Yöntem makalesi

Tasarım ve Yapay Ekstrasellüler Matrix İnşaatı (aECM) Proteinler gelen Escherichia coli Cilt Doku Mühendisliği

DOI:

10.3791/52845

⸱

11 Haziran 2015

 ,  , 
1School of Materials Science and Engineering, Nanyang Technological University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rekombinant teknolojiler, malzeme tasarımcılarının doku mühendisliği uygulamaları için özelleştirilmiş işlevlere sahip yeni yapay proteinler oluşturmasını sağlamıştır. Örneğin, yapay hücre dışı matris proteinleri, doğal ECM'lerden türetilen yapısal ve biyolojik alanları içerecek şekilde tasarlanabilir. Burada, elastin benzeri tekrarlar içeren aECM proteinlerinin yapımını ve saflaştırılmasını açıklıyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rekombinant teknoloji, ayarlanabilir özelliklere sahip yeni yapay proteinler oluşturmak için çok yönlü bir platformdur. Son on yılda, doğadan türetilen (veya de novo yaratan) fonksiyonel alanları içeren birçok yapay protein rapor edilmiştir. Özellikle, yapay hücre dışı matriks (aECM) proteinleri geliştirilmiştir; bu aECM proteinleri, fibronektin, lamininler ve kollajenlerden alınan biyolojik alanlardan oluşur ve elastin benzeri tekrarlar, ipek ve kollajen tekrarları dahil olmak üzere yapısal alanlarla birleştirilir. Bugüne kadar, aECM proteinleri doku mühendisliği ve yara onarımı uygulamaları için geniş çapta araştırılmıştır. Son zamanlarda, Tjin ve meslektaşları, insan derisi keratinosit bağlanmasını ve yayılmasını teşvik etmek için tasarlanmış integrine özgü aECM proteinleri geliştirdiler. Çalışmalarında, aECM proteinleri, fibronektin, laminin-5 ve kollajen IV'ten alınan hücre bağlanma alanlarını ve ayrıca elastin benzeri tekrarları yan yana getirir. Çalışmalarında geliştirilen aECM proteinlerinin, yapay deride substrat olarak kullanım için umut verici adaylar olduğunu gösterdiler. Burada, bu tür aECM proteinlerinin tasarımını ve yapımını ve ayrıca elastinin ısıya duyarlı özelliklerini kullanarak saflaştırma işlemlerini özetliyoruz.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Birkaç on yıl boyunca, hem sentetik hem de doğal malzemeler doku mühendisliğinde iskele olarak kullanılmak üzere araştırılmıştır1,2. Polimerler gibi sentetik malzemeler mükemmel yapısal bütünlük ve ayarlanabilir mekanik özellikler sunarken, dokuların büyümesini ve sızmasını teşvik etmek için genellikle yetersiz biyoaktiviteye sahiptirler. Öte yandan, hücre dışı matris (ECM) proteinleri gibi doğal malzemeler mükemmel biyolojik aktiviteye sahiptir, ancak partiden partiye değişkenlik, hızlı bozunma ve immünojenisite sorunları gibi sınırlamaları vardır. Bu nedenle, rekombinant proteinler arzu edilir, çünkü bunlar doğal proteinlerin3,4 yalnızca istenen özelliklerini taklit edecek şekilde tasarlanabilir.

Rekombinant protein mühendisliği, yeni yapay protein biyopolimerlerinin tasarımı ve üretimi için çok yönlü bir platform olarak yaygın ilgi toplamıştır. Genetik diziyi kontrol ederek, yapay proteinlerin işlevleri çok çeşitli uygulamalar için uyarlanabilir5,6. Özellikle, yapay hücre dışı matris (aECM) proteinleri, doku mühendisliği, rejenerasyon ve yara onarımı2,7 uygulamaları için birden fazla işlevselliğe sahip olacak şekilde uyarlanabilir. Daha da önemlisi, klonlama ve saflaştırma teknolojilerindeki ilerlemeler ölçeklenebilirliği artırmış ve rekombinant proteinlerin üretim maliyetini büyük ölçüde azaltmıştır. Klinikte kullanım için ekonomik olan düşük üretim maliyetleriyle büyük miktarlarda rekombinant protein üretmek mümkündür5.

