Yöntem makalesi

Ekstraselüler DNA Yayın Yüksek Verimli Ölçme ve İnsan Nötrofiller Kantitatif NET Oluşumu İn Vitro

DOI:

10.3791/52779

⸱

18 Haziran 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Infectious Diseases, University of Georgia

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan nötrofillerinden NET salınımını ölçmek için mükemmel araçlar sağlayan yüksek verimli testler sunulmaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nötrofil granülositler, insan kanında en bol bulunan lökositlerdir. Nötrofiller, enfeksiyon bölgesine ilk gelenlerdir. Nötrofiller, fagositoz, degranülasyon ve nötrofil hücre dışı tuzakların (NET'ler) oluşumu dahil olmak üzere çeşitli antimikrobiyal mekanizmalar geliştirdi. NET'ler, histonlarla süslenmiş bir DNA iskelesi ve miyeloperoksidaz (MPO) ve insan nötrofil elastazı (HNE) dahil olmak üzere çeşitli granül belirteçlerinden oluşur. NET salınımı, nötrofillerin karakteristik morfolojik değişikliklerini içeren ve DNA'larının hücre dışı boşluğa atılmasına yol açan aktif bir süreçtir. NET'ler mikroplarla savaşmak için gereklidir, ancak NET'lerin kontrolsüz salınımı çeşitli bozukluklarla ilişkilendirilmiştir. Klinik alaka düzeyi ve NET oluşum mekanizması hakkında daha fazla bilgi edinmek için, NET kantitasyonu yapabilen güvenilir araçlara ihtiyaç vardır.

Burada, insan nötrofillerinden NET salınımını in vitro olarak değerlendirebilecek üç yöntem sunulmaktadır. Birincisi, zar geçirimsiz bir DNA bağlayıcı boya kullanarak insan nötrofillerinden hücre dışı DNA salınımını ölçmek için yüksek verimli bir testtir. Ek olarak, NET'e özgü MPO-DNA ve HNE-DNA komplekslerinin seviyelerini ölçerek NET oluşumunu ölçebilen iki başka yöntem daha tanımlanmıştır. Bu mikroplaka bazlı yöntemler kombinasyon halinde, insan nötrofillerinin NET oluşumunun mekanizmasını ve düzenlenmesini verimli bir şekilde incelemek için harika araçlar sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NET oluşumu, nötrofillerin patojenlerle savaştığı yeni bir mekanizmadır. 1 NET'lerin çekirdeği nükleer DNA'dır. 1 Bu DNA ağı, nötrofil granül proteinleri ve histonlarla ilişkilidir. 1 NET oluşumunun ana formu, kromatin deyoğunlaşması, granüler ve nükleer zarların kaybolması, nötrofil elastazın çekirdeğe translokasyonu, histonların sitrülinasyonu ve son olarak DNA bazlı NET'lerin dökülmesi ile karakterize edilen nötrofillerin ölümünü gerektirir. 2 NET'ler çok çeşitli mikropları yakalar ve öldürür ve doğuştan gelen bağışıklık silahı repertuarının önemli bir parçasıdır. Bununla birlikte, kontrolsüz NET oluşumu çok sayıda otoinflamatuar hastalıkla ilişkilendirilmiştir. 3,4 Giderek daha fazla yerleşen ilgilerine rağmen, NET sürümünün mekanizması ve düzenlenmesi hakkında çok az şey bilinmektedir.

NET salgılayarak ölen nötrofiller, apoptotik veya nekrotik nötrofillerden farklıdır. 3,5 NET salgılayan nötrofiller, NET oluşumu için karakteristik olan çeşitli özellikler gösterir. Granül bileşenleri NET'lerde DNA ile ilişkilidir. 1 Miyeloperoksidaz (MPO) ve insan nötrofil elastazı (HNE), dinlenme hücrelerindeki primer granüllerde bulunur, ancak NET'lerde DNA'ya bağlanmak için çekirdeğe translokasyon yapar. 1 MPO-DNA ve HNE-DNA kompleksleri NET'lere özgüdür, apoptotik veya nekrotik nötrofillerde oluşmaz. 1,3,5 Kromatin dekondensasyonu, NETosis için tipik olan başka bir özelliktir. 2 NET salınımı ayrıca histonların peptidil aminidaz 4 (PAD4) ile sitrülinasyonunu gerektirir. 6 Sitrüline histonlar, NET salınımı geçiren nötrofillerin ayırt edici özellikleridir. 6

