Here, we describe a semi-invasive optical microscopy approach for the induction of a Rose Bengal photothrombotic clot in the somatosensory cortex of a mouse in vivo. The technical aspects of the imaging procedure are described from induction of a photothrombotic event to application and data collection.
In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to image cellular events in an intact animal. Additionally, the ability to induce physiological disease states such as stroke in vivo increases its utility. The technique described herein allows for physiological assessment of cellular responses within the CNS following a stroke and can be adapted for other pathological conditions being studied. The technique presented uses laser excitation of the photosensitive dye Rose Bengal in vivo to induce a focal ischemic event in a single blood vessel.
The video protocol demonstrates the preparation of a thin-skulled cranial window over the somatosensory cortex in a mouse for the induction of a Rose Bengal photothrombotic event keeping injury to the underlying dura matter and brain at a minimum. Surgical preparation is initially performed under a dissecting microscope with a custom-made surgical/imaging platform, which is then transferred to a confocal microscope equipped with an inverted objective adaptor. Representative images acquired utilizing this protocol are presented as well as time-lapse sequences of stroke induction. This technique is powerful in that the same area can be imaged repeatedly on subsequent days facilitating longitudinal in vivo studies of pathological processes following stroke.
Hemen Gül Bengal indüksiyon aşağıdaki vivo hücresel yanıtları tekniği tarif izin görselleştirme sağlam bir fare Fototromboz. Rose Bengal (4,5,6,7-tetrakloro-2 ', 4', 5 ', 7'-tetraiodofluorescein) hayvan modellerinde, iskemik inme (fare ve sıçan) ikna etmek için kullanılan ışığa boyadır. Bir 564 nm lazer ışığı ile inceltilmiş kafatası yoluyla kuyruk damarından ve daha sonra aydınlatma aracılığıyla RB bir bolus enjeksiyonunu takiben, trombüs fizyolojik inme 1 neden indüklenir. yöntem aslen 1977 yılında Rosenblum ve El-Sabban'ın tarafından tarif edilmiştir ve daha sonra orta 1980'ler 1,2 Watson tarafından uyarlanmıştır. Kısaca, Rose Bengal, daha sonra, doku faktörü, pıhtılaşma kaskadının bir başlatıcı aktive reaktif oksijen türlerinin üretimi üretir yeşil uyarma ışık (bizim örneğimizde 561 nm lazer) ile ışınlanır. koagülasyon kaskad indüksiyon les iskemik üretirKlinik inme 3 patolojik alakalı iyon.
İnme nöronlar, glia, endotel ve bağışıklık sistemi de dahil olmak üzere birçok farklı hücre tiplerinin etkileşimi nedeniyle karmaşık bir patofizyolojisi vardır. En iyi tekniği seçimi, belirli bir hücresel süreç birden hususlar gerektirir incelemek. Deneysel teknikler üç kategoriden birine genel olarak düşmek: in vitro, her biri avantaj ve dezavantajları ile in vivo ve siliko in vitro çalışmalar, doğal ortamdan hücrelerin çıkarılması birincil dezavantajı vardır ve bu nedenle sağlam bir görülen etkileri yeniden olmayabilir. hayvan yaşam. in vivo teknikler artmış öteleme öneme sahip hastalık durumlarının geliştirilmiş deneysel çoğaltma sağlamak. silico olarak genellikle bir hastalık veya hücresel sürecin bilgisayar modelleme anlamına gelir ve giderek sınava potansiyel ilaç etkileşimleri incelemek için kullanılan süreple, toplanan herhangi bir bilgi hala hücreleri veya canlı doku test edilmelidir.