Yapay hücre dışı matriks proteinleri, doku mühendisliği uygulamaları8-11 için geliştirilmiştir. Örneğin, Tirrell ve ark. fibronektin CS5 dizisi ve elastin benzeri tekrarlar (ELP-CS5) içeren yapay proteinler kullanarak küçük çaplı bir vasküler greft tasarladı. İnsan göbek damarı endotel hücrelerinin (HUVEC'ler) bu materyallere yapışabildiğini ve büyüyebildiğini gösterdiler12. Diğerleri ayrıca fibronektin, kollajen, laminin, fibrinojen ve vitronektinden alınan kısa biyoaktif dizilerin yanı sıra çeşitli füzyon proteinleri oluşturmak için elastin, örümcek ipeği ve kollajenleri taklit eden yapısal alanları da dahil etmişlerdir10. Elastin bazlı aECM proteinlerinden yapılan toplu çapraz bağlı filmler de doğal elastininkine benzer mekanik özellikler sergilemiştir (elastik modül 0,3-0,6 MPa arasında değişir)13. Daha sonra, daha uzun fibronektin fragmanları içeren aECM proteinlerinin, artan integrin bağlanma afiniteleri nedeniyle in vitro yara iyileşmesini hızlandırdığı da bildirilmiştir8.

Son zamanlarda, Tjin ve meslektaşları14 tarafından integrine özgü yapay ECM proteinleri geliştirilmiştir. Her aECM proteini, laminin-5, kollajen-IV ve fibronektin gibi doğal insan derisinin2,7,15 ECM bileşenlerinden alınan bir biyoaktif hücre bağlama alanı içerir. Örneğin,3Β1 α integrinin, laminin-5 alfa-3 zincir küresel alan 3'te (LG3)16,17 bulunan PPFLMLLKGSTR dizisini bağladığı gösterilmiştir. Raporlarında, birincil insan derisi epidermal keratinositlerinin, mevcut hücre bağlanma alanının tipine bağlı olarak, aECM proteinlerinin her birine bağlanmak için tercihen farklı integrinleri devreye soktuğunu gösterdiler.

Tjin ve arkadaşları tarafından yapılan çalışmada tartışılan aECM proteinleri, insan derisinin mekanik özelliklerini taklit eden elastin benzeri alanlar {(VPGIG)2VPGKG(VPGIG)2}8 içerir. Ek olarak, lizin kalıntılarının elastin benzeri tekrarlara dahil edilmesi, sulu çözücülerde genel protein çözünürlüğünü de arttırır. Ek olarak, lizin kalıntıları, çapraz bağlı aECM filmlerinin12 oluşumunu kolaylaştırmak için çapraz bağlama bölgeleri olarak da işlev görür. aECM protein dizisine elastin benzeri tekrarların dahil edilmesi, proteinlerin Ters Geçiş Döngüsü (ITC)14 yoluyla kolayca saflaştırılmasını sağlar. Elastinler, düşük kritik çözelti sıcaklığı (LCST) veya ters geçiş sıcaklığı (Tt)18-20 olarak bilinen belirli bir sıcaklıkta keskin ve tersinir bir faz geçişine uğrar. Elastinler ve elastin benzeri tekrarlar, LCST'lerinin altında hidrofilik rastgele bobin konformasyonlarını benimser ve suda çözünür hale gelirken, LCST'lerinin üzerinde elastinler hızla mikron boyutunda parçacıklar halinde toplanır. Bu tür faz geçişleri geri dönüşümlüdür ve bu nedenle, elastin bazlı aECM proteinlerinin ITC tekniği21 aracılığıyla kolayca saflaştırılmasına izin vermek için kullanılabilir.

Bu çalışmada, elastin benzeri tekrarlara kaynaşmış biyoaktif hücre bağlama alanları içeren yapay ECM proteinlerini tasarlamak, oluşturmak ve saflaştırmak için genelleştirilmiş bir prosedür rapor ediyoruz. aECM proteinleri için amino asit dizilerini kodlayan plazmitleri tasarlama ve klonlama işlemi açıklanmaktadır. ITC kullanarak aECM proteinlerini saflaştırmak için ilgili adımlar özetlenmiştir. Son olarak, SDS-PAGE elektroforezi ve Western Blotting kullanılarak elde edilen aECM proteinlerinin saflığını belirleme yöntemleri tartışılmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AECM Proteinler için rekombinant kodlayan plazmidlerin yapılması Vektör 1. Klonlama

