Yöntem makalesi

Yüksek Çözünürlük kullanma Beyin bölümlerde Axonally Lokalize mRNA'larının Algılama In Situ Melezleme

DOI:

10.3791/52799

⸱

17 Haziran 2015

 ,  ,  , 
1College of Physicians and Surgeons, Columbia University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNA in situ hibridizasyon (ISH), hücre ve dokulardaki RNA'ların görselleştirilmesini sağlar. Burada, RNAscope ISH'nin immünohistokimya veya histolojik boyalarla kombinasyonunun, fare ve insan beyninin bölümlerinde aksonlara lokalize mRNA'ları tespit etmek için nasıl başarılı bir şekilde kullanılabileceğini gösteriyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

mRNA'ları sıkça omurgalı akson lokalize ve yerel çeviri akson yol bulma veya geliştirme sırasında ve postdevelopmental dönemlerde bakım, onarım veya nörodejenerasyonun için dallanma için gereklidir. Yüksek verim analizleri son zamanlarda aksonlar önce beklenenden daha dinamik ve karmaşık transcriptome sahip olduğunu ortaya koymuştur. Bu analiz, bununla birlikte daha çok aksonlar somato-dendritik bölmeleri izole edilebilir kültürlenmiş nöronlar yapılmıştır. Bu, in vivo olarak, tüm dokularda bu tür izolasyon elde etmek hemen hemen imkansızdır. Bu durumda, bir bütün hayvan mRNA ve bunların fonksiyonel alaka işe doğrulamak amacıyla, transcriptome analizleri ideal yerinde mRNA görülmesini sağlayacak teknikleri ile kombine edilmelidir. Son zamanlarda, bir tek-molekül düzeyinde RNA'lar tespit roman ISH teknolojileri geliştirilmiştir. MRNA'nın hücre içi lokalizasyonu analiz edilirken bu özellikle önemlidirBeri lokalize RNA'lar genellikle düşük seviyelerde bulunur. Burada yeni bir derece hassas bir RNA ISH teknolojisini kullanarak axonally-lokalize mRNA'ların tespiti için iki protokol açıklar. Biz olgun fare ve insan beyinlerinde in vivo akson için Atf4 mRNA işe doğrulamak için floresan immunhistokimya veya histolojik boyalar kullanarak aksonal counterstain ile RNAscope ISH birleştirdik.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aksonal mRNA istihdam ve yerel çeviri bir zamansal ve mekansal akut bir şekilde 1 ekstrasellüler uyaranlara yanıt vermek için aksonları etkinleştirin. Intra-aksonal protein sentezi en iyi akson 9-11 pathfinding ve retrograd 12,13 sinyalizasyon, büyüme konisi davranış 2-8 yılında çok önemli roller oynamaktadır nörogelişimsel bağlamında anlaşılmaktadır. Aksonal mRNA ve ribozom seviyeleri büyük ölçüde 14,15 azalır Ama çok daha az post-gelişimsel nöronlar akson protein sentezi fonksiyonel önemi hakkında bilinmektedir. Olgun omurgalı aksonlar uzunluğunda 16 translationally inaktif olduğu düşünülmektedir. Ancak son çalışmalar, yerel çeviri patolojik koşullarda olgun aksonların içinde yeniden olduğunu göstermektedir. Örneğin, mRNA bir alt sinir yaralanması ve intra-aksonal protein sentezi, bu aksonlar 17 doğru rejenerasyonu için gerekli olan aşağıdaki yenileyici aksonlar için işe. Ayrıca, bizim grup haS, Alzheimer hastalığı peptid Aβ 1-42 ve transkripsiyon faktör ATF4 lokal çeviri yerel nöronal soma 18 aksonlardan Aβ 1-42 nörodejeneratif etkileri yaymak için gereklidir sonra spesifik mRNA'lar aksonlar için işe olduğunu göstermiştir. Son olarak, yüksek verimlilik analizleri olgun aksonlar özellikle patolojik koşullarda, 18-21 beklenenden daha karmaşık ve dinamik bir transcriptome sahip olduğunu ortaya koymuştur. Bu çalışmalar ışığında, son derece hassas ve özel yöntem, yetişkin sinir sisteminde lokalize axonally mRNA'lar tabi tespit etmek.

