İnsan nötrofillerinden NET salınımını ölçmek için mükemmel araçlar sağlayan yüksek verimli testler sunulmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Ekstraselüler DNA Yayın Yüksek Verimli Ölçme ve İnsan Nötrofiller Kantitatif NET Oluşumu
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Nötrofil granülositler, insan kanında en bol bulunan lökositlerdir. Nötrofiller, enfeksiyon bölgesine ilk gelenlerdir. Nötrofiller, fagositoz, degranülasyon ve nötrofil hücre dışı tuzakların (NET'ler) oluşumu dahil olmak üzere çeşitli antimikrobiyal mekanizmalar geliştirdi. NET'ler, histonlarla süslenmiş bir DNA iskelesi ve miyeloperoksidaz (MPO) ve insan nötrofil elastazı (HNE) dahil olmak üzere çeşitli granül belirteçlerinden oluşur. NET salınımı, nötrofillerin karakteristik morfolojik değişikliklerini içeren ve DNA'larının hücre dışı boşluğa atılmasına yol açan aktif bir süreçtir. NET'ler mikroplarla savaşmak için gereklidir, ancak NET'lerin kontrolsüz salınımı çeşitli bozukluklarla ilişkilendirilmiştir. Klinik alaka düzeyi ve NET oluşum mekanizması hakkında daha fazla bilgi edinmek için, NET kantitasyonu yapabilen güvenilir araçlara ihtiyaç vardır.
Burada, insan nötrofillerinden NET salınımını in vitro olarak değerlendirebilecek üç yöntem sunulmaktadır. Birincisi, zar geçirimsiz bir DNA bağlayıcı boya kullanarak insan nötrofillerinden hücre dışı DNA salınımını ölçmek için yüksek verimli bir testtir. Ek olarak, NET'e özgü MPO-DNA ve HNE-DNA komplekslerinin seviyelerini ölçerek NET oluşumunu ölçebilen iki başka yöntem daha tanımlanmıştır. Bu mikroplaka bazlı yöntemler kombinasyon halinde, insan nötrofillerinin NET oluşumunun mekanizmasını ve düzenlenmesini verimli bir şekilde incelemek için harika araçlar sağlar.
Giriş
NET oluşumu, nötrofillerin patojenlerle savaştığı yeni bir mekanizmadır. 1 NET'lerin çekirdeği nükleer DNA'dır. 1 Bu DNA ağı, nötrofil granül proteinleri ve histonlarla ilişkilidir. 1 NET oluşumunun ana formu, kromatin deyoğunlaşması, granüler ve nükleer zarların kaybolması, nötrofil elastazın çekirdeğe translokasyonu, histonların sitrülinasyonu ve son olarak DNA bazlı NET'lerin dökülmesi ile karakterize edilen nötrofillerin ölümünü gerektirir. 2 NET'ler çok çeşitli mikropları yakalar ve öldürür ve doğuştan gelen bağışıklık silahı repertuarının önemli bir parçasıdır. Bununla birlikte, kontrolsüz NET oluşumu çok sayıda otoinf....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Georgia Üniversitesi Kurumsal Değerlendirme Kurulu sağlıklı gönüllülere (UGA # 2012-10769-06) periferik kan toplamak için insan konu çalışmayı onayladı. 5,7,8 Gönüllüler kan beraberlik önce gerekli bilgilendirilmiş onam formunu imzaladı. Bu makalede yapılan araştırmalar Helsinki Bildirgesi'nin insan denekler üzerinde tıbbi araştırmalar için etik kurallarına uygun olduğunu.
Periferik İnsan Kanı adlı Nötrofiller 1. izolasyonu (Şekil 1)
Not: Periferik kan nötrofillerin izole edilmesi için çeşitli yollar vardır. Aşağıdaki protokol, bir imkanı sağlar. Bu protokol, dış uyarım üzerine NET'leri salabilen aktif olmayan, insan nötrofil sayıda v....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu yazıda rakamlar. Nötrofil izolasyon, deneysel prosedürler ve veri analizi açıklama ile mevcut temsilcisi sonuçları yöntemi tarif 1 insan nötrofil hazırlık ardışık adımları göstermektedir. Bu protokol nötrofil izolasyon tek olası yolu temsil eder. Bu stimülasyon üzerine NET'leri salabilen nötrofillerin istirahat büyük miktarda verir. Floresan bazlı DNA salınım testi nasıl çalıştığını 2 gösterileri Şekil. İnsan nötr.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
NET'ler NET'ler edebiyat sürekli, biyoloji, mekanizma ve yönetmelik rollerine ilişkin birkaç önemli soru belirsizliğini koruyor onların keşfinden bu yana geçen on yıllar içinde genişleyen olmasına rağmen patojenleri öldürmek. 1 nötrofil hangi büyüleyici yeni bir mekanizma temsil etmektedir. Uygun metodoloji NET'leri, bu çok benzersiz antimikrobiyal mekanizma ölçmek için geliştirilmiş olmalıdır. Bu makalede, bir yüksek verimli bir şekilde netler ölçmek için kullanılan yöntemler açıklanmaktadır. İlk.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Teşekkürler
İnsan nötrofillerini izole etme konusundaki çalışmalarımıza sürekli destek verdikleri için Georgia Üniversitesi Sağlık Merkezi laboratuvar personeline özel teşekkürler. Bu çalışma, UGA Araştırmadan Sorumlu Başkan Yardımcılığı Ofisi tarafından sağlanan Dr. Rada'nın başlangıç fonu tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Anti-İnsan Nötrofil Elastaz Tavşan Ab | Calbiochem | 481001 | 1:2.000x kaplamalı |
| Anti-Miyeloperoksidaz Ab (Tavşan) | Millipore | 07-496 | 1:2.000x kaplamalı |
| DNaz-1 | Roche | 10-104-159-001 | 1 &# 181; Sindirim için kullanılan g/ml |
| 20 mM EGTA/ PBS | Sigma-Aldrich | E3889-25G | |
| 2.5 mM EGTA/PBS | Sigma-Aldrich | E3889-25G | |
| Hücre ölümü tespiti ELISA Anti-DNA POD | Roche | 11544675001 | 1:500x |
| Eon Mikroplaka Spektrofotometresi | Biotek | ||
| Gen5 Hepsi Bir Arada mikroplaka yazılımı | Biotek | analitik aracı (ELISA) | |
| Sytox turuncu | Yaşam Teknolojisi | S11368 | %0,2 nihai konsantrasyon/hacim |
| 1 M Hepes | Cellgro | 25-060-Cl | 10 mM nihai konsantrasyon kullanın. |
| 1 M glikoz | Sigma | 5 mM nihai konsantrasyon kullanın. | |
| HBSS | Corning | 21-023-CM | |
| Varioskan Flash Ver.2.4.3 | Termobilimsel | ||
| PMA | Sigma | P 8139 | 100 nM son kullanılan |
| ELISA Plate | Greiner bio-one | 655061 | |
| Konik tüpler 15 ml | Thermoscientific | 339650 | |
| Konik tüpler 50 ml | Thermoscientific | 339652 | |
| Percoll (pH 8.5-9.5) | Sigma | P 1644 | Sodyum Klorür, Sigma, S7653-250G |
| Dekstran | Spektrumu | D1004 | |
| RPMI 1640 medya | Corning Cellgro | 17-105-CV | |
| 96 kuyu tahlil plakası siyah plaka açık alt | Costar | 3603 |
Kaynaklar
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176, 231-241 (2007).
- Kessenbrock, K., et al.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