Burada, NET'leri yüksek verimli bir ölçekte ölçmek için mükemmel araçlar sağlayan üç yöntem tanıtılmıştır. İlk tahlil, sahada farklı değişikliklerle kullanılmış ve hücre dışı DNA salınımını mikroplaka formatında kantitatif hale getirmiştir. İkinci ve üçüncü tahliller, NET'e özgü MPO-DNA ve HNE-DNA komplekslerini ölçerek NET'lerin doğrulanmasını sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Georgia Üniversitesi Kurumsal Değerlendirme Kurulu sağlıklı gönüllülere (UGA # 2012-10769-06) periferik kan toplamak için insan konu çalışmayı onayladı. 5,7,8 Gönüllüler kan beraberlik önce gerekli bilgilendirilmiş onam formunu imzaladı. Bu makalede yapılan araştırmalar Helsinki Bildirgesi'nin insan denekler üzerinde tıbbi araştırmalar için etik kurallarına uygun olduğunu.

Periferik İnsan Kanı adlı Nötrofiller 1. izolasyonu (Şekil 1)

Not: Periferik kan nötrofillerin izole edilmesi için çeşitli yollar vardır. Aşağıdaki protokol, bir imkanı sağlar. Bu protokol, dış uyarım üzerine NET'leri salabilen aktif olmayan, insan nötrofil sayıda verir. 40 ml delme ile sağlıklı gönüllülerden elde edilen tam kan kullanın. 7,9

  1. iki adet 50 ml konik tüpler içine kısım 20 ml kan. 10 mi% 6 Dekstran ekleyin. hafifçe karıştırın.
  2. 20 dakika transferi lökosit ric sonratemiz 50 ml'lik konik tüpler içine herhangi peletlenmiş kırmızı kan hücrelerinin alarak ve steril PBS ile doldurmak olmadan h üst faz.
  3. 400 x g'de 10 dakika santrifüje. 4 ml süspanse pelet PBS steril.
  4. % 85 5-adım Percoll degrade hazırlayın -80% -75% -70% -65% iki 15 ml konik tüpler ve katman 2 ml lökosit süspansiyonu her degrade üstünde.
  5. frenler kapalı olarak 30 dakika boyunca Santrifüj 800 xg.
  6. tüm hücreler% 75 /% 80 tabakalarında (nötrofilleri) ve% 70 /% 75 arayüzü toplayın.
  7. PBS içinde iki kez (350 xg, 10 dakika, RT) hücre yıkayın ve bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.

Bir Mikroplaka florimetrede Kullanarak Hücre dışı DNA Yayın Kinetiği 2. Ölçüm

Not: Bu yöntem, bir zara-geçirmeyen DNA bağlayıcı 96 oyuklu bir mikro-plaka biçiminde DNA serbest gösterge boya (Şekil 2) arasında floresan değişikliklerin ölçülmesini sağlar.