MRNA işe ve olgun akson yerel çeviriye çalışmaların çoğu kültürlü nöronlar üzerinde yapılmıştır. Özel kültür yöntemleri somato-dendritik bölmesi 18-20 den akson izolasyonu izin vermesini var çünkü transcriptome analizleri için bu özellikle doğrudur. Bu tür çalışmalar, değerli ins verilmiş olmasına rağmenolgun akson yerel çeviri rolüne ight, soru kültürlü nöronlar sadakatle vivo durumu temsil veya mRNA işe kültürleme koşullara aksonların bir uyum cevabı ise hala açık olup olmadığını. Az sayıda çalışma in vivo aksonlar olgun mRNA işe kanıtlar sağlamıştır. Örneğin, koku markör proteini kodlayan transkript yetişkin duyu nöronları 22 akson tespit edildi. Β-aktin mRNA 'nın 3' UTR içeren bir transgen farelerinde periferal ve merkezi sinir sistemi nöronlarının akson taşınır ve yerel olarak gelişim dönemlerde 23 sonra çevrilmiştir. Xenopues Kurbağa yavrularını laevis de Lamin b2 mRNA retina aksonlar lokalize ve tükenme aksonal gelişimi 21 sonra akson bakım etkiler. Sitokrom C oksidaz IV mRNA kodlama aksonal taşıma Müdahale fare davranışını 24 değiştirir. Son olarak, Atf4 mRNA yetişkin a bulunanAβ 1-42 bağlamında fare ve insan beyin Xons nörodejenerasyonu 18 indüklenen.

Yüksek üretim transcriptome analizleri, in vitro olarak izole akson mRNA profillerini belirlemek ancak aksonlar izolasyon bulunabilir, ancak nöronal hücre gövdeleri, gliyal hücreleri ve diğer hücre tipleri ile iç içe hiçbir zaman bütün dokularda yana in vivo çalışmalar için sınırlamalar olması yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Bu durumda, bu analizler, mRNA bir hücre içi lokalizasyonu teyit görüntüleme teknikleri ile kombine edilmelidir. In situ hibridizasyon (ISH RNA) RNA hücre ve dokularda spesifik RNA dizilerinin algılama ve görselleştirme sağlar. Ancak, orijinal RNA, ISH testlerinin nadiren axonally lokalize mRNA için durum oldukça zengin RNA'ların 25 tanımlanması için uygun idi. Çabaları artan son yıllarda için tek-molekül düzeyinde mRNA algılanmasına izin gelişen yeni teknolojiler konulmuştur 25,26. Örneğin, Singer ve arkadaşları içinde oluşan tek hücrelerde mRNA algılamak için ISH sondalar geliştirdik 5 örtüşmeyen floresan (ayrıntılar 27'ye bakınız için) 50-mers etiketli. Yukarıda belirtilen teknikler ve burada açıklanan bir arasındaki temel fark, daha sonra 20 çift Z-yapı (lineer değil), tipik olarak, faiz sağlanması özgüllük ve düşük arka plan seviyelerinin RNA ~ 1 kb bölgesini hedef sondalar kullanmasıdır. Sondalar daha sonra son olarak, flüoresan olarak etiketlenir veya kromojenik tepkileri izin enzimler ile konjuge edilmiş ön yükselteç ve amplifikatör sekansları ile hibridize edilir. Bu amplifikasyon adımları diğer ISH teknolojileri 28 ile karşılaştırıldığında sinyali-gürültü oranını iyileştirir. Burada floresans immunositokimya ile veya aksonal counterstaining sağlayan histolojik boyalarla, ya Birleştirilen RNAscope kullanılarak iki protokol açıklar. Her iki protokol erişkin mo Atf4 mRNA aksonal lokalizasyonu görselleştirmek için uygundurkullanımı ve insan beyni.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bütün hayvan prosedürleri Columbia Üniversitesi IACUC ve bakım ve laboratuvar hayvanlarının kullanımı için geçerli kurallar tarafından kabul edildi izledi. Not: RNaz içermeyen veya DEPC ile muamele edilmiş su içinde ISH işlemleri için kullanılan tüm tamponları hazırlayın. ISH tamamlanmıştır fakat tampon de otoklavlanmış çifte damıtılmış su içinde hazırlanır ve / veya filtreleme ile sterilize edilir önerilmektedir sonra bu öneri kesinlikle gerekli değildir.

1. İmmünohistokimya Ardından Situ Hibridizasyon Yetişkin Fare Beyin kullanarak Floresan in Kolinerjik Aksonlar için Atf4 mRNA Yerleşen (FISH) tespiti

