Method Article

Yüksek Çözünürlük kullanma Beyin bölümlerde Axonally Lokalize mRNA'larının Algılama In Situ Melezleme

DOI:

10.3791/52799

⸱

June 17th, 2015

 ,  ,  , 
1College of Physicians and Surgeons, Columbia University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNA in situ hibridizasyon (ISH), hücre ve dokulardaki RNA'ların görselleştirilmesini sağlar. Burada, RNAscope ISH'nin immünohistokimya veya histolojik boyalarla kombinasyonunun, fare ve insan beyninin bölümlerinde aksonlara lokalize mRNA'ları tespit etmek için nasıl başarılı bir şekilde kullanılabileceğini gösteriyoruz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

mRNA'ları sıkça omurgalı akson lokalize ve yerel çeviri akson yol bulma veya geliştirme sırasında ve postdevelopmental dönemlerde bakım, onarım veya nörodejenerasyonun için dallanma için gereklidir. Yüksek verim analizleri son zamanlarda aksonlar önce beklenenden daha dinamik ve karmaşık transcriptome sahip olduğunu ortaya koymuştur. Bu analiz, bununla birlikte daha çok aksonlar somato-dendritik bölmeleri izole edilebilir kültürlenmiş nöronlar yapılmıştır. Bu, in vivo olarak, tüm dokularda bu tür izolasyon elde etmek hemen hemen imkansızdır. Bu durumda, bir bütün hayvan mRNA ve bunların fonksiyonel alaka işe doğrulamak amacıyla, transcriptome analizleri ideal yerinde mRNA görülmesini sağlayacak teknikleri ile kombine edilmelidir. Son zamanlarda, bir tek-molekül düzeyinde RNA'lar tespit roman ISH teknolojileri geliştirilmiştir. MRNA'nın hücre içi lokalizasyonu analiz edilirken bu özellikle önemlidirBeri lokalize RNA'lar genellikle düşük seviyelerde bulunur. Burada yeni bir derece hassas bir RNA ISH teknolojisini kullanarak axonally-lokalize mRNA'ların tespiti için iki protokol açıklar. Biz olgun fare ve insan beyinlerinde in vivo akson için Atf4 mRNA işe doğrulamak için floresan immunhistokimya veya histolojik boyalar kullanarak aksonal counterstain ile RNAscope ISH birleştirdik.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aksonal mRNA istihdam ve yerel çeviri bir zamansal ve mekansal akut bir şekilde 1 ekstrasellüler uyaranlara yanıt vermek için aksonları etkinleştirin. Intra-aksonal protein sentezi en iyi akson 9-11 pathfinding ve retrograd 12,13 sinyalizasyon, büyüme konisi davranış 2-8 yılında çok önemli roller oynamaktadır nörogelişimsel bağlamında anlaşılmaktadır. Aksonal mRNA ve ribozom seviyeleri büyük ölçüde 14,15 azalır Ama çok daha az post-gelişimsel nöronlar akson protein sentezi fonksiyonel önemi hakkında bilinmektedir. Olgun omurgalı aksonlar uzunluğunda 16 translationally inaktif olduğu düşünülmektedir. Ancak son çalışmalar, y....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bütün hayvan prosedürleri Columbia Üniversitesi IACUC ve bakım ve laboratuvar hayvanlarının kullanımı için geçerli kurallar tarafından kabul edildi izledi. Not: RNaz içermeyen veya DEPC ile muamele edilmiş su içinde ISH işlemleri için kullanılan tüm tamponları hazırlayın. ISH tamamlanmıştır fakat tampon de otoklavlanmış çifte damıtılmış su içinde hazırlanır ve / veya filtreleme ile sterilize edilir önerilmektedir sonra bu öneri kesinlikle gerekli değildir.

1. İmmünohistokimya Ardından Situ Hibridizasyon Yetişkin Fare Beyin kullanarak Floresan in Kolinerjik Aksonlar için Atf4 mRNA Yerleşen (FISH) tespiti

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Results

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Yukarıda tarif edilen prosedürlere kısa bir özeti Şekil 1 'de gösterilmiştir.