laboratuar ortamında inme ideal bir model insan popülasyonunda görülen benzer patolojik özellikleri göstermelidir. Insan nüfusunun inme ortak fizyolojik özellikleri varken, deneyimli yaralanma türüne bağlı olarak pek çok farklılıklar vardır. Insan nüfusunun İnme çeşitli enfarktüs hacimleri yanı sıra her patoloji ile ilgili mekanizmalar farklılıklara neden olarak küçük veya büyük damar oklüzyonlarını, hemorajik lezyonlar ve arter veya kardiyo-embolisine arter-oluşur. Hayvan inme modelleri kullanan avantajı, insan inme özelliklerini taklit eden tekrarlanabilir infarktlar üretilmesidir. orta serebral arter tıkanıklığı (emboli veya endovasküler filament yöntemleri) hangi modeller uzak MCAO ve fototromboz modeli: En yaygın hayvan inme modelleri kullanarak arter tıkanıklığı sayılabilir. Avantajları BirHer modelin d dezavantajları (4 ve 5) başka bir yerde gözden geçirilmiştir. Küresel iskemik modelleri (MCAO), gerçekleştirmek için nispeten kolay odak inme modelleri daha insan inme daha az alakalı iken. Buna ek olarak, bu yöntemler, yeniden üretilebilir, beyin enfarktüsü lezyonlara neden olan oldukça değişkendir. deneyci MCAO modeller üzerinde açık bir avantaj sağlayarak, onların deneylerini kontrol olarak fototromboz modeli uzun gibi son derece tekrarlanabilir. Bununla birlikte, mikrovasküler hasara modeli asgari penumbra, hücre 6,7 kurtarılabilen olduğu düşünülmektedir alan görüntülemek için tarif edilmiştir. Buna ek olarak, vazojenik ödem ve sitotoksik ödem oluşumu, aynı zamanda görüntüleme alanında aşağıdaki ışınlama indüklenebilir. Bu kısıtlamalara rağmen tekniği inme 8, 9, 10, 11 aşağıdaki birçok fizyolojik süreçlere yeni bir bakış açısı sağlamıştır.
İnsan uygulamaya hayvandan deneysel inme patofizyoloji çevirmek için yetenek yetersizliği ile rahatsız olmuştur. Ancak, bu tür fototromboz modeli olarak hayvan modellerinde, kullanımı gelişmiş inme patofizyolojisi anlayış ve inme sonrası nöro sağlamak için yeni tedavi yaklaşımları keşif için izin verir. Küçük kortikal vuruş ve Fototrombotik modeli tarafından üretilen microinfarctions yüksek oranda görüldüğü ve Amerika Birleşik Devletleri nüfusunun (yaklaşık 11 milyon kişi) her yıl…
The authors have nothing to disclose.
Funding for this work was provided by: AG007218 and NIH F32 AG031606.
Images were generated in the Core Optical Imaging Facility, which is supported by UTHSCSA, NIH-NCI P30 CA54174 (CTRC at UTHSCSA) and NIH-NIA P01AG19316.
Reagents | |||
Rose Bengal | Sigma | 330000 | |
Isoflurane Anesthetic | MWI Veterinary Supply | 088-076 | |
Vetbond | 1469SB | 1469SB | |
aCSF | 126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM glucose and 26 mM NaHCO3 (pH 7.4). | ||
[header] | |||
Equipment | |||
Dissecting Scissors | Bioindustrial Products | 500-410 | |
Operating scissors 14 cm | Bioindustrial Products | 12-055 | |
Forceps Dumont High Tech #5 style, straight | Bioindustrial Products | TWZ-301.22 | |
LabJack 132X80 | Optosigma Co | 123-6670 | |
Platform for Labjack 8X 8 | Optosigma Co | 145-1110 | |
Ear bar holder from stereotaxic setup | Stoelting/Cyborg | 51654 | |
Dispomed Labvent Rodent anesthesia machine | DRE, Inc. | 15001 | |
Tech IV Isoflurane vaporizer | DRE, Inc. | 34001 | |
F Air Canister | DRE, Inc | 80120 | |
Bain circuit breathing tube | DRE, Inc | 86111B | |
Rodent adapter for bain tube | DRE, Inc | 891000 | |
O2 regulator for oxygen tanks | DRE, Inc | CE001E | |
Rodent induction chamber | DRE, Inc | 15004C | |
Ethicon Silk 6-0; 18 in with P-3 needle | Suture Express | 1639G | |
Objective inverter Optical Adapter | LSM technologies | ||
Foredom drill Dual voltage 110/120 | Foredom | 134.53 |