  1. Paraformaldehid sabit dondurulmuş beyin dilimleri için örnek hazırlama
    1. Aşağıdaki Örneğin, sabit bir dondurulmuş bir fare beyinlerinden dilimleri hazırlamak.
      1. Kısaca, ketamin anestezi 9 aylık fareler kurban (100 mg kg -1 vücut ağırlığı) ve xylazine (10 mg kg -1 vücut weigHT), PBS içinde% 4 paraformaldehit transcardial infüzyonu (pH 7.4) eklenmiştir.
      2. 4 o C'de 24 saat süreyle% 4 paraformaldehid beyin ve post-fix kaldır
      3. Tespit edildikten sonra, 4 O ° C'de 24 saat süre ile, PBS (pH 7.4) içinde numuneleri% 30 sukroz içinde üç PBS içinde süreleri ve cryoprotect yıkama
      4. Ekim göm beyinler bir kriyostat üzerinde, 20 mikron seri bölümünde, bileşik donma ve poli-D-lizin tedavi mikroskop lamı üzerine monte edin. -20 O C'de kullanıma kadar beyin dilimleri tutun.
    2. Oda sıcaklığında 30 dakika süre ile dondurucu ve kuru hava ile ilgili paraformaldehid ile tespit edilmiş olan beyin dilimleri çıkarın.
    3. 1x PBS ile üç kez yıkanır.
    4. Bir çeker ocak içinde, yeniden düzeltme beyin oda sıcaklığında% 4 paraformaldehid ile 20 dakika keser.
      NOT: DİKKAT: 4% paraformaldehit toksiktir ve uygun güvenlik protokolleri takip ederek ve atılmalıdır.
    5. 1x PBS ile üç kez yıkanır.
    6. Beyin dilimleri dehydrate.
      1. % 50,% 75 ve% 100 Hazırlamaetanol çözümleri.
      2. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca% 50 etanol içinde slaytlar bırakın.
      3. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca% 75 etanol içinde slaytlar bırakın.
      4. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca,% 100 etanol içinde slaytlar bırakın.
      5. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca, taze,% 100 etanol içinde slaytlar bırakın. Not: Alternatif olarak, slaytlar 1 aya kadar C o -20% 100 etanol içinde saklanabilir.
  2. FISH tahlil ısı kaynaklı antijen / RNA maskesinin kaldırıldı ile immunohistokimyasal izledi
    1. Başlamadan önce gerekli tüm malzemeyi hazırlayın:
      1. 40 o C hibridizasyon fırın ısıtın ve nemlendirilmiş bir ortam yaratmak için fırında damıtılmış su ihtiva eden bir tepsiye yerleştirin.
      2. Bir slayt kutusu alın ve içine slayt kutusu nemlendirmek için distile suda ıslatılmış kağıt havlu yerleştirin. Hibridizasyon fırında slayt kutusu yerleştirin.
      3. Buzdolabı probları (negatif ve hedef problar her ikisi de) çıkarın ve 10 dakika için hibridizasyon fırında ısıtın. Sondalar dow soğumaya bırakınoda sıcaklığında n.
      4. Oda sıcaklığında (Floresan Multiplex Reaktif Kiti dahil) büyütme reaktifleri AMP 1-4 dengelenmesi.
      5. Antijen alma çözeltisi hazırlayın: 10 mM sodyum sitrat (pH 6),% 0.05 Tween 20 Not: Çözelti süresiz oda sıcaklığında saklanabilir ve gelecekteki boyanması için de kullanılabilir.
      6. RNaz ücretsiz veya DEPC arıtılmış su içinde (Floresan Multiplex Reaktif Kiti dahil) 50x stok solüsyonu seyreltilmesi 1x yıkama tamponu hazırlayın.
        Not: 1 x yıkama tamponu 1 ay boyunca oda sıcaklığında muhafaza edilebilir ve ileride boyanması için de kullanılabilir. 50x yıkama tamponu hızlandırabilir olabilir. Bu durumda, 1 x çözeltisinin hazırlanması önce 10 dakika boyunca 40 C 'de, ısı 50x yıkama tamponu.
    2. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca,% 100 etanol ve kuru hava slaytları çıkarın.
    3. Antijen alma çözeltisi 50 ml ihtiva eden bir coplin kavanoz hazırlayın. Antijen alma çözeltisi içinde slaytlar daldırın ve mikrodalga fırında 10 dakika süreyle kaynatın.
      NOT: Alternatif bir yerde 100 mm yatay slaytlaralma çözeltinin 100 ml içeren çap yuvarlak cam tabak.
      1. Distile su ile 1 L beher doldurun ve mikrodalga yerleştirin.
        NOT: maskesinin kaldırıldı yaparken su ısı "tampon" olacaktır.
      2. Mikrodalga içindeki antijen alma çözeltisi içinde slaytlar yerleştirin. Kaynatın 5 dakika boyunca yüksek güçte kayar. Numuneler kaynar durduruldu hemen sonra, ısı ekstra 5 dakika boyunca yüksek güçte tekrar kayar.