  1. + Deney ortamı içinde nötrofil bir süspansiyonu (HBSS hazırlanması2 x 10 6 hücre / ml'lik bir konsantrasyonda,% 1 (h / h) otolog serum + 5 mM glükoz).
  2. Zarın geçirgenlik göstermediği bir DNA bağlayıcı boya 5 umol / L ekleyin. hafifçe karıştırın.
  3. Kısım İnsan nötrofilleri (50 ul / oyuk) 96 çukurlu mikrolevhaların siyah şeffaf dibine. Emin deney ortamı kuyunun tüm alt kapsar emin olun. Değilse, yan hafifçe plaka dokunun.
  4. 37 ° C'de 10 dakika süreyle plaka içeren nötrofillerin ısıtın.
  5. Bu sırada nihai konsantrasyonlarının iki katı uyaranların çözümler hazırlamak kullanılmak üzere (37 ° C sıcak bir deney ortamı içinde). Pozitif NET kontrolü maksimum NET salınımını tetiklemek için 4 saat boyunca 100 nM forbol-miristat-asetat (PMA) insan nötrofilleri kullanmak spontan NET oluşumu düşük 5,8 kalır. 4 saat boyunca 5,8 PMA uyarımı maksimal NET salınımını sağlar.
  6. Ölçme (4 saat, 37 ° C, uyarma için 530 nm ve emisyon 590 nm) için mikroplak florimetresi hazırlayın.
  7. 50 ul nötrofil süspansiyonlar 50 ul uyaran çözeltisi ilave edilerek nötrofillerin uyarırlar. Maksimal bir DNA salma sinyalinin ölçülmesi de bir 0.5 ug / ml saponin kullanın.
  8. okuyucusunda plaka koyun ve hiçbir çalkalanarak her 2 dakikada 4 saat floresan değişiklikleri ölçer.
  9. Veri analizi için, zamanla floresan normalize artışlar hesaplar.
    1. Saponin dahil olmak üzere tüm kuyuları için son nokta değerleri çıkarınız, taban floresans (Şekil 2A, B). saponin floresan artış en yüksek sinyal olmalıdır. Bu "olarak maksimum DNA serbest" (Şekil 2A) olarak ifade edilir.
    2. maksimal DNA salınımı ile bilinmeyen numunelerin floresan artışlar bölerek bilinmeyen örneklerinde DNA sürümü yüzdelerini hesaplayınız.
    3. Çoğaltır ortalama sonuçları ve "maksimal DNA sürüm%" (Şekil 2C) olarak sunuyoruz.

NET Formu 3. kantitasyonuMPO-DNA ve HNE-DNA ELISA tahlilleri ile tirme

Not: laboratuvarımızda Bu tahliller, modifiye edilmiş (MPO-DNA) ya da kuruldu (HNE-DNA) MPO-DNA ve HNE-DNA kompleksleri seviyeleri ölçülerek NET oluşumu miktarının 5.