  1. Fonksyonel (örneğin, hücre bağlama alanı ve elastin-benzeri tekrarlar) amino asit dizisini tasarımı. Fonksiyonel etki uçlarını yan Tasarım kısıtlama siteleri alt klonlama yazılımı talimatlarına göre özgür yazılım kullanarak (örn http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/) kolaylaştırmak için. Burada, planlanan bölgelere sindirimi sınırlandırmak için işlevsel bir etki mevcut değildir tek bir sınırlandırma bölgesine seçin. Çoklu klonlama yerinin ana vektörün (MCS) görünür kısıtlama bölgelerini seç (örn, pET22b (+)) alt-klonlama için.
  2. Yazılım talimatlarına göre ücretsiz web sitelerini kullanarak nükleotid dizisi içine amino asit dizisini çevirmek Ters. (Örneğin, http://www.bioinformatics.org/sms2/rev_trans.html). Emin olun kodonları E. için optimize edilmiştir E. coli ana.
  3. Ilgi Gen purchas olabilired, ticari olarak, tek sarmal kollu oligonükleotitlere, ve DNA tavlama yerine (oligonükleotidler <100 baz çifti (bp) ise, yani,) (adım 1.4) maliyetini azaltmak için. Aksi takdirde, 100 bp daha büyük genler için, onlar ticari şirketler aracılığıyla satın alınabilir.
  4. Oligonükleotidlerin DNA tavlama
    1. Istenen gen sekansı elde etmek için, DNA oligomerleri yeniden birleşir. 1 ug / ul nihai konsantrasyona (süzüldü, 2-amino-2- (hidroksimetil) -propan-1,3-diol, pH 8.0, 10 mM Tris), bir DNA oligomeri tamponu DNA oligonükleotidleri çözülür.
    2. Toplam 40 ul karışım elde etmek için, DNA bağlanma tamponu 32 ul (10 mM Tris, 100 mM NaCI, 100 nM MgCl2), her bir oligomerin 4 ul ekleyin.
    3. Bir ocak gözünü kullanılarak suyun beher kaynatılır ve 5 dakika, 95 ° C'de karışım bırakın. Beher çıkarın ve yavaş yavaş strafor kutu O / N kurmak bütününü serin. oligomerleri tavlanmış ve sindirim hazır edilmiştir.
  5. Tavlanmış oligomerleri (örneğin, insert olarak anılacaktır) ve bir ev sahibi vektör ayrıca (yani pET22b (+)) sindirimi karşılık gelen restriksiyon enzimleri ekleyin. 37 ° C'de 3-4 saat boyunca aşağıdaki tarifi (DNA 1-2 ug her bir sınırlama enzimi 2 ul, toplam 50 ul karışımına 10x sınırlayıcı enzim tamponu ve su yukarı 5 ul) kullanın.
    Not: pET22b (+) plazmid vektörü ampisilin antibiyotiklere dirençli ve C-termininde bir 6x-His etiketi içerir. PET22b (+) mevcut 6x-His etiketi 7. adımda western blotting ile hedef proteini tanımlamak için His-etiketli antikorlar kullanmamızı sağlar.
  6. Her sindirim karışımı 6x yükleme boyası ekleyin. Ayrıca 100 V Visualize bir UV ışık ışığı ile% 1.2 DNA, agaroz jel, 1 saat boyunca bir UV floresan DNA leke ihtiva eden% 1.2 agaroz jelleri üzerinde, DNA, bir DNA merdiveni de dahil olmak üzere sindirim karışımları çalıştırın.
  7. Ticari jel arıtma kitleri kullanılarak sindirilmiş DNA ürünleri ayıklamak için jel dilimleyin. Elute 50-100 ng / ul arasında en az bir DNA konsantrasyonu elde etmek için sütun için minimum hacim kullanılarak gerçekleştirilmiştir.
  8. Sindirilmiş DNA inserti bağlanarak İlgi sırasıyla geni birleştirin (örneğin, DNA, tavlama ile elde elastin tekrarlar ya da hücre bağlama alanları), aşağıdaki tarifi kullanarak, T4 ligaz kullanılarak plazmid vektörüne (vektör 2 ul T4 ligaz 1 ul, T4 ligasyon tampon maddesi, x, ul ilavenin, 1.5 ul, toplam 15 ul karışım 10.5-X ul su). 2 saat boyunca oda sıcaklığında Ligasyon karışımı inkübe edin.
    Not: ekleme vektörün molar konsantrasyonu ligasyonu verimliliğini optimize etmek üzere, çeşitlendirilebilir gerekir. Tarifte X olarak adlandırılan parçanın hacmi adım 1.7 taşınan bir DNA konsantrasyonuna bağlıdır.
  9. Çözülme E. E. coli DH5α kimyasal olarak kompetan hücreler (veya herhangi bir klonlama suşu) buz üzerinde. Sıcak eden 2xYT agar plakaları ampisilin (25 ug / ml) ihtiva eden (Tablo 1) 37 ° C arasındadır.
  10. Kullanılarak hücrelerini dönüştürmekısı şoku:
    1. Kısım, temiz, önceden soğutulmuş mikro santrifüj tüplerine yetkin hücre 50 ul. Pipet 5 ul hücre içine ligasyon karışımının (100 ug ng ila 100 arası), pipetleme hafifçe yukarı ve aşağı karıştırın. 20 dakika boyunca buz karışımı bırakın.
    2. 2 dakika için 42 ° C su banyosu içinde hücre karışımı ihtiva eden mikro santrifüj tüpü daldırın ve 2 dakika süreyle buz üzerinde döndü. Hücrelere ısı hasarı en aza indirmek için daldırma süresini zaman.
    3. Mikro santrifüj tüpüne SOC ortamı (Tablo 1) 500 ul ilave edin ve 1 saat boyunca çalkalanarak 37 ° C'de inkübe edin.
    4. Ampisilin (25 ug / ml) ihtiva eden, oda sıcaklığına önceden ısıtılmış olan bir 2xYT agar plakası üzerine hücre / ligasyon karışımı 50 500 ul yayın ve plakalar 37 ° CO de baş aşağı inkübe / N (12-16 saat) .
  11. Ertesi gün, temiz pipet uçları kullanılarak agar plakasından DNA kolonileri seçin. (Tablo 2YT ortam 5 ml koloniler büyütün1) ihtiva eden ampisilin (25 ug / ml), O / N) çalkalanarak (225 rpm, 37 ° CO / N- (12-16 saat).
  12. Ertesi gün, üreticinin protokolüne uygun olarak aldı her koloninin için DNA plazmidleri elde etmek için bir plazmid izolasyon kiti kullanmak. Su, 50 ul DNA Zehir.
  13. 37 ° C'de 2 saat boyunca inkübe edin (5 ul DNA, her biri, sınır enzimi 0.2 ul, toplam 10 ul karışım için 1 ul 10x sınırlayıcı enzim tamponu ve üst kadar su): Bir test, aşağıdaki tarifi kullanarak sınır enzimleri ile sindirmek gerçekleştirme büyük olasılıkla adım 1.6 olarak% 1.2 DNA agaroz jel üzerinde insert ve koşmak ihtiva sömürgeler için ekrana.
    NOT: sindirimi üzerine başarılı bir ligasyon gereken iki grup, vektör ve bunların ilgili molekül ağırlığına karşılık gelen insert (Şekil 1) için bir tane, her sonuçlanır.
  14. Ileri T7 promotör kullanılarak DNA dizileme için olası koloniler Gönder ve ticari sequencer için primerler ters.