    Atf4 mRNA optimal deteksiyon ısıya bağlı maskesinin kaldırıldı kullanılarak kolinerjik aksonlarda granülleri

    MRNA aksonal lokalizasyonu değerlendirirken, bu aksonlar tespit edebilmek ve düşük bol RNA'lar görselleştirmek mümkün önemlidir. Burada tarif edilen RNA, ISH teknolojisi, tek moleküllü çözünürlükte RNA'lar belirlenmesini sağlar. Bu teknolojiyi kullanarak.......

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Discussion

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Bu yazıda axonally lokalize Atf4 mRNA'nın tespiti yüksek çözünürlüklü ISH teknolojisinin kullanımını tarif eder. Bu ve daha önce yayınlanmış çalışmalar, bu teknoloji dokular ya da hatta tüm embriyolar 33 antikor bazlı protein tespiti ile uyumlu olduğunu gösterir. Önemli olarak, bu son hipokampal nöronlar 34 dendritleri olan ark mRNA'nın tespiti için kullanılmıştır. Aynı zamanda, dokuya boyama için histolojik boyalar ile kombine edilebilir. Son olarak, birden fazla hedef RN.......

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Disclosures

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

    Acknowledgements

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Bu çalışma Alzheimer Derneği (NIRG-10-171721; U.H.), Ulusal Ruh Sağlığı Enstitüsü (MH096702; U.H.), Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme Enstitüsü (NS081333; C.M.T.'ye) ve Columbia Üniversitesi'ndeki Ulusal Yaşlanma Enstitüsü tarafından finanse edilen Alzheimer Hastalığı Araştırma Merkezi'nden (AG008702; J.B. ve YYJ'ye) New York Beyin Bankası'nı da destekleyen pilot çalışma ödülleri tarafından desteklenmiştir. Hengst laboratuvarı üyelerine yorum ve tartışmaları için teşekkür ederiz

    ....

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Materials

    List of materials used in this article
    NameCompanyCatalog NumberComments
    farenin 20-1,381 kalıntısı Atf4 mRNA (NM_009716)Advanced CellDiagnostics-probe
    insan ATF4 mRNA'nın 15-1,256 kalıntısı (NM_001675.2)Gelişmiş Hücre Teşhisi-prob
    negatif kontrol probu-DapBGelişmiş Hücre Teşhisi310043probu
    pozitif kontrol probu-fare Polr2A (isteğe bağlı)Gelişmiş Hücre Teşhisi312471probu
    pozitif kontrol probu-insan PPIB (isteğe bağlı)Gelişmiş Hücre Teşhisi313901probu
    RNAscope Floresan Multipleks Reaktif Kiti (floresan tespiti için)Advanced Cell Diagnostics320850in situ hibridizasyon kiti
    RNAscope 2.0 HD Reaktif Kiti - KAHVERENGİ (kromojenik tespit için)Gelişmiş Hücre Teşhisi310035in situ hibridizasyon kiti
    Keçi poliklonal anti-ChAT antikoruMilliporeAB144P
    Luxol Hızlı Mavi-Cresyl Echt Menekşe Leke KitiAmerican MasterTechKTLFB
    Clearify temizleme maddesi (ksilen ikamesi)American MasterTechCACLEGAL
    ProLong Gold montaj  DAPILife TechnologiesP36935
    DPX montaj ortamı Sigma6522
    ile orta

    References

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Jung, H., Yoon, B. C., Holt, C. E. Axonal mRNA localization and local protein synthesis in nervous system assembly, maintenance and repair. Nat. Rev. Neurosci. 13, 308-324 (2012).
    2. Campbell, D. S., Holt, C. E. ....

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Reprints and Permissions

    Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

    Request Permission

    Tags

    In Situ HybridizationRNAscope TechnologyAxonal mRNA DetectionBrain Section AnalysisFluorescence ImmunohistochemistryAntigen UnmaskingProbe HybridizationSignal AmplificationCholine Acetyltransferase StainingLuxol Fast Blue Counterstain

    Related Articles