      3. RT'de slaytlar serinleyin.
        NOT: KRİTİK ADIM: kaynar süresi ve prosedür mikrodalga özelliklerine bağlı olarak, kullanıcı tarafından belirlenmelidir. hızlı yüksek derecede kaynama özellikli Çözelti buharlaştırma şansını başlar. Bu durumda, numuneler iki kez 10 dakikalık bir toplam olduğunu ortaya çıkarması zaman tamamlamak için daha kısa zaman periyotları için kaynatılır önerilir. Isıtma, orta ya da düşük güçte gerçekleştirilir Aksine, maskesinin düşürülmesi, 10 dakika boyunca bir kez yapılabilir. Ancak, eğer örnekleri continuousl kaynatın yokYaklaşık 10 dakikalık bir toplam Y bu tespit edilecek olan hedef RNA ve protein hem de kısmi maskesinin düşürülmesi neden olabilir.
    4. Yıkama 1x PBS ile üç kez kayar.
    5. Arka plan boyama değerlendirmek için kullanılan beyin kesitleri ayarlanmış dapB prob 3 damla (~ 100 | il) - 2 ekleyin. Not: dapB prob seti bakteriyel gen hedef ve herhangi memeli RNA tanıması gerekir.
    6. Ilgi RNA tespit etmek için kullanılan beyin dilimleri ayarlanmış hedefleme prob 3 damla - 2 ekleyin. Not: Bir prob seti artıklarını 20 hedef - Atf4 mRNA bu örnekte kullanılan fare 1.381.
    7. Parafilm Kapak slaytlar, prob buharlaşmayı önlemek hibridizasyon fırının içindeki nemlendirilmiş slayt kutusuna koyun ve 2 saat boyunca 40 o C'de onları inkübe.
      Not: İsteğe bağlı: Ek beyin kesitleri fare Polr2A hedef alan bir prob seti ile hibridize ve pozitif kontrol olarak da kullanılabilir.
    8. Yıkama slides iki kez oda sıcaklığında 2 dakika için 1 x yıkama tamponu ile yıkandı.
    9. 2 Ekle - Her beyin dilim amplifikasyon reaktif AMP 1-FL 3 damla, slayt kutusuna koyun ve hibridizasyon fırında 30 dakika süreyle 40 o C'de inkübe, parafilm slaytlar kapsamaktadır.
    10. Yıkama oda sıcaklığında 2 dakika için 1 x yıkama tamponu ile iki defa açılır.
    11. 2 Ekle - Her beyin dilim amplifikasyon reaktif AMP 2-FL 3 damla, slayt kutusuna koyun ve hibridizasyon fırında 15 dakika süreyle 40 o C'de inkübe, parafilm slaytlar kapsamaktadır.
    12. Yıkama oda sıcaklığında 2 dakika için 1 x yıkama tamponu ile iki defa açılır.
    13. 2 Ekle - Her beyin dilim amplifikasyon reaktif AMP 3-FL 3 damla, slayt kutusuna koyun ve hibridizasyon fırında 30 dakika süreyle 40 o C'de inkübe, parafilm slaytlar kapsamaktadır.
    14. Yıkama oda sıcaklığında 2 dakika için 1 x yıkama tamponu ile iki defa açılır.
    15. 2 Ekle - Her beyin dilim amplifikasyon reaktif AMP 4-FL 3 damla, koyun, parafilm slaytlar kapakSlayt kutusu ve hibridizasyon fırınında 15 dakika boyunca 40 o C'de inkübe edin.
    16. Yıkama 1x PBS ile 2 dakika süre ile 1 x yıkama tamponu oda sıcaklığında iki kez, iki kez kayar.
    17. Ekle 100 - slaytlara 3 mg / ml BSA, 100 mM glisin ve% 0.25 Triton X-100, PBS içinde (pH 7.4) içeren bir bloklama solüsyonu (tam dilimleri kapak ya da yeterli hacim) 200 ul, parafilm ile kapak ve Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir.
    18. , Slaytlara çözeltisi (1/100) engelleme seyreltilmiş bir anti-ChAT antikorun 200 ul parafilm ile kapak ve 4 O ° C'de 2 gün süreyle inkübe - 100 ekleme Beyin dilimleri kurumasına yok emin olun. Gerekirse, 24 saat inkübasyon sonrası beyin dilimleri anti-ChAT antikor çözüm yeniden uygulayın.
    19. Yıkama oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1 x PBS içinde üç kez kayar.
    20. Ekle 100 - Uygun Alexa-konjuge sekonder antikor, 200 ul (., Örneğin, bu özel örnekte, Alexa-594 eşek anti-keçi) slaytlara, parafilm ile inkubasyon ile kapakoda sıcaklığında 1 saat için yedi.
    21. Yıkama oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1 x PBS içinde üç kez kayar.
    22. Yıkama damıtılmış su ile bir kez kayar.
    23. Montaj DAPI içeren montaj ortamı ile kayar.
    24. Bir floresan mikroskop altında beyin dilimleri gözünüzde canlandırın.

