Sitokin yakalama Sistemi kullanılarak Klinik Uygulamalar için Sitomegalovirüs özgü otomatik Hücre Zenginleştirme T hücreleri

Hematopoietik kök hücre nakli (HSCT) ^1, graft-versus-tümör etkisini arttırmak ve fırsatçı enfeksiyonlara ² bağışıklığı sağlamak için adoptif T-hücre terapisi ile kombine edilebilir. Infüzyon için antijene spesifik donör kaynaklı T hücrelerinin üretilmesi tarihsel kalifiye personel ve GMP uyumlu olan uzman tesislerin kullanılmasını gerektirmiştir. Bu T hücrelerinin dağıtım fırsatçı enfeksiyon ³ çözünürlüğü hem de altta uzanan malignite ⁴ tedavi ile sonuçlanmıştır. Yakın geçmişte, araştırmacılar göstermiştir ki bin az sayıda virüs spesifik T hücrelerinin adoptif transfer (~ 1 x 10 ^{4-2,5 x} 10 5 hücre / kg alıcı vücut ağırlığı) başarılı bir şekilde HKHN ^5-9 sonra fırsatçı CMV enfeksiyonları tedavi olabilir. Ilişkili vasıflı imalat şartlarına GMP tesislerinin sınırlı sayıda ve hücre üretimi ile ilişkili yüksek maliyetli, ancak, restr vardırT-hücre tedavileri ¹⁰ vaat için icted hasta erişim. Antijen-spesifik T hücrelerinin izole edilmesi için bir yaklaşım, CD45 ve IFN-y tanımak için bir çift spesifik bir reaktif kullanılarak CCS dayanmaktadır. Gösterildiği gibi, bu yöntem, bir otomatik hücre ilave CCS cihazı (Şekil 1B) kullanılarak klinik düzeyde CMV-spesifik T hücreleri üretmek için kullanılabilir.

CMV-spesifik T hücreleri, CMV-seropozitif donörlerden lökaferez, toplam nükleer hücreler (TNC) CMV pp65 antijeninden örtüşen peptidlerin inkübe edilerek oluşturulur. İnsan lökosit antijen (HLA) bağlamında gösterildi Bu peptidler, IFN-y salgılaması için TNC olan CMV pp65-spesifik T hücrelerini aktive etmektedir. Bu T hücreleri daha sonra "esir" olmak ve manyetik ayrılmış olabilir. Birinci nesil cep zenginleştirme cihazının çalışması (Şekil 1A) birden s üstlenmek GMP koşulları altında hücre kültüründe yetişmiş personel gerekli ve personelin koordinasyonuBir "esir" ürünü üretmek için gerekli Teps.

Prosedür genellikle sürekli çalışma 12 saat için 10 gerekli ve bu nedenle personelin büyük olasılıkla GMP tesisi iki vardiya üzerinden çalışmak gerekiyor. Bu kısıtlamalar, artık (Şekil 1B de gösterilen), bir ikinci kuşak cihazının uygulanması ile ortadan kaldırılır. Bu cihaz, ilk nesil cihaza benzer manyetik zenginleştirme, taahhüt, ancak bir unbreached bir yaklaşımla CCS'nin diğer yönlerini otomatik hale getirir. Bu önemli ölçüde adımların en personeli tarafından sahipsiz yapılabilir olarak GMP ekibi üzerindeki yükü azaltır. Cihaz, bir kapalı bir sistem olarak işlev Dahası, antijen-spesifik T hücrelerinin yakalanır ve cihazı başlamadan önce lökaferez izolasyonu ve materyallerin hazırlanmasında yer alan adımları dışında masa üstü işlenebilir. Tam enstrümantasyon ve bu ikinci nesil cep zenginleştirme cihazın işlevselliği Detayları pub edilmiştir¹¹ yayımlanır.

Burada, biz otomatik hücre zenginleştirme CCS sistemini kullanarak bir kararlı durum aferez üründen CMV pp65-spesifik T hücrelerini zenginleştirmek için gereken adımları açıklar. Bir kez izole edildiğinde, bu, CMV-spesifik T hücreleri, hemen bir hastaya infüzyon yoluyla olabilir.

Steril Koşullarında Malzemelerin hazırlanması 1. (Malzemeleri ve Ekipmanları Tablo bakınız)

1. % 0.5 bir son konsantrasyona kadar insan serum albümini (HSA) ile desteklenmiş PBS / EDTA tampon maddesi 3 L hazırlanması (a / h).
2. Klinik sınıf% 0.9 sodyum klorid (NaCl) çözeltisi 1 L'lik bir çanta GMP sınıfı hücre kültür ortamının 2 L hazırlayın.
3. Steril su, 8 ml CMV pp65 bir vial sulandırılması CMV-spesifik peptid antijeni kokteyli 60 nmol hazırlayın.
4. Bir Luer / Spike interconnector kullanılarak 50 ml hacim dondurucu torbaya CMV pp65 peptid kokteyl aktarın ve boru setinin içine kokteyl sonraki dağılımını önlemek için forseps kilitleme kelepçe. Steril koşullar altında Açık hücreli zenginleştirme boru seti (TS 500).
5. Steril boru kaynakçı kullanarak, şu anda peptit kokteyl çantası kelepçesini açmayın boru setinin vananın 2 TS 500 için tüp bağlantısı içine peptid kokteyl donma çanta bağlayın.
6. Kaldır 1 x 10 ⁹ TBaşlangıç ​​hücre üründen NC ve 50 ml 'lik bir toplam hacme% 2.5 HSA ihtiva eden PBS / EDTA tampon maddesi içinde askıya. 150 ml'lik bir aktarma torbaya hücresel ürünü enjekte edilir.

2. Hazırlık ve Kullanım otomasyon Hücre Zenginleştirme Sistemi (Malzemeleri ve Ekipmanları Tablo bakınız)

1. Hücre zenginleştirme sistemi (Şekil 1B) açın ve programı "CCS_IFN-γ Zenginleştirme" seçeneğini seçin. Prosedür yoluyla operatöre rehberlik talimatlar ve resimlerle ekranları gösteren bir kullanıcı arayüzü gözlemleyin.
2. Parametresi "Operatör" ve "Boru Seti P / N Hayır" girin. Sonraki interaktif monitör ekranında görüntülenen talimatlara göre Boru Seti 500 otomatik hücre zenginleştirme cihazı takın.
3. Cihaza orta ve tamponlar bağlamak için ekranda görüntülenen yönergeleri adım adım izleyin. Kayıt katalog numarası ve connectin önce reaktiflerin lot numarasıCihaza örn.
4. Boru setinin son kontrolünden sonra, peptid kokteyl çanta kelepçeyi açın. Orta çantayı açın ve boru setinin otomatik hazırlanmasını başlatmak.
5. Priming adımı tamamlandıktan sonra, steril boru kaynakçı yardımıyla rezervuar torba (200 mi) içinde NaCI tampon içine HSA (% 2.5) tamamlar. Steril boru kaynak makinası kullanarak "Uygulama bag" içine başlayan hücresel ürünü aktarın.
6. Adaptörleri aracılığı ile ilgili boru içine CCS (IFNy) reaktifler bağlayın. Zenginleştirme işlemi öncesinde selüler malzemenin bir kısmını toplamak için tercih edilen bir zaman girin. İnceleme ve tüm verilerin doğruluğunu / parametreler girilir. Işlemini başlatın.
7. Otomatik hücre zenginleştirme işlemi başlamadan önce, kalite kontrol yastığı (QCB orijinal fraksiyon (ori) PBS / EDTA tampon maddesi ile seyreltildi, 100 mi odacık içeriği üzerinden yaklaşık 1.3 ml içeren) çıkarın. , QCB Seal tartmak ve 4 ° C'de saklayın.
8. Enrichme başlatnt süreci. İşlemin sonunda, hedef hücreler, rezervuar torba gelen seçme tampon çözeltisi yaklaşık bir hacmi ile elüt edilecektir.
9. Olmayan Hedef Hücre Bag (NTCB, negatif fraksiyon = negatif) ve Hedef Hücre Çanta (TCB, pozitif kesir = pos) Mühür ve her torbayı tartın. Ağırlıklar daha sonra hücre sayıları hesaplanması için kullanılacaktır.
10. Hemen zenginleştirme işleminden sonra akış sitometresi analizi için fraksiyondan başına iki alikotları toplamak ve 4 ° C'de numunelerin kalan saklayın. Hücre sayısı tayin zenginleştirme performans analizi (Tablo 1) Diğer numune kısım için bir numune kısım kullanın.
11. Hücresi zenginleştirme aletten boru setinin çıkarın. Ileride kullanmak üzere bir USB sürücüsüne günlük dosyasını aktarın.
    Not: Tüm reaktifler, steril koşullar altında hazırlanmalıdır. Biyogüvenlik tip II kaput kullanılması tavsiye edilir. Sağlıklı izole kararlı durum aferezi hücresel ürün (non-mobilize) kullanarakCMV seropozitif verici CMV antijen spesifik T hücrelerini zenginleştirmek. Sadece FDA HSA kullanılmalıdır lisanslı. Hücre hazırlama tamponu indirgenmiş saflık ve bir hedef hücre, indirgenmiş verimle sonuçlanır düşük veya daha yüksek çevre sıcaklıklarında olarak 25 ° C'ye kadar 19 ° C 'de tutulması gerekmektedir.