2. Bakteriyel ekspresyon konak içine rekombinant plasmid transformasyonu

  1. Sıralama sonucu itibaren başarıyla bağlandı edilmiş bir koloni seçin ve bir E. dönüşüm için DNA plazmid kullanmak E. coli ekspresyon konakçı.
  2. Çözülme E. E. coli sentezleme türü buz üzerinde (BL21 (DE3) pLysS). Bu sırada, oda sıcaklığına kadar, ampisilin (25 ug / ml) ve kloramfenikol (34 ug / ml) ihtiva eden sıcak bir agar plakaları.
    Not: Bakteri içinde mevcut pLysS plasmidi BL21 (DE3) pLysS, bir kloramfenikol direnç genini ihtiva süzün. pLysS plazmid konstitütif aECM proteininin sızıntılı ekspresyonunu sınırlamak için ifade edilen bir T7 represör geni içermektedir. Kloramfenikol kültür sırasında pLysS içeren bakteri hücreleri seçmek gereklidir.
  3. Adımı yineleyin 1.10 E. dönüştürülmüştür olarak ulaşmak için Yapay proteinleri ifade hazırız coli hücreleri. Parafilm agar plakaları sarın ve 4 baş aşağı saklamak 6; bir ay kadar C.

AECM Proteinlerin 3. Bakteriyel ekspresyon

  1. , Şekil 2, bir pipet ile transforme agar plakasından bir koloni çekme ve steril Terrific Broth (TB) ortam bir test tüpü içinde ampisilin ve kloramfenikol antibiyotik hem de ihtiva eden (Tablo 1) 10 ml inoküle bakınız. 225 rpm'de çalkalanarak 37 ° de CO / N- (12-16 saat), bu başlatıcı kültür inkübe edin.
  2. Transfer 3 L'lik Erlenmeyen şişesi aynı antibiyotik ile takviye edilmiş 1 L'lik, taze ve steril TBC ortamı içine başlatıcı kültür 10 mi. 2-3 saat boyunca 225 rpm'de çalkalanarak 37 ° C'de kültür inkübe ve kültür (OD 600), optik yoğunluğunu dikkate okuma için boş bir küvetin içine kültürün 1 ml pipetleme 0,6-0,8 ulaşmıştır. Önceden SDS-PAGE karakterizasyonu için indüksiyon kültürün 1 ml'sinin kaydedin.
    1. Hücre kültürü OD 600 ölçmek için, bir küvet TB medya 1 flakon hazırlamakBoş bir ölçüm için. Ayrı olarak, bir yeni, boş bir küvet içinde kültür şişesi kültür 1 ml aktarın. 600 nm 'lik bir emişteki boş kontrol karşı bir spektrofotometre kullanılarak kültür optik yoğunluk ölçülür.
    2. 2 dakika için 12,000 x g'de bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü, santrifüje kültür numune 1 ml aktararak (daha sonra, SDS-PAGE analizi için) örnek kaydedin ve süpernatant süzün.
  3. 1 mM'lik nihai bir konsantrasyona kadar izopropil β-D-1-tiogalaktopiranosid (IPTG) ile kültür neden ve başka bir 4 saat boyunca 225 rpm'de çalkalanarak 37 ° C'de inkübe edin. SDS-PAGE karakterizasyonu için 4 saat sonra indüksiyon sonunda kültür 1 ml kaydedin.
  4. 4 ° C'de 30 dakika boyunca 12,000 xg'de 1 L'lik bir santrifüj şişeleri ve santrifüj kültürünün aktararak hücreleri hasat. Ug / ml 0.5 (pH = 8.0, 1 M Tris, 0.01 M EDTA, 0.1 M NaCl), süpernatant atılır TEN tamponu içinde hücre pelletleri ve tekrar süspansiyon tartın.

Bakteriyel Kültürlerin 4. Liziz

  1. -80 ° CO / N de yeniden askıya hücre kültürü dondurun. Hücreleri lize etmek için, oda sıcaklığında veya buz üzerinde bir su banyosu içinde dondurulmuş hücre kültürü çözülme. Cozundururken 10 ug / ml Deoksiribonükleaz I (DNase I), 10 ug / ml ribonükleaz A (RNaz I) 'in ve 50 ug / ml fenilmetilsülfonil florid (PMSF) ilave edin ve yavaş karıştırma ile çözelti homojenleştirilir.
  2. Tüm yeniden süspansiyon haline getirilmiş hücreler çözündürüldü sonra, su 12 içerisindeki protein çözünürlüğünü artırmak için, pH 9.0 çözeltisi ayarlayın. Homojen bir kıvam elde etmek için buz üzerinde karıştırılarak akıllıca 6 N NaOH damla ekleyin. 2 mm çapında yassı uç, 5 sn darbe kullanılarak buz üzerinde 20 dakika boyunca ultrasonik parçalama ile lizleyin.
  3. 4 ° C'de 30 dakika boyunca 12,000 x g'de hücre çözümü santrifüjleyin. Daha sonra saflaştırma için 4 ° C sıcaklıkta, bir temiz, boş bir şişe ve mağaza süpernatant aktarın.
  4. Bu arada, -80 ° C TEN tamponu ve yeniden dondurma ile tekrar hücre pelletini. Içinüç kez tam hücre parçalama, tekrar donma / çözülme ve sonication süreci kadar. SDS-PAGE karakterizasyonu için 20 ul hücre lizatı kaydedin.