Luxol Hızlı Mavi ve Cresyl Violet counterstaining Ardından Situ Hibridizasyon (CISH) kromojenik kullanılarak İnsan Beyninin Samples Aksonlar için Atf4 mRNA Yerleşen 2. Algılama

  1. Formalin ile sabitlenmiş, parafin gömülmüş insan beyninin örnekleri için örnek hazırlama
    1. 1 saat 60 o C'de kuru fırında pişirin dilimleri.
    2. Bir çeker ocak içinde Deparaffinize beyin kesitleri.
      NOT: DİKKAT: reaktifler toksik ve ele alınması gerekir ve uygun güvenlik yönergeleri izleyerek atılır
      1. 10 dakika boyunca iki kez ksilen alternatif temizleme ajanı slaytlar bırakın.
      2. 1 dakika boyunca iki kez% 100 etanol içinde slaytlar bırakın.
      3. Birir-kuru dilimler oda sıcaklığında 5 dakika. Not: Alternatif numuneler RT O'da kurutulmuş olabilir / N ancak 24 saat içinde kullanılmalıdır.
  2. Diaminobenzidin (DAB) ısı kaynaklı ve proteaz kaynaklı RNA maskesinin kaldırıldı kullanarak luxol hızlı mavi ve mor leke cresyl ardından kromojenik ISH tahlil tabanlı
    1. Başlamadan önce gerekli malzemeleri hazırlayın:
      1. 40 o C hibridizasyon fırın ısıtın ve nemlendirilmiş bir ortam yaratmak için distile su içeren bir tepsiye yerleştirin.
      2. Bir slayt kutusu alın ve içine slayt kutusu nemlendirmek için distile suda ıslatılmış kağıt havlu yerleştirin. Hibridizasyon fırında slayt kutusu yerleştirin.
      3. RNaz ücretsiz veya DEPC arıtılmış su içinde (CISH Reaktif Kiti dahil) 10x stok solüsyonu seyreltilmesi ile 1x ön muamele 2 hazırlayın. Ön-muamele sıcak bir plaka üzerinde gerçekleştirilirse, ön-muamele, eğer (çanağı ve sıcak plaka arasındaki temas yüzeyini büyütmek için, 100 mm çapında bir cam tabak için bir ön işlem çözeltisinden 100 ml ilave1.2.3 belirtildiği gibi, bir mikrodalga fırın içinde gerçekleştirildiğinde, bir coplin kavanozu) yerine kullanılabilir. 100 o C Isı çözümü ve örnekleri batış önce artık 30 dakika daha kaynayan tutmak.
      4. Isı negatif ve pozitif sondalar 10 40 o C'de dakika ve oda sıcaklığında soğumasını.
      5. Oda sıcaklığında (CISH Reaktif Kiti dahil) büyütme reaktifleri AMP 1-6 dengelenmesi.
      6. Damıtılmış su (CISH Reaktif Kiti dahil) 50x stok solüsyonu seyreltilmesi 1x yıkama tamponu hazırlayın. Not: 1 x yıkama tamponu 1 ay boyunca oda sıcaklığında muhafaza edilebilir ve ileride boyanması için de kullanılabilir.
    2. Her beyin dilim için önceden işleme 1 ~ 4 damla (~ 120 | il) ilave parafilm ile kapatın ve 10 dakika süreyle oda sıcaklığında inkübe edin.
    3. Taze damıtılmış su içinde 3-5 kez yıkayın.
    4. Isı kaynaklı maskesinin kaldırıldı gerçekleştirin:
      1. (CISH Reaktif Kiti dahil) sıcak önceden işleyin 2 Transferi slaytlar 15 dakika çözüm ve kaynatın. Kaynama sağlayan sıcak bir plaka üzerinde yapılabilir Not:Sürekli kaynama ya da 1.2.3 belirtilen kritik adımlar) Aşağıdaki bir mikrodalga.
    5. Hemen distile su slaytlar aktarmak ve 3 ila 5 kez yıkayın.
    6. Yıkama taze% 100 etanol içinde 3 ila 5 kez kayar.
    7. Hava kuru dilimler, oda sıcaklığında 5 dakika. Not: Alternatif dilimler kurutulabilir O / N.
    8. Proteaz kaynaklı maskesinin kaldırıldı uygulayın:
      1. (CISH Reaktif Kiti dahil) önceden işleyin 3 4 damla ekleyin, parafilm ile kaplayın ve hibridizasyon fırında 40 o C'de 30 dakika inkübe.
    9. Yıkama taze damıtılmış su içinde 3 ila 5 kez kayar.
    10. Arka plan boyama değerlendirmek için kullanılan beyin dilimleri ayarlanmış dapB probu 4 damla ekleyin.
    11. Ilgi RNA tespit etmek için kullanılan beyin dilimleri ayarlanmış hedefleme probu 4 damla ekleyin.
      NOT: kalıntılarını 15 hedefleme prob seti - İnsan ATF4 mRNA 1,256 bu örnekte kullanılmıştır. İSTEĞE BAĞLI: Ek beyin dilimleri hyb olabilirİnsan ppiB hedef alan bir prob seti ile ridized ve pozitif kontroller olarak kullanılmıştır.
    12. Slayt kutusuna slaytlar yerleştirin ve 2 saat süre ile inkübe edilir. hibridizasyon fırında 40 o C'de.
    13. Yıkama oda sıcaklığında 2 dakika için 1 x yıkama tamponu ile iki defa açılır.
    14. Her beyin dilime AMP 1 reaktif 4 damla ekleyin, parafilm slaytlar kapak, slayt kutusuna koyun ve hibridizasyon fırında 30 dakika süreyle 40 o C'de inkübe.
    15. Yıkama oda sıcaklığında 2 dakika için 1 x yıkama tamponu ile iki defa açılır.
    16. Her beyin dilime AMP 2 reaktif 4 damla ekleyin, parafilm slaytlar kapak, slayt kutusuna koyun ve hibridizasyon fırında 15 dakika süreyle 40 o C'de inkübe.
    17. Yıkama oda sıcaklığında 2 dakika için 1 x yıkama tamponu ile iki defa açılır.
    18. Her beyin dilime AMP 3 reaktif 4 damla ekleyin, parafilm slaytlar kapak, slayt kutusuna koyun ve hibridizasyon fırında 30 dakika süreyle 40 o C'de inkübe.
    19. 1x oldu ile iki kez yıkayın slaytlaroda sıcaklığında 2 dakika süre ile H tamponu.
    20. Her beyin dilime AMP 4 reaktif 4 damla ekleyin, parafilm slaytlar kapak, slayt kutusuna koyun ve hibridizasyon fırında 15 dakika süreyle 40 o C'de inkübe.
    21. Yıkama oda sıcaklığında 2 dakika için 1 x yıkama tamponu ile iki defa açılır.
    22. Her bir beyin dilime AMP 5 reaktif 4 damla, parafilm ile slaytlar kapağı ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir.
    23. Yıkama oda sıcaklığında 2 dakika için 1 x yıkama tamponu ile iki defa açılır.
    24. Her bir beyin dilime AMP 6 reaktifi 4 damla, parafilm ile slaytlar kapağı ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir.
    25. Yıkama oda sıcaklığında 2 dakika için 1 x yıkama tamponu ile iki defa açılır.
    26. Her beyin dilime ~ çözeltinin 120 ul ekleyin, (CISH Reaktif Kiti dahil) eşit BROWN-1 hacmini ve BROWN-2 reaktif karıştırın parafilm kapağı ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edilir.
    27. Yıkama oda sıcaklığında 2 dakika için 1 x yıkama tamponu ile iki kez kayar ve damıtılmış su içinde bir kez yıkayın.
      NOT: KRİTİK ADIMLAR: Aşağıdaki adımlar için kritik olanRNA granüllerinin varlığı maskeleme olmadan optimal aksonal counterstain edinin.
    28. Bir aydınlık mikroskop altında ilgi mRNA varlığını kontrol counterstain gerçekleştirmeden önce. Counterstain prosedür boyunca puncta varlığını izlemek için hangi beyin örneklerinde referans alanlarını tanımlayın.
    29. 60 o C'de ısıtın luxol hızlı mavi çözüm
    30. Yer luxol hızlı mavi slaytlar ve 60 o C de 30 dakika inkübe
    31. Damıtılmış su içinde birkaç kez çalkalayın.
    32. Daldırma farklılaşmasını başlatmak için% 0.05 lityum karbonat çözeltisi içinde birkaç kez kayar.
    33. Dip taze% 75 etanol içinde iki kez kayar.
    34. Damıtılmış su içinde durulayın.
    35. Bir aydınlık mikroskop altında beyin dilimleri kontrol edin. Gri ve beyaz cevher koyu mavi / siyah puncta olarak hala görünür ayırt ve RNA granülleri olmaya başlaması gerektiğini unutmayın. Aksonlar açık mavi lifler gibi görünen başlar doğrulayın.
    36. Tekrarlayın 2.2.32 ile 2.2.28 adımları. Perfor20 dk adımlar dikkatle counterstain ve RNA granül varlığının izlenmesi - 10 luxol hızlı mavi çözeltisi ile m inkubasyon. Not: Genellikle, optimum counterstain 60 kazanılır - bu RNA granüller luxol hızlı mavi leke (örnekler için bakınız Şekil 2) tarafından maskeli olabileceği şüphesi varsa 90 dakika (toplam kuluçka süresi) ancak zaman kısaltılabilir.
    37. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca kresil violet solüsyonu slaytlar inkübe edin.
    38. Damıtılmış su içinde slaytlar durulayın.
    39. Dip% 70 etanol içinde 5-10 kez kayar.
    40. % 100 etanol 3 hızlı değişiklikleri ile beyin dilimleri dehydrate.
    41. Bir çeker ocak içinde, 2 dakika ve oda sıcaklığında 5 dakika süre ile üçüncü kez ksilen, alternatif temizleme maddesi içinde iki kez inkübe edilerek açık bir beyin kesitleri.
    42. Ksilen bazlı kalıcı montaj ortamda Dağı beyin dilimleri.
    43. Bir aydınlık mikroskop altında örnekleri analiz edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yukarıda tarif edilen prosedürlere kısa bir özeti Şekil 1 'de gösterilmiştir.

Atf4 mRNA optimal deteksiyon ısıya bağlı maskesinin kaldırıldı kullanılarak kolinerjik aksonlarda granülleri

MRNA aksonal lokalizasyonu değerlendirirken, bu aksonlar tespit edebilmek ve düşük bol RNA'lar görselleştirmek mümkün önemlidir. Burada tarif edilen RNA, ISH teknolojisi, tek moleküllü çözünürlükte RNA'lar belirlenmesini sağlar. Bu teknolojiyi kullanarak...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yazıda axonally lokalize Atf4 mRNA'nın tespiti yüksek çözünürlüklü ISH teknolojisinin kullanımını tarif eder. Bu ve daha önce yayınlanmış çalışmalar, bu teknoloji dokular ya da hatta tüm embriyolar 33 antikor bazlı protein tespiti ile uyumlu olduğunu gösterir. Önemli olarak, bu son hipokampal nöronlar 34 dendritleri olan ark mRNA'nın tespiti için kullanılmıştır. Aynı zamanda, dokuya boyama için histolojik boyalar ile kombine edilebilir. Son olarak, birden fazla hedef RN...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Alzheimer Derneği (NIRG-10-171721; U.H.), Ulusal Ruh Sağlığı Enstitüsü (MH096702; U.H.), Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme Enstitüsü (NS081333; C.M.T.'ye) ve Columbia Üniversitesi'ndeki Ulusal Yaşlanma Enstitüsü tarafından finanse edilen Alzheimer Hastalığı Araştırma Merkezi'nden (AG008702; J.B. ve YYJ'ye) New York Beyin Bankası'nı da destekleyen pilot çalışma ödülleri tarafından desteklenmiştir. Hengst laboratuvarı üyelerine yorum ve tartışmaları için teşekkür ederiz

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
farenin 20-1,381 kalıntısı Atf4 mRNA (NM_009716)Advanced CellDiagnostics-probe
insan ATF4 mRNA'nın 15-1,256 kalıntısı (NM_001675.2)Gelişmiş Hücre Teşhisi-prob
negatif kontrol probu-DapBGelişmiş Hücre Teşhisi310043probu
pozitif kontrol probu-fare Polr2A (isteğe bağlı)Gelişmiş Hücre Teşhisi312471probu
pozitif kontrol probu-insan PPIB (isteğe bağlı)Gelişmiş Hücre Teşhisi313901probu
RNAscope Floresan Multipleks Reaktif Kiti (floresan tespiti için)Advanced Cell Diagnostics320850in situ hibridizasyon kiti
RNAscope 2.0 HD Reaktif Kiti - KAHVERENGİ (kromojenik tespit için)Gelişmiş Hücre Teşhisi310035in situ hibridizasyon kiti
Keçi poliklonal anti-ChAT antikoruMilliporeAB144P
Luxol Hızlı Mavi-Cresyl Echt Menekşe Leke KitiAmerican MasterTechKTLFB
Clearify temizleme maddesi (ksilen ikamesi)American MasterTechCACLEGAL
ProLong Gold montaj  DAPILife TechnologiesP36935
DPX montaj ortamı Sigma6522
ile orta

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jung, H., Yoon, B. C., Holt, C. E. Axonal mRNA localization and local protein synthesis in nervous system assembly, maintenance and repair. Nat. Rev. Neurosci. 13, 308-324 (2012).
  2. Campbell, D. S., Holt, C. E. Chemotropic responses of retinal growth cones mediated by rapid local protein synthesis and degradation. Neuron. 32, 1013-1026 (2001).
  3. Wu, K. Y., et al. Local translation of RhoA regulates growth cone collapse. Nature. 436, 1020-1024 (2005).
  4. Piper, M., et al. Signaling mechanisms underlying Slit2-induced collapse of Xenopus retinal growth cones. Neuron. 49, 215-228 (2006).
  5. Yao, J., Sasaki, Y., Wen, Z., Bassell, G. J., Zheng, J. Q. An essential role for β-actin mRNA localization and translation in Ca2+-dependent growth cone guidance. Nat. Neurosci. 9, 1265-1273 (2006).
  6. Hengst, U., Deglincerti, A., Kim, H. J., Jeon, N. L., Jaffrey, S. R. Axonal elongation triggered by stimulus-induced local translation of a polarity complex protein. Nat. Cell Biol. 11, 1024-1030 (2009).
  7. Gracias, N. G., Shirkey-Son, N. J., Hengst, U. Local translation of TC10 is required for membrane expansion during axon outgrowth. Nat. Commun. 5, 3506(2014).
  8. Preitner, N., et al. APC Is an RNA-Binding Protein, and Its Interactome Provides a Link to Neural Development and Microtubule Assembly. Cell. 158, 368-382 (2014).
  9. Brittis, P. A., Lu, Q., Flanagan, J. G. Axonal protein synthesis provides a mechanism for localized regulation at an intermediate target. Cell. 110, 223-235 (2002).
  10. Tcherkezian, J., Brittis, P. A., Thomas, F., Roux, P. P., Flanagan, J. G. Transmembrane receptor DCC associates with protein synthesis machinery and regulates translation. Cell. 141, 632-644 (2010).
  11. Colak, D., Ji, S. J., Porse, B. T., Jaffrey, S. R. Regulation of axon guidance by compartmentalized nonsense-mediated mRNA decay. Cell. 153, 1252-1265 (2013).
  12. Cox, L. J., Hengst, U., Gurskaya, N. G., Lukyanov, K. A., Jaffrey, S. R. Intra-axonal translation and retrograde trafficking of CREB promotes neuronal survival. Nat. Cell Biol. 10, 149-159 (2008).
  13. Ji, S. J., Jaffrey, S. R. Intra-axonal translation of SMAD1/5/8 mediates retrograde regulation of trigeminal ganglia subtype specification. Neuron. 74, 95-107 (2012).
  14. Bassell, G. J., Singer, R. H., Kosik, K. S. Association of poly(A) mRNA with microtubules in cultured neurons. Neuron. 12, 571-582 (1994).
  15. Kleiman, R., Banker, G., Steward, O. Development of subcellular mRNA compartmentation in hippocampal neurons in culture. J. Neurosci. 14, 1130-1140 (1994).
  16. Hengst, U., Jaffrey, S. R. Function and translational regulation of mRNA in developing axons. Semin. Cell Dev. Biol. 18, 209-215 (2007).
  17. Deglincerti, A., Jaffrey, S. R. Insights into the roles of local translation from the axonal transcriptome. Open Biology. 2, 120079(2012).
  18. Baleriola, J., et al. Axonally synthesized ATF4 transmits a neurodegenerative signal across brain regions. Cell. 158, 1159-1172 (2014).
  19. Gumy, L. F., et al. Transcriptome analysis of embryonic and adult sensory axons reveals changes in mRNA repertoire localization. RNA. 17, 85-98 (2011).
  20. Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. J. Neurosci. 29, 4697-4707 (2009).
  21. Yoon, B. C., et al. Local translation of extranuclear lamin B promotes axon maintenance. Cell. 148, 752-764 (2012).
  22. Dubacq, C., Jamet, S., Trembleau, A. Evidence for developmentally regulated local translation of odorant receptor mRNAs in the axons of olfactory sensory neurons. J. Neurosci. 29, 10184-10190 (2009).
  23. Willis, D. E., et al. Axonal Localization of transgene mRNA in mature PNS and CNS neurons. J. Neurosci. 31, 14481-14487 (2011).
  24. Kar, A. N., et al. Dysregulation of the axonal trafficking of nuclear-encoded mitochondrial mRNA alters neuronal mitochondrial activity and mouse. Dev. Neurobiol. 74, 333-350 (2014).
  25. Levsky, J. M., Singer, R. H. Fluorescence in situ hybridization: past, present and future. J. Cell Sci. 116, 2833-2838 (2003).
  26. Trcek, T., et al. Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast. Nat. Protoc. 7, 408-419 (2012).
  27. Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5, 877-879 (2008).
  28. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J. Mol. Diagn. 14, 22-29 (2012).
  29. Ge, S., Crooks, G. M., McNamara, G., Wang, X. Fluorescent immunohistochemistry and in situ hybridization analysis of mouse pancreas using low-power antigen-retrieval technique. J. Histochem. Cytochem. 54, 843-847 (2006).
  30. Wang, H., et al. Dual-Color Ultrasensitive Bright-Field RNA In Situ Hybridization with RNAscope. Methods Mol. Biol. 1211, 139-149 (2014).
  31. Kluver, H., Barrera, E. A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 12, 400-403 (1953).
  32. Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. Theory and Practice of Histotechnology. , 2nd edn, Battelle Press. (1987).
  33. Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos. BMC Biol. 12, 55(2014).
  34. Farris, S., Lewandowski, G., Cox, C. D., Steward, O. Selective localization of arc mRNA in dendrites involves activity- and translation-dependent mRNA degradation. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34, 4481-4493 (2014).
  35. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. The Journal of molecular diagnostics : JMD. 14, 22-29 (2012).
  36. Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. Theory and practice of histotechnology. , 2d edn, Mosby. (1980).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

In Situ HybridizationRNAscope TechnologyAxonal mRNA DetectionBrain Section AnalysisFluorescence ImmunohistochemistryAntigen UnmaskingProbe HybridizationSignal AmplificationCholine Acetyltransferase StainingLuxol Fast Blue Counterstain

İlgili makaleler