Yöntem makalesi

Öğrenmenin Ayrık Aşama sırasında Kemirgenler uzaktan suskunluğu Sinir Aktivitesi Bir Yöntem

DOI:

10.3791/52859

⸱

22 Haziran 2015

 , 
1Department of Neuroscience, Oberlin College

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, fareler öğrenme ve hafıza görevleriyle meşgulken ayrı beyin bölgelerindeki nöronal aktivitenin geçici olarak ve uzaktan nasıl susturulacağını açıklar. Yaklaşım, farmakogenetiği (Tasarımcı-Reseptörler-Özel-Tasarımcı-Tarafından-Aktive Edilen-İlaçlar), öğrenmenin farklı bileşenlerini ayırt etmek için tasarlanmış davranışsal bir paradigma (duyusal ön koşullandırma) ile birleştirir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol hayvanların öğrenme ve bellek işlerle meşgul iken geçici ve uzaktan ayrık beyin bölgelerinde nöronal aktivitenin susturmak açıklamaktadır. yaklaşım birleştiren farmakogenetik (Tasarımcı-Reseptörler-Münhasıran-Aktif-by-Designer-İlaçlar) bir davranış paradigma (duyusal önkoşullama) ile öğrenmenin farklı biçimlerde ayırt üzere tasarlanmıştır. Spesifik olarak, viral kaynaklı dağıtım, bir genetik olarak tadil edilmiş inhibe edici G-protein bağlı reseptör kemirgen içinde ayrı bir beyin bölgesine (tasarımcı Reseptör) ifade etmek için kullanılır. Tasarımcı reseptör ekspresyon düzeyleri yüksek olduğunda Üç hafta sonra, bir farmakolojik ajan (Tasarımcı İlaç) önce belirli bir davranış oturuma sistemik 30 dakika uygulanır. ilaç tasarım reseptörü için afiniteye sahiptir ve bu nedenle tasarım reseptörünü eksprese eden nöronların inhibisyonu ile sonuçlanır, ancak aksi takdirde, biyolojik olarak inerttir. beyin bölgesi (2-5 saat susturulmuş vin kalırding) doz ve uygulama yoluna. Davranışsal paradigmanın tamamlayan beyin dokusu doğru yerleştirme ve reseptör ifadesi için değerlendirilir. Bu yaklaşım, davranış belirli bileşenleri tek tek beyin bölgelerinin katkı belirlenmesi ve davranışsal paradigmaların bir dizi boyunca kullanılabilir için özellikle yararlıdır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Davranışsal nörobilim alanında heyecan verici bir meydan okuma, karmaşık davranışlar nöral substratlar belirlemektir. Böyle kalıcı lezyonlar, kanüller implantlar yoluyla geçici beyin inaktivasyonu ve optogenetics olarak bir dizi teknik, karmaşık davranışlar alt bileşenleri ayrık beyin bölgelerinin katkıları belirlemek için kullanılmıştır. Bu yaklaşımlar öğrenme sırasında bölgesel özgüllük anlayışımızı haberdar ederken, her teknik sınırlamaları olmadan değildir. Özellikle kalıcı lezyonlar genellikle böylece etkileri paradigma süresince mevcut, davranış testi öncesinde yapılmaktadır. Beyin dokusunda önemli bir hasar üretebilir kısa süreli sinir inaktivatör (örneğin, tetrodotoxin) sunumunu içeren ve hemen önce davranışsal test konularda strese neden olabilir kanülasyon çalışmaları. Bundan başka, kanülasyon yoluyla etkisiz hale getirilmesi çevreleyen doku bölgesi ile sınırlıdırkanül ucu. Optogenetics spesifik beyin bölgelerinde aktivitesi zamansal kontrolü için bir esneklik sunar ise Son olarak, bu maliyetlidir ve teknