Method Article

Senkronizasyon Need for olmadan Akım Sitometri Kullanımı Hücre Döngüsü ilerleme zamansal İzleme

DOI:

10.3791/52840

⸱

August 16th, 2015

 , 
1Centre for Cancer Research, Westmead Millennium Institute for Medical Research and University of Sydney

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, zaman içinde belirli bir noktada S fazında olan hücrelerin zamansal izleme izin vermek için bromodeoksiüridin (BrdU) alımından kullanımını tarif eder. DNA boyalar ve antikor etiketleme eklenmesi daha sonraki zamanlarda S fazı hücrelerinin kaderi detaylı analizini kolaylaştırır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, hücrelerin senkronize edilmesini gerektirmeden hücre döngüsü boyunca hücrelerin izlenmesine izin veren bir yöntemi açıklar. Hücre senkronizasyonunu sağlamak birçok hücre sistemi için zor olabilir. Standart uygulama, belirli bir aşamada hücre döngüsü ilerlemesini bloke etmek ve daha sonra biriken hücreleri serbest bırakarak döngü boyunca birlikte ilerleyen bir hücre dalgası üretmektir. Bununla birlikte, bazı hücre tipleri bu bloğu toksik bulur ve bu da anormal hücre döngüsüne ve hatta kitlesel ölüme neden olur. Bromodeoksiüridin (BrdU) alımı, tek tek hücrelerin hücre döngüsü aşamasını izlemek için kullanılabilir. Hücreler, S fazı sırasında yeni DNA sentezlerken bu sentetik timidin analogunu içerir. Kısa bir süre için BrdU sağlayarak, BrdU mevcutken S fazında olan bir hücre havuzunu işaretlemek mümkündür. Bu hücreler daha sonra hücre döngüsünün geri kalanı boyunca ve bir sonraki replikasyon turuna kadar izlenebilir, bu da hücre döngüsü fazlarının süresinin potansiyel olarak toksik bir hücre döngüsü bloğunu indüklemeye gerek kalmadan belirlenmesine izin verir. Hücre döngüsünün sonraki aşamalarında hem iç hem de dış proteinlerin ekspresyonunu belirlemek ve ilişkilendirmek de mümkündür. Bunlar, hücre döngüsü aşamasının atamasını daha da iyileştirmek veya kontrol noktası aktivasyonu veya hücre ölümü gibi diğer hücresel işlevler üzerindeki etkileri değerlendirmek için kullanılabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

hücre döngüsü ilerlemesi sırasında hücre döngüsü özellikleri ve hücrelerde meydana gelen değişikliklerin değerlendirilmesi biyolojisi, özellikle kanser biyolojisi birçok yönünü anlamak için esastır. Malignitelerin tedavisi için geliştirilmesinde bir çok madde, hücre döngüsü ilerlemesi üzerinde derin etkilere sahip ya da hücre devre bağımlı-mekanizmalar yoluyla hücre ölümüne neden olmaktadır. Hücre döngüsünün belirli fazında hücre döngüsü dinamikleri veya hücreleri incelemek için, bu hücrelerin senkronize olağandır. Ancak senkronizasyon yöntemleri potansiyel sonuçlar elde karıştırıcı, çalışılan hücreleri üzerinde zararlı etkileri olabilir. 1 zamanla tek hüc....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan protokol, akut lenfoblastik lösemi hücre çizgisi NALM6 kullanır, ancak diğer hücre tiplerine uygulanabilir.

1. Çözümler ve Reaktifler

  1. Tam RPMI
    1. 56 ml cenin buzağı serumu (FCS) ve RPMI-1640 ortam içinde 500 ml'lik bir şişeye 5.5 mi, 200 mM L-glutamin ekleyin.
  2. BrdU Stok Çözümü
    1. Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin (DPBS) içinde 32.5 mM BrdU (10 mg / ml) hazırlayın.
  3. BrdU tam RPMI
    1. Tam RPMI 10 ml BrdU stok çözeltisi 6.2 ul ekleyin.
  4. DNaz Çözümü
    1. 1 mg Dnaz / DPBS ml hazırlayın.
  5. Lekeleme tampon maddesi
    1. DP....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yöntem, bir dizi bilgi elde etmek için kullanılabilir. Birkaç uygulamalar burada özetlenmiştir.