3. Hücre Sayısı Tayini

1. Tablo 1 'de gösterildiği gibi. Hücre sayımları için QCB, NTCB ve TCB hacimde al, 4 ° C'de 10 dakika süreyle karanlıkta her kısım (titre 01:11) CD45-VoBlue ekleyin ve inkübe edilir.
2. Orijinal fraksiyonu ve negatif fraksiyon pozitif fraksiyona 450 ul taze hazırlanmış kırmızı kan hücre parçalama çözeltisi 1,5 ml taze hazırlanmış kırmızı kan hücresi lizis çözeltisi (1x) ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika seyahati kesirler inkübe edin.
3. (100 ug / ml, 100 seyreltme 1) hemen önce analiz için 1 ug / ml nihai konsantrasyona kadar propidyum iyodür ilave edin. Hücre sayımı ve vi belirlemek için otomatik hücre sayacı kullanınyeteneği. Flow sitometri analizi için hücre karşı cihaz tavsiye yazılımını kullanın. Orijinal negatif ve pozitif fraksiyonları lökositlerin mutlak sayılarını belirlemek.
   Not: Hücre sayısı analizi için alınan örnekler ml'si başına canlı hücre sayısı lökositlerin hücre analizörü tarafından önerilen yazılım kullanılarak belirlenir.
4. Şekil 2 (bölge 5, uygun bir lökositler) 'de gösterildiği gibi bölge ayarlayın. Hücre sayısını belirlemek için aşağıdaki yolluk strateji kullanın. Orijinal fraksiyonunda bir canlı lökosit Şekil 2 'de gösterilmiştir.
5. Aşağıda belirtilen bölgeler (Şekil 2, 1-6) hiyerarşik olarak şunlardır:
   1: Zaman kapısı → 2: Tek hücre → 3: CD45 ^{+ hücreler} → 4: lökositler (enkaz hariç) 5 →: geçerli lökositlerin → 6: geçerli lenfositler
6. Negatif ve pozitif kesirler hücre sayılarını belirlemek için aynı adımları tekrarlayın. Bütün fraksiyonun hücre sayısını hesaplayınörnek ve fraksiyon (Tablo 2) toplam hacmine seyreltici faktörü dikkate alınarak.

Ayırma Performansının 4. Ara Sınavı

1. Önceden soğutulmuş PBS / EDTA tampon /% 0.5 AB serumu ile QCB, NTCB ve TCB fraksiyon hücrelerin alikotları yıkayın. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ve hücreler süpernatan aspire.
2. Içeren 100 ul antikor florokrom boyama karışımı içinde süspanse edin hücreleri: CD3-FITC CD4-APC, CD8-APC-Vio770, CD14-PerCP, CD20-PerCP, CD45-VioBlue ve anti-IFNy-PE (titresi 01:11) ve 4 ° C'de 10 dakika süreyle karanlıkta inkübe edilir.
3. 1 ml taze hazırlanmış kırmızı kan hücresi lizis çözeltisi (1x) ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ve süpernatan aspire. PBS / EDTA tampon /% 0.5 AB serumu yeterli bir hacimde tekrar süspansiyon hücreleri.
4. 100 diluti: 1 ug / ml hemen önce analiz (1 bir son konsantrasyona propidiyum iyot ekleme) 100 ug / ml üzerine. Numunenin saflığı değerlendirmek için flow sitometri analizi gerçekleştirir.
5. CCS zenginleştirme işleminden sonra pozitif fraksiyonun gösterilmiştir CD3 ^{+ T hücreleri} belirlemek için uygun bir lökosit Yolluk stratejisinde CD3 ^{+ T hücreleri} hesaplamak için aşağıdaki yolluk strateji kullanın. Aşağıda belirtilen bölgeler (Şekil 3A ve 3B, 1-6) hiyerarşik olarak bağlıdır:
   1: Zaman kapısı → 2: Tek hücre → 3: CD45 ^{+ hücreler} → 4: Hücreler (enkaz hariç) 5 →: geçerli lökositler → 6: geçerli CD3 ^{+ hücre} popülasyonu
6. CD4 +, CD8 +, CD4 + IFN-y ^{+ ve CD8 +} IFN-y ⁺ CCS zenginleştirme işleminden sonra, T hücreleri (Tablo 2) frekanslarını belirlemek.
7. F aşağıda ^CD4 +, ^CD8 +, ^CD4 + IFN-y ^{+ ve CD8 +} IFN-y ^{+ T hücrelerinin} frekansları belirlemek için yolluk strateji kullanarakveya CCS sürecinden sonra orijinal ve zenginleştirilmiş (esir) pozitif kesir. Aşağıdaki gibi gösterilen bölgeler hiyerarşik bağlantılı ve adlandırılır:
   1: Zaman kapısı → 2: Tek hücre → 3: CD45 ^{+ hücreler} → 4: Hücreler (enkaz hariç) 5 →: geçerli Lökosit → 6: geçerli ^CD3 + hücreleri → 7: ^CD4 + hücreleri → 7a: ^CD4 + IFN-γ ⁺ Hücreler (kutu) → 8: ^CD8 + hücreleri → 8a: ^CD8 + IFN-γ ^{+ hücreleri} (kutu)

NOT: hiyerarşi birinci bağlantı 6 belirtilen bölgeler, (1-6), burada Şekil 3 ile aynıdır ve 2 bölgeler geçen Şekil 4 (6-8a) 'de gösterilmiştir.

Bu çalışmada, bir otomatik hücre ilave CCS Sistemi CMV pp65-spesifik T hücrelerinin otomatik üretimi için kullanılmıştır. CMV-spesifik T hücreleri, üç aferez hücre ürünlerinden zenginleştirildi. Kararlı durum aferez ürünü 10 10 toplam nükleer hücreler (TNC) CMV seropozitif donörden 2 saat boyunca hasat ve üretilmiştir. 10 9 TNC CMV pp65 türetilmiş peptidler (60 nmol), 4 saat ve T hücreleri, otomatik hücre zenginleştirme cihazda CCS kullanılarak izole edildi salgılayan IFN-y için aktive edildi. Bir operatör, tüm reaktifler ve boru setleri yüklemek için deney başında ihtiyaç vardı. Cihazı başlanmadan açma başlangıçtaki sistemin Kur 120 dk yaklaşık 60 sürdü. Makine daha sonra reaktifler ve boru setleri (örneğin gecede gibi) gözetimsiz çalışan makinenin sağlayan ve böylece yüklendikten sonra başlamak için programlanmış olabilir, unutmayın. Operatör karakterizasyonu gerçekleştirmek için 15 saat sonra tekrar gerekliHücre saflık ve canlılık için son ürünleri. Zenginleştirme sonra hücre üst fazı, Mycoplasma ve endotoksin varlığı için taranmıştır. Doğrulama sonrasında işlenen hücreler hastalara doğrudan infüze edilebilir veya daha sonra uygulamalar için donduruldu.

Hücre sayımları Tablo 2'de verilen formüller kullanarak standart uygulamalar sayma aşağıdaki hücreyi tespit edilmiştir. Hücre sayısının her tür üç kez tekrarlandı ve sonuçlar standart sapma (SD) gibi ortalama toplam hücre sayıları ifade edildi. Raporlar daha sonra hücre analiz önerilen yazılımı kullanılarak analiz edildi. Uygun bir lökosit ve lenfositler belirlemek için Yolluk Şekil 2 'de gösterilmiştir. Hücre sayımları için veriler Tablo 3'te sunulmaktadır. Şekil 3 ve Şekil 4' de gösterilmiştir, IFN-γ + T hücreleri belirlemek için kullanılan Ayırıcı stratejisi. Zenginleştirme önce, hücrelerin canlılığı>% 95 rutin olmuştur. Enrichmen sonrat, hücrelerin hayatta kalabilirliği% 50 <idi. IFN-y + T hücrelerinin mutlak sayısı önce ve zenginleştirme işleminden sonra değerlendirildi. Zenginleştirme önce IFN-γ + T hücrelerinin sayısı TNC başlayarak, 10 9 türetilmiş olarak 1.14 x 10 6 ± 0.35 x 10 6 idi ve zenginleştirmeden sonra 3,09 x 10 5 ± 1.70 x 10 5 IFN-γ + T hücreleri olmuştur. Orada 0.16 ± 0.18% IFN-γ + işlemden önce mevcut CD4 + T hücreleri ve bu zenginleştirme sonrası 47.5 ± 34.7% yükseldi. CD8 + IFN-y + yakalama önce T hücrelerinin saflığı oranı 0,47 ±% 0.1, ve zenginleştirmeden sonra 90,3 ± 1,7% yükselmiştir (Tablo 3 ve 4). Yakalanan (pozitif) bir parça halinde Örnek iyileştirme sta IFN-γ + T hücrelerinin ölçümüne dayanan, CD4 + T hücreleri için 32,9 ± 15,7 ve% CD8 + T hücreleri için 31,8 ± 13,2% idi rting nüfusun (Tablo 4). Bu veriler, CD4 + ve CD8 + hem de CMV pp65-spesifik T hücreleri insan uygulaması için uygun olan bir şekilde, otomatik olarak hasat edilebilir olduğunu göstermektedir.

CCS sistemi kullanılarak CMV-spesifik T hücrelerinin Şekil 1. zenginleştirilmesi (A). Tecrübeli uzmanları tarafından işlenir birinci nesil hücresi zenginleştirme cihazında yer alan birden fazla işlem aşamaları. (B) işlem adımları çoğu ilk boru kurulum hariç otomatiktir İlk nesil cihazı ile karşılaştırıldığında operatör taşıma süresi 12 saat - 10 kaydeder ikinci nesil cep zenginleştirme cihazda. Zenginleştirilmiş CMV-virüs spesifik T hücreleri, hücre analizörü akış sitometrisi ile karakterize edilir. > Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2. Ayırıcı stratejisi 1 ile 6 sayı. Yaşayabilir T hücrelerini belirlemek için kullanılan şekilde gelen yolluk hiyerarşi etki gösterir. (1) (2) FSC alana karşı FSC-height çizerek çifti hücreleri çıkarılması, zaman kapısı kurulması (3) (4) (5) canlı lökositlerin Seçme ve (6) propidium iyodür boyama ile orijinal nüfus geçerli lenfositleri. hücre artıkları çıkarılması, CD45 + hücrelerin belirlenmesi, bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

yük / 52808 / 52808fig3.jpg "/>
Şekil CD3 + T hücreleri belirlemek için kullanılır 3. Yolluk stratejisi. Analizi leke akış sitometrisi (3A) önce ve (3B) hücre ilave Burada gösterilen sonra CD3 + T hücreleri. Daha önce zenginleştirme işleminden sonra örneklerde mevcut kaç CMV-spesifik peptid Aktive edilmiş T hücreleri belirlemek için son derece önemlidir. Bu şekilde, sayı 1 den 6 ya karşılık gelen hücre popülasyonu her iki boyuttaki veya belirli bir antikor ile boyanmış göstermektedir. (1), (3) CD45 + hücreleri seçme, (2) çift hücreleri çıkarılması, zaman kapı ayarlama (4) (5) canlı lökositlerin Seçme ve (6) geçerli CD3 + lenfositlerin hücre artıkları çıkarılması. Propidium iyodür boyaması ölü hücreleri çıkarmak için yapılmıştır./52808fig3large.jpg "Target =" _ blank "> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4. Ayırıcı stratejisi IFN-y + T hücrelerinin saflığını belirlemek için kullanılır. Aktif CMV-spesifik T hücreleri, kontrol CMV enfeksiyonu için kritik olan IFN-y + yüzden T hücreleri üzerinde ifade perdeleme kullanılmıştır. Zenginleştirmeden sonra zenginleştirme ve (B) daha önce CD4 + ve CD8 + alt-(A) arasında yer IFN-γ + T hücreleri. (08/07), CD4 + T hücreleri ve CD8 + T hücrelerinin yüzdesi A ve B 'de gösterilmiştir. (7a ) CD4 + IFN-γ + T hücrelerinin yüzdesi C Benzer yolluk alanı içinde kare kutu (a) 'da gösterilen ve D8 + IFN-γ + T hücrelerinin (8a). "T" geçitli popülasyonda hücrelerin% temsil toplam nüfusu ve "#" hücrelerin% temsil eder. Propidium iyodür boyama kapı dışarı ölü hücreleri uygulandı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Hücre boyama stratejisi için kullanılan fraksiyonların Tablo 1. Ciltler.

CD8 + IFN-y + T hücreleri zenginleştirme işlemi. Hesaplama sonra CD4 + IFN-y + T hücrelerinin hesaplanmasında kullanılan Tablo 2. Formüller benzer gerçekleştirilir.

Tablo 4. Saflık öncesi ve örnek içerisinde 1. zenginleştirme işleminden sonra IFN-γ + T hücre kurtarma.

Klinik sınıf CMV-antijene spesifik T hücrelerinin izolasyonu kullanılan strateji sıralama Tablo 5. Celi. 5

MD Anderson Kanser Merkezi ve Cooper Hem ZIOPHARM Onkoloji, Inc., ve Intrexon Corporation mali ilgi var. 7 Mayıs 2015 tarihinde, Dr. Cooper ZIOPHARM Onkoloji Baş Müdür olarak atandı. Doktor Cooper şimdi, MD Anderson bir Misafir Araştırmacı olduğunu. Doktor Cooper kurulan ve o yapay nükleazlarla ile Sangamo BioSciences ile patente sahiptir InCellerate, Inc. sahibi. O Targazyme, Inc. (eski Amerikan Kök hücreler, Inc.), GE Healthcare, Ferring İlaç, Kader Therapeutics, Janssen Pharmaceuticals ve Bristol-Myers Squibb danışır. O Cellectis Bilimsel Danışma Kurulu üzerindedir. O, Miltenyi Biotec honoraria alır.