Ters Geçiş Bisiklet kullanarak aECM Proteinlerin 5. saflaştırılması

  1. Aşama 4.3 hücre lizatı harmanlayın ve elastin tabanlı proteinler 21 saflaştırılması için kullanılana benzer ITC kullanılarak aECM proteinlerini saflaştırmak için devam edin. Döngüleri 4 ° C olan, farklı sıcaklıklarda yapılabilir ve 37 ° C ("soğuk" olarak anılacaktır), sırasıyla devir ("sıcak" olarak anılacaktır).
  2. 4 ° C'de 2 saat süre ile 40.000 x g, hücre 50 ml'lik santrifüj şişeler içine lizat ve santrifüj Böl. Hücre pelet görünümü koyu kahverengi olmalı ve akıntısı görünmelidir.
  3. Pelet temiz bir ayrılık almak için pipetleme süpernatantı. Temiz santrifüj şişelerine supernatant toplamak ve (3 M maksimum) 1 M bir son konsantrasyona kadar NaCl ilave edin. Sıcak225 rpm'de çalkalanarak, 2 saat boyunca 37 ° C'ye kadar bir çözüm.
    NOT: NaCl ilavesi aECM neden agregasyon elastin bileşeninin geçişi tetikler. süpernatant bulanık dönecek. Protein konsantrasyonu yeterince yüksek olduğunda, beyaz köpüklü bir proteini santrifüj şişenin yanlarında görülebilir.
  4. 37 ° C 'de 2 saat süre ile 40,000 x g de aşama 5.3 süpernatant santrifüjleyin. Süpernatant Durusu. Metal bir spatula kullanılarak pelet ezmek ve manyetik bir karıştırma çubuğu ve plaka kullanılarak 4 ° C'de kuvvetli karıştırma O / N buz soğukluğunda otoklava damıtılmış su içinde pelet bitleri (50 mg / ml) yeniden süspanse edin. Pelet tamamen çözündürülmelidir.
  5. Tekrarlayın protein yüksek saflıkta elde etmek için 5.2 başka 3-5 kez 5.4 adımları.
  6. Saflaştırılmadan son çevriminden sonra, 4 ° C sıcaklıkta bulunan damıtılmış suyun karşı diyaliz protein çözeltisi desalt. Su, her 4 değişikliklerle 2-3 gün suya karşı protein çözeltisi Dialyzesaat ya da O / N 8 saat. SDS-PAGE için saflaştırılmış protein 20 ul kaydedin ve sonraki kullanıma kadar -80 ° C'de saflaştırılmış protein ve mağaza geri kalanı liyofilize.

SDS-PAGE elektroforezi kullanılarak aECM Proteinlerin 6. Karakterizasyonu

  1. (Moleküler ağırlığı büyük ise, daha iyi bir ayrılması için% 8 SDS-PAGE jellerinin kullanın), bir% 12 SDS-PAGE jeli hazırlayın. , Her bir örnek için 2 x SDS yükleme tamponu ekleyin ısı örnekleri 10 dakika boyunca 100 ° C 'de ve çalışma örnekleri jel üzerinde, 1 saat boyunca 100 V'ta ya aECM proteininin molekül ağırlığına tekabül eden bir protein merdiveni orta ulaşıncaya kadar Jel.
  2. Ayarlamak SDS-PAGE jelin almak ve bir Petri kabı içinde, 1 saat boyunca jel daldırın bir hacmi ile Coomassie Parlak Mavi leke (Tablo 2) ekleyin. Bir rocker 5 dakika boyunca bir destaining solüsyonu (Tablo 2) durulayın jel. Destaining çözümü değiştirin ve t arka kadar sallanan ile jel destain devamO Jel netleşiyor. Protein bantları açıkça görünür olmalıdır.
  3. Hedef proteinin moleküler ağırlığı belirlemek için, protein merdiveni karşı hedef proteinin konumunu Karşılaştırması.
  4. Bundan başka, hedef proteinin varlığını teyit etmek için, aşama 7'deki gibi Batı blotting işleminin gerçekleştirilmesi.

Western Blot kullanarak aECM Proteinlerin 7. Karakterizasyon

  1. Bir boyama yöntemi ile, Bölüm 6 'daki gibi bir% 12 SDS-PAGE jeli üzerinde örnekleri çalıştırın.
  2. SDS-PAGE jeli biraz daha büyük bir boyuta nitroselüloz zar kesilir. Aynı boyuta filtre kağıdı 4 adet kesin.
  3. Western transfer tamponuna filtre kağıdı ıslak bir parça (% 20 h / h metanol, 25 mM Tris, 190 mM glisin, pH 8.3), filtre kağıdı bir parça ile, ardından filtre kağıdı üstüne SDS-PAGE jeli, yer daha sonra nitroselüloz zara aktarıldı ve filtre kağıdı nihai Diğer iki adettir. Emin olun, tüm set-up yeterli batı aktarım tamponu ile batık.
    Not: proteinler temas üzerine membrana bağlanan olabilir gibi jel ve membran zaman bu noktada temas etmemesi gerekmektedir.
  4. Nitroselüloz zar, ardından bir Batı yarı kuru bir transfer ünitesinin içine iki filtre kağıtları yerleştirerek nitroselüloz zar üzerine transfer proteinleri ve dikkatli bir mesafede olan ve membran üzerinde SDS-PAGE jel yer son olarak son iki ıslak filtre kağıdı yer SDS-PAGE jeli. 45 mA, 30 dakika batı transferi çalıştırın. Voltaj daha yüksek 30 V ise tampon ekle
    Not: Tercihen bir girişimde membran üzerinde SDS-PAGE jeli yerleştirmek ve proteinler temas üzerine membrana bağlanan olabilir gibi zar üzerinde gereksiz jel çevrilmesini önlemek.
  5. Al ve oda sıcaklığında 2 saat boyunca (filtre kağıdı ile filtre edildi, PBS pH 7.4 içinde% 5 yağsız süt) çözeltisi bloke ile nitroselüloz zarı bloke eder. Tampon engelleme atınız ve durulama PBS ekleyin.
    NOT: Yeni eldiven değiştirin istenmeyen prote ile membran kirletmesini önlemek içinins.
  6. 1 PBS içinde seyreltme ile birincil anti-His antikoru inkübe: 1000, oda sıcaklığında 1 saat boyunca çalkalanarak. 1000 antikoru 1 ul (stok konsantrasyonu: 1 mg / ml) ekleyin: seyreltme oranı 1, örneğin, tüm membran daldırın olabilecek bir hacimde bir karışım hazırlayın, bir 1 ml toplam karışım için 999 ul PBS.
  7. (% 0.1 Tween 20 ile PBS) PBST 5 ml zar yıkayın.
  8. 1 PBS içinde seyreltilmesi ile bayırturpu peroksidaz (HRP) konjuge edilmiş ikincil antikor ile inkübe: 5000, oda sıcaklığında 1 saat boyunca çalkalanarak. 5000 antikoru 1 ul (stok konsantrasyonu: 1 mg / ml) ekleyin: seyreltme oranı 1, örneğin, tüm membran daldırın olabilecek bir hacimde bir karışım hazırlayın, 5 ml toplam karışım için 4999 ul PBS.
  9. PBST 5 ml zar yıkanır ve iki kez tekrarlayın.
  10. Membran kapak ve kullanılan alt tabaka için yönergeleri izleyerek inkübe hacmi zara kemilüminesan substrat uygulayın.
    NOT: Protein tespiti için alt tabakanın hassasiyeti değişebilir, biz sinyallerini artmaz antikor konsantrasyonunu arttırarak olay çok düşük sinyaller için azami hassasiyet ile bir alt tabaka öneririz.
  11. Bir CCD kamera tabanlı görüntüleyici kullanarak chemiluminescent sinyalleri yakalayın. Sinyallerin zayıf ve non-spesifik olup olmadığını birincil ve ikincil antikor seyreltme oranını ayarlayın. Arka sinyal yüksek ise çözümü engelleme uzun kuluçkaya yatmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elastin benzeri tekrarları içeren füzyon proteinleri tasarımında, genel bir elastin içeriğini, füzyon proteininin 18 arasında yeterince büyük bir kısmını muhafaza etmek önemlidir. Bu füzyon proteini yapısı saflaştırılması için ITC kullanmak için, onun elastin gibi özelliklerini muhafaza sağlamaktır. aECM proteinleri tasarımı ve bu bölümde tarif edilen sekanslar, özel olarak Tjin ve ark., 14 tarafından gerçekleştirilen çalışmadan alınmıştır. Bu çalışmada, üç aECM proteinleri başarı...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rekombinant protein mühendisliği aşağıdan yukarıya yaklaşımı kullanarak yeni protein malzemeleri oluşturmak için çok yönlü bir tekniktir. Protein bazlı malzemeler ilgi uygulamasına göre birden fazla işlevleri sahip olacak şekilde dizayn uygun olabilir. Nedeniyle klonlanması ve protein ifadesi teknolojileri artan ilerleme için, bir tekrar üretilebilir ve ölçeklenebilir şekilde yapay proteinler çeşitli oluşturmak için göreceli olarak basit (ve uygun maliyetli) olmuştur. elastin-benzeri domen bir saflaştırma etiketi olarak...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını olduğunu beyan ederim.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar Milli Eğitim Bakanlığı AcRF Tier 1 (RG41) fon kabul ve Nanyang Teknoloji Üniversitesi tarafından hibe başlatmak istiyorum. Alçak ve Tjin Nanyang Teknoloji Üniversitesi, Singapur Araştırma Öğrenci Bursu (RSS) tarafından finanse edilmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
pET22b (+)Novagen69744T7 ampisilin dirençli ekspresyon vektörleri 
BL21(DE3)pLysS InvitrogenC6060-03ek antibiyotikler - kloramfenikol
İzopropil-beta-D-tiyogalaktozit (IPTG)Altın BiyoteknolojiI2481COtoklavlanmış su ile 1 M stok çözeltisi, indüksiyondan önce taze hale getirin.
QIAprep Spin Miniprep KitiQiagen27106plazmit izolasyon kiti
T4 ligazNew England BiolabsM0202S
AmpisilinAffymetrix11259
KloramfenikolAffymetrix23660
Zymoclean & trade jel DNA geri kazanım kitiZymo ResearchD4001
XL10-altın türüAgilent Technologies200315

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chen, Q., Liang, S., Thouas, G. A. Elastomeric biomaterials for tissue engineering. Prog Polym Sci. 38 (3-4), 584-671 (2013).
  2. Groeber, F., Holeiter, M., Hampel, M., Hinderer, S., Schenke-Layland, K. Skin tissue engineering - In vivo and in vitro applications. Adv Drug Deliv Rev. 63 (4-5), 352-366 (2011).
  3. Kushner, A. M., Guan, Z. Modular Design in Natural and Biomimetic Soft Materials. Angewandte Chemie International Edition. 50 (39), 9026-9057 (2011).
  4. Gagner, J. E., Kim, W., Chaikof, E. L. Designing protein-based biomaterials for medical applications. Acta Biomater. 10 (4), 1542-1557 (2014).
  5. Gomes, S., Leonor, I. B., Mano, J. F., Reis, R. L., Kaplan, D. L. Natural and genetically engineered proteins for tissue engineering. Prog Polym Sci. 37 (1), 1-17 (2012).
  6. Werkmeister, J. A., Ramshaw, J. A. M. Recombinant protein scaffolds for tissue engineering. Biomedical Materials. 7 (1), 012002(2012).
  7. MacNeil, S. Biomaterials for tissue engineering of skin. Materials Today. 11 (5), 26-35 (2008).
  8. Fong, E., Tirrell, D. A. Collective Cell Migration on Artificial Extracellular Matrix Proteins Containing Full-Length Fibronectin Domains. Advanced Materials. 22 (46), 5271-5275 (2010).
  9. Ratner, B. D., Bryant, S. J. BIOMATERIALS: Where We Have Been and Where We are Going. Annual Review of Biomedical Engineering. 6 (1), 41-75 (2004).
  10. Cai, L., Heilshorn, S. C. Designing ECM-mimetic materials using protein engineering. Acta Biomater. 10 (4), 1751-1760 (2014).
  11. Annabi, N., et al. Elastomeric recombinant protein-based biomaterials. Biochemical Engineering Journal. 77 (0), 110-118 (2013).
  12. Heilshorn, S. C., DiZio, K. A., Welsh, E. R., Tirrell, D. A. Endothelial cell adhesion to the fibronectin CS5 domain in artificial extracellular matrix proteins. Biomaterials. 24 (23), 4245-4252 (2003).
  13. Simnick, A. J., Lim, D. W., Chow, D., Chilkoti, A. Biomedical and Biotechnological Applications of Elastin-Like Polypeptides. Polymer Reviews. 47 (1), 121-154 (2007).
  14. Tjin, M. S., Chua, A. W. C., Ma, D. R., Lee, S. T., Fong, E. Human Epidermal Keratinocyte Cell Response on Integrin-Specific Artificial Extracellular Matrix Proteins. Macromolecular Bioscience. 14 (8), 1125-1134 (2014).
  15. MacNeil, S. Progress and opportunities for tissue-engineered skin. Nature. 445 (7130), 874-880 (2007).
  16. Kariya, Y., et al. Differential regulation of cellular adhesion and migration by recombinant laminin-5 forms with partial deletion or mutation within the G3 domain of α3 chain. J Cell Biochem. 88 (3), 506-520 (2003).
  17. Shang, M., Koshikawa, N., Schenk, S., Quaranta, V. The LG3 module of laminin-5 harbors a binding site for integrin α3Β1 that promotes cell adhesion, spreading, and migration. J Biol Chem. 276 (35), 33045-33053 (2001).
  18. Hassouneh, W., Christensen, T., Chilkoti, A. Elastin-like polypeptides as a purification tag for recombinant proteins. Current Protocols in Protein Science. , 6.11.1-6.11.16 (2010).
  19. Keeley, F. Ch. 4. Evolution of Extracellular Matrix.Biology of Extracellular Matrix. , Springer. Berlin Heidelberg. 73-119 (2013).
  20. Le, D. H. T., et al. Self-Assembly of Elastin-Mimetic Double Hydrophobic Polypeptides. Biomacromolecules. 14 (4), 1028-1034 (2013).
  21. MacEwan, S. R., Hassouneh, W., Chilkoti, A. Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli. Journal of visualized experiments: JoVE. (88), e51583(2014).
  22. Meyer, D. E., Chilkoti, A. Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system. Biomacromolecules. 3 (2), 357-367 (2002).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Yapay ECM ProteinleriElastin Benzeri TekrarlarRekombinant Protein EkspresyonuTers Ge i D ng sProtein Safla t rmaSDS Page AnaliziWestern BlottingBakteriyel Konak TransformasyonuH cre LizisiSantrif j D ng leri

İlgili makaleler