Hücre döngüsü süresinin değerlendirilmesi

Hücre döngüsü yoluyla transit hücreleri için gerekli süreyi belirlemek için, hücreler BrdU darbe sonra çeşitli zaman noktalarında toplanır. değerlendirmeler arasındaki aralıklar analiz edilmekte olan özel hücrelere uyarlanabilir. Hematopoietik hücre hatları, standart kültür koşulları altında, hücre döngüsü fazlarına uzunluğu.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre döngüsü analiz yeteneği kanseri biyoloji anlaşılması ve hücre çoğalmasını ve büyümesini etkileyen iki ilaç ve gen hareket mekanizması için çok önemlidir. Bildirildi hücre çoğalmasını ölçmek deneylerinde bir sayıda olsa da, çoğunluğu sadece Halen mevcut hücreleri gösteren bir ölçü sağlar. Bu doğrudan görselleştirme ve sayma, metabolik aktivite veya ATP konsantrasyonu ile hücre sayısını ölçmek deneyleri içermektedir. Bu yöntemlerin çoğu temel avantajı, koşullar ya da bileşikler, çok sayıda taranması için faydalı hal.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çalışma, ABD Lösemi ve Lenfoma Derneği (6105-08), NSW Kanser Konseyi hibesi (13-02), NHMRC Kıdemli Araştırma Bursu (LJB) (1042305) ve proje hibesi (1041614) tarafından finanse edildi.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
APC BrdU Akış KitiBD Biosciences552598BrdU antikoru, 7-AAD ve BD Cytofix/Cytoperm
Tamponu (Fiksasyon Tamponu olarak anılır)
içerir BD Cytoperm Geçirgenleştirme Tamponu PlusBD Biosciences561651Geçirgenleştirme tamponu olarak anılır
Perma/YıkamaTamponu BD Biosciences554723Yıkama tamponu
DNaseSigma olarak anılırD-4513
BD Şahin 12 x 75  mm FACS tüpleriBD Biosciences352008
BD Pharmingen Leke TamponuBD Biosciences554656
BD LSR FORTESSA akış sitometresiBD BiosciencesFORTESSA
PipetmanGilsonP2, P20, P100, P1000
RPMI 1.640 L-Gln olmadan 500 mlLonza12-167F
DPBSLonza17-512F
Fetal Sığır SerumuFisherBiotecFBS-7100113
L-GlutaminSigmaG7513-100ML
5-Bromo-2 & prime;-deoksiüridinSigmaB5002-1G
Falcon TC 150 & nbsp; cm2 bacalı ŞişelerBD Biosciences355001
Pipetler 25  mlGreiner760180
Aersol Pipetler 200  &mikro; lInterpath24700
Aersol Pipetler 1  mlInterpath24800
SantrifüjSpintronGT-175R
CO2 inkübatörBağlayıcıC 150
AF488 anti-Histon H3 Fosfo (Ser10) AntikorHücre Sinyali9708S
Fosfo-Chk2 (Thr68) (C13C1) Tavşan mAbHücre Sinyali2197S
Fosfo-Chk1 (Ser345) ( 133D3) Tavşan mAbHücre Sinyali2348S
NALM6 DSMZACC-128
BD Serisi

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Banfalvi, G. Methods Mol Biol. Banfalvi, G. 761, Humana Press. New York, Dordrecht, Heidelberg, London. 1-23 (2011).
  2. Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132, 487-498 (2008).
  3. Harper, J. W., Elledge, S. J.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cell Cycle ProgressionFlow CytometryBrdU UptakeS Phase TrackingCell Cycle AnalysisDNA SynthesisCell SynchronizationProtein ExpressionCheckpoint ActivationCell Death

Related Articles