunology. Chapter 6 (Unit 6 24), (2007).
  52. Wonderlich, J., Shearer, G., Livingstone, A., Brooks, A. Induction and measurement of cytotoxic T lymphocyte activity. Current protocols in immunology. Chapter 3 (Unit 6 24), (2006).
  53. Betts, M. R., et al. Sensitive and viable identification of antigen-specific CD8+T cells by a flow cytometric assay for degranulation. Journal of Immunological Methods. 281, 65-78 (2003).
  54. Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14, 181-196 (1968).
  55. Noto, A., Ngauv, P., Trautmann, L. Cell-based flow cytometry assay to measure cytotoxic activity. Journal of Visualized Experiments. , e51105(2013).
  56. Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. Journal of visualized experiments. , e51627(2014).
  57. Crotty, S. Follicular helper CD4 T cells (TFH). Annual review of immunology. 29, 621-663 (2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Antijen spesifik CD8 T H creleriAk SitometrisiBiyol minesans G r nt lemeTetramer BoyamaPeriferik Kan Monon kleer H creleriDinamik I k Sa lmasZeta Potansiyel AnaliziKonfokal Mikroskopi

İlgili makaleler