  1. Ceket 96 oyuklu yüksek bağlama gece boyunca antikorlarla (50 ul / kuyucuk) kapasitesi ELISA plakaları: Anti-MPO (1: 2000 seyreltme) ya da anti-HNE (1: 2,000).
  2. PBS ile yıkayın ELISA plakaları, üç kez (200 ul / oyuk) ve oda sıcaklığında 2 saat süre ile% 5 BSA ve% 0.1 insan serum albümini ile bloke (200 ul / oyuk). PBS ile üç kez yıkanır.
  3. Tohum 96 oyuklu mikro / göz 100 ul deney ortamı içinde 100,000 hücre yoğunluğunda nötrofiller ve NET oluşumunu uyarır. hücreleri inkübe: 37 ° C 4 saat.
  4. iyice karıştırın, nötrofil Süpernatantları 2 U / ml DNaz ekleyerek sınırlı DNase sindirim gerçekleştirin. Oda sıcaklığında tutun.
  5. 11 ul 25 mM EGTA (nihai konsantrasyon 2.5 mM) eklenerek 15 dakika sonra DNase durdurun. İyice karıştırın. SU toplayınTemiz mikrofuj tüpleri içerisinde pernatants. Spin örnekleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 xg'de hücre enkaz kurtulmak için. Temiz mikrofuge'de tüpler içine onların süpernatantlar aktarın. hazır olana kadar buz üzerinde saklayın.
  6. önceden hazırlanmış "NET standart" bir kısım kullanın.
    Not: NET standardı en az 5 farklı, bağımsız insan vericilerden elde edilen PMA ile uyarılmış nötrofil DNaz ile sindirilmiş yüzer bir karışımıdır.
    1. , Uzun bir süre aynı standart kullanmak toplamak ve her donörden nötrofil süpernatantlar büyük bir ses bölmeyin için. Örneğin PMA ile uyarılan nötrofil DNaz ile sindirilmiş yüzer 2 ml toplama 200 alikotları 200 ELISA plakaları için yeterli (10 ul her) neden olur. NET standart karakterize eden veriler, Şekil 5'de görülmektedir.
    2. 4 saat boyunca 100 nM PMA insan nötrofilleri uyarır ve DNaz adımları 3,4-3,5 göre kendi süpernatanlanna sindirmek geçerlidir.
    3. Toplama, havuz alikotu (10 ul) ve serbestze (-20 ° C), nötrofil süpernatanlar.
    4. en az beş ayrı donörlerden elde edilen bir kısım / donör çözülme, "standart NET" hazırlamak için, bunları karıştırın ve buz üzerinde saklayın.
    5. çözülmüş örnekleri atın ve bir sonraki deney için taze olanları kullanın.
    6. PBS + EGTA NET-standart 2 seri seyreltme: 1 hazırlayın.
  7. DNase1-sindirilmiş örnekleri (standart ve bilinmeyen süpernatantlar) PBS + EGTA içinde 20-kat seyreltilir ve yakalama antikorları ile kaplanmış ELISA plakaları üzerinde bunları kısım.
  8. 4 ° C'de gece boyunca ELISA inkübe edin ve PBS ile uygun üç kez yıkayın.
  9. Algılama antikoru solüsyonu halinde (100 ul / oyuk): turp peroksidaz konjuge anti-DNA antikoru (1: 500, fare). Karanlıkta 1 saat süreyle inkübe edin.
  10. PBS ile dört kez yıkamadan sonra, TMB peroksidazı substrat ekleyin: 100 ul / oyuk, 30 dak. Mavi bir renk peroksidaz aktivitesi (mevcut NET) için bir göstergesidir.
  11. de 100 ul / 1 M HCI ilave ederek reaksiyonu durdurun.mavi çözümler sarı (Şekil 5A) dönecek.
  12. bir mikro-fotometre kullanılarak 450 nm'de absorbansı okumak.
  13. Veri analizi için, NET standardına göre MPO-DNA veya HNE-DNA kompleksleri miktarını hesaplayın.
    1. bütün örneklerden, deney ortamı GEÇMİŞİ optik yoğunluk değeri çıkarın.
    2. Nispi net içeriği (Y-ekseni) (Şekil 5A) karşı seyreltilmiş standart numunelerin absorbans değerlerine (X-ekseni) çizilir.
    3. Bu standart eğrinin nonsaturated aralığını kullanarak (Şekil 5A) (kullanılan yazılım en iyi üstel uyum kullanın) bir trend çizgisi kurmak. Bu eğilim çizgisinin denklemi NET'ler miktarda nicel OD değerlerinin dönüşüm belirler.
    4. NET-standart (Şekil 5A) yüzdesi olarak bilinmeyen numunedeki NET'ler miktarda verecektir 3.13.3 den trend çizgisi denklemi içine bilinmeyenler ölçülen OD değerlerini yerleştirin.
    5. Hesaplamakçoğaltır (üç kez) ortalamaları ve (Şekil 5C) "MPO-DNA veya HNE-DNA kompleksleri (standardın%) miktarı" olarak son verileri sunmak.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yazıda rakamlar. Nötrofil izolasyon, deneysel prosedürler ve veri analizi açıklama ile mevcut temsilcisi sonuçları yöntemi tarif 1 insan nötrofil hazırlık ardışık adımları göstermektedir. Bu protokol nötrofil izolasyon tek olası yolu temsil eder. Bu stimülasyon üzerine NET'leri salabilen nötrofillerin istirahat büyük miktarda verir. Floresan bazlı DNA salınım testi nasıl çalıştığını 2 gösterileri Şekil. İnsan nötrofil...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NET'ler NET'ler edebiyat sürekli, biyoloji, mekanizma ve yönetmelik rollerine ilişkin birkaç önemli soru belirsizliğini koruyor onların keşfinden bu yana geçen on yıllar içinde genişleyen olmasına rağmen patojenleri öldürmek. 1 nötrofil hangi büyüleyici yeni bir mekanizma temsil etmektedir. Uygun metodoloji NET'leri, bu çok benzersiz antimikrobiyal mekanizma ölçmek için geliştirilmiş olmalıdır. Bu makalede, bir yüksek verimli bir şekilde netler ölçmek için kullanılan yöntemler açıklanmaktadır. İlk...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan nötrofillerini izole etme konusundaki çalışmalarımıza sürekli destek verdikleri için Georgia Üniversitesi Sağlık Merkezi laboratuvar personeline özel teşekkürler. Bu çalışma, UGA Araştırmadan Sorumlu Başkan Yardımcılığı Ofisi tarafından sağlanan Dr. Rada'nın başlangıç fonu tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Anti-İnsan Nötrofil Elastaz  Tavşan Ab Calbiochem4810011:2.000x kaplamalı
Anti-Miyeloperoksidaz Ab (Tavşan)Millipore07-4961:2.000x kaplamalı
DNaz-1Roche10-104-159-0011 &# 181; Sindirim için kullanılan g/ml
20 mM EGTA/ PBSSigma-AldrichE3889-25G
2.5 mM EGTA/PBSSigma-AldrichE3889-25G
Hücre ölümü tespiti ELISA Anti-DNA PODRoche115446750011:500x 
Eon Mikroplaka SpektrofotometresiBiotek
Gen5 Hepsi Bir Arada mikroplaka yazılımıBiotekanalitik aracı (ELISA)
Sytox turuncuYaşam TeknolojisiS11368%0,2 nihai konsantrasyon/hacim
1 M HepesCellgro25-060-Cl10 mM nihai konsantrasyon kullanın.
1 M glikozSigma5 mM nihai konsantrasyon kullanın.
HBSSCorning21-023-CM
Varioskan Flash Ver.2.4.3Termobilimsel
PMASigmaP 8139100 nM son kullanılan
ELISA PlateGreiner bio-one655061
Konik tüpler 15 mlThermoscientific339650
Konik tüpler 50 mlThermoscientific339652
Percoll (pH 8.5-9.5) SigmaP 1644Sodyum Klorür, Sigma, S7653-250G
DekstranSpektrumuD1004
RPMI 1640 medyaCorning Cellgro17-105-CV
96 kuyu tahlil plakası siyah plaka açık altCostar3603

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
  2. Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176, 231-241 (2007).
  3. Kessenbrock, K., et al. Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis. Nat Med. 15, 623-625 (2009).
  4. Leffler, J., et al. Degradation of neutrophil extracellular traps co-varies with disease activity in patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis Res Ther. 15, R34(2013).
  5. Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B. NET formation induced by Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates measured as release of myeloperoxidase-DNA and neutrophil elastase-DNA complexes. Immunol Lett. 160, 186-194 (2014).
  6. Wang, Y., et al. Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation. J Cell Biol. 184, 205-213 (2009).
  7. Pang, L., Hayes, C. P., Buac, K., Yoo, D. G., Rada, B. Pseudogout-associated inflammatory calcium pyrophosphate dihydrate microcrystals induce formation of neutrophil extracellular traps. J Immunol. 190, 6488-6500 (2013).
  8. Yoo, D. G., et al. Release of cystic fibrosis airway inflammatory markers from Pseudomonas aeruginosa-stimulated human neutrophils involves NADPH oxidase-dependent extracellular DNA trap formation. J. Immunol. 192, 4728-4738 (2014).
  9. Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed,, Goosmann, U., Zychlinsky, C., A, Neutrophil extracellular traps, how to generate and visualize them. J. Vis. Exp. , (2010).
  10. Rada, B., et al. Pyocyanin-enhanced neutrophil extracellular trap formation requires the NADPH oxidase. PLoS One. 8, e54205(2013).
  11. Neumann, A., et al. The antimicrobial peptide LL-37 facilitates the formation of neutrophil extracellular traps. Biochem J. 464, 3-11 (2014).
  12. Leon, S. A., Shapiro, B., Sklaroff, D. M., Yaros, M. J. Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy. Cancer Res. 37, 646-650 (1977).
  13. Raptis, L., Menard, H. A. Quantitation and characterization of plasma DNA in normals and patients with systemic lupus erythematosus. J Clin Invest. 66, 1391-1399 (1980).
  14. Chang, C. P., et al. Elevated cell-free serum DNA detected in patients with myocardial infarction. Clin Chim Acta. 327, 95-101 (2003).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

N trofil Ekstrasel ler TuzaklarY ksek Verimli AnalizMPO DNA ELISAHNE DNA ELISASYTOX OrangeN trofil zolasyonuPercoll GradyanMikroplaka Florometresi

İlgili makaleler