Bu protokol, serum içermeyen tek katmanlı bir yöntem kullanarak embriyonik kök hücrelerden nöral progenitörler üretme yöntemini ayrıntılı olarak açıklar. Bu progenitörler, olgun nöral hücre tiplerini türetmek veya nöral spesifikasyon sürecini incelemek için kullanılabilir ve bileşik tarama için çok kuyulu format ölçeklendirmesine uygundur.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Serum serbest Tek tabakalı Kültüründe Fare Embriyonik Kök Hücre Sinir Farklılaşma
Bu makalede
Özet
Özet
nöral progenitörlerin fare embriyonik kök hücreleri ayırt etmek yeteneği (ESC) nöral özellikleri yanı sıra, daha fazla çalışma için olgun nöral hücre tiplerinin üretimini kontrol eden mekanizmaların çalışmasını sağlar. Bu protokolde serum serbest, tek tabaka kültürü kullanarak sinir atalarıdır için ESC farklılaşması için bir yöntem açıklanmaktadır. yöntem, etkili, ölçeklenebilir ve 4 içinde% 70 nöral projenitör hücrelerinin ~ üretimi ile sonuçlanır - 6 gün. Bu, çeşitli koşullar altında yetiştirilen çeşitli suşlardan ESC uygulanabilir. Sinir progenitörler, mikroskopla fonksiyonel nöronlar ve glia veya analiz içine daha ayırt sitometri veya moleküler teknikler akmasına izin verilebilir. farklılaşma süreci zaman atlamalı mikroskopi için uygun olduğunu ve nöral şartname sürecini izlemek üzere raportör hatlarının kullanımı ile kombine edilebilir. Biz sürecin b izin medya hazırlanması ve hücre yoğunluğu optimizasyonu hakkında ayrıntılı yönergeler sağlarE en ESC hatları ve hücre kültür kapları çeşitli uygulanan.
Giriş
Embriyonik kök hücreler, sinjeneik ya da bağışıklık yetersizliği konaklara (a Kimera oluşturarak) uygun bir aşamada embriyo yeniden yerleştirilmesi, aşağıdaki tüm yetişkin hücre tiplerine farklılaşma yetisine, enjeksiyon koruyarak, in vitro olarak sonsuza çoğalma kapasitesi ile erken embriyodan türetilen pluripotent hücreler (Bir teratom oluşturarak) ya da uygun işaretlere 1 in vitro konu. Nöral soy içine fare embriyonik kök hücrelerinin in vitro farklılaşması ve 1995 tarif edilmiştir ve morfojen retinoik asit ile takviye edilmiş 2-4 serum ihtiva eden ortam içinde çok-hücreli süspansiyon agregatların oluşumunu (embriyo....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Medya Hazırlık
Not:: 1 oranında, tipik olarak 1, B27 eki ile takviye modifiye N2 ek ve Neurobasal ile desteklenmiş DMEM / F12: Protokol iki ayrı ortam karışımı kullanımına dayanır.
- 15 ml'lik bir tüp içinde bileşenlerin karıştırılması ile değiştirilmiş N2 ek hazırlayın. Vorteks veya bu filtre etmeyin; çözüm netleşene kadar tersini tüp karıştırın.
- Daha sonra, (0.01 M HCl içinde yapılır) 25 mg / ml insülin 1 ml ilave edilir ve tersini tüp iyice karıştırın, DMEM / F12 içinde 7.2 ml pipetleme başlayın. Çözelti berrak olana kadar bu birkaç dakika sürer.
- (Su içinde oluşan), 100 mg, 1 ml / ml apo-transferrin, ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu deneyde, nöral farklılaşma izlemek için, bir endojen Sox1-GFP raportör ile, fare embriyonik kök hücreleri 46C hücre hattı 14 kullanılır. Sox1 nöral progenitor için bir marker Bu hücre hattı, ifade kullanılarak, yeşil floresan tespit edilebilir. Yoğunluğu Kaplama nöronal farklılaşma elde etmek için kritik bir faktördür. Fare embriyonik kök hücreleri / cm2 10,500 88.500 hücre arasında değişen farklı yoğunluklarda 6-çukurlu plaka içinde plakalanmıştır. Şekil 1A, 6-çukurlu plaka içi.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
tek tabaka sinir farklılaşma protokolü on üzerinden 6 kullanımda olmuştur. Protokol tanımlanan ortam oluşan ve pratik için sistem daha uygulanabilir kılan bir tek-tabakalı sistemde yapılır, yüksek verimli (örneğin, ilaç tarama) kullanır. Ancak, farklılaşma etkinliğini belirleyen bazı kritik faktörler vardır. Bu makalede, bu faktörleri ve her engel için çözüm işaret ediyor.
Farklılaşma durumu kaplama sonrası hücrelerin yoğunluğu belki de en önemli faktördür. Çok düşük yoğu.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Teşekkürler
Çalışma, Tayland Eğitim Bakanlığı'ndan W.W.'ye Bilim ve Teknolojinin Geliştirilmesi ve Teşviki bursu ve Tenovus ve Anonymous Trust'tan MPS'ye verilen hibelerle finanse edildi.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Fetal sığır serumu | Yaşam Teknolojileri | 10270-106 | |
| DMEM/F12 | Yaşam Teknolojileri | 11320-074 | |
| Nörobazal ortam | Yaşam Teknolojileri | 21103-049 | |
| StemPro Accutase Hücre Ayrışması Reaktifi | Yaşam Teknolojileri | A11105-01 | |
| B-27 Takviyesi, serumsuz | Yaşam Teknolojileri | 17504-044 | |
| İnsülin | Sigma | I6634 | Steril 0.01 M HCl |
| Apo-transferrin | Sigma | T1147 | sulandırın Steril su ile sulandırın |
| Progesteron | Sigma | P8783 | Etanol Putresin ile sulandırın |
| Sigma | P5780 | Steril su ile sulandırın | |
| Sodyum selenit | Sigma | S5261 | Steril su ile sulandırın |
| Sığır albümin fraksiyonu V | Yaşam Teknolojileri | 15260-037 | |
| L-Glutamin | Yaşam Teknolojileri | 25030-081 | Glutamin genellikle çökeltildiği için kullanmadan önce tamamen çözündüğünden emin olun |
| Jelatin | Sigma | G1890 | |
| 6 oyuklu doku kültürü kabı | Thermo Scientific | 140675 | |
| 24 oyuklu doku kültürü kabı | Thermo Bilimsel | 142475 | |
| 96 oyuklu doku kültürü kabı | Thermo Scientific | 167008 | |
| GMEM | Yaşam Teknolojileri | 11710-035 | |
| MEM Esansiyel olmayan amino asit çözeltisi | Yaşam Teknolojileri | 11140-050 | |
| Sodyum piruvat | Yaşam Teknolojileri | 11360-070 | |
| 2-merkaptoetanol | Sigma | M7522 | |
| 4′,6-Diamidino-2-fenilindol dihidroklorür (DAPI) | Sigma | D9542'de | |
| olduğu gibi kurum içinde hazırlanan | lösemi inhibitör faktör | ||
| III tübülin IgG antikoru | Covance | MMS-435P | |
| Floresan etiketli anti-fare IgG antikoru | Yaşam Teknolojileri | A31571 | Işıktan koruyun |
| 25 cm2 doku kültürü şişesi | Thermo Scientific | 156367 |
Kaynaklar
- Smith, A. G. Embryo-derived stem cells: of mice and men. Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 435-462 (2001).
- Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).
- Fraichard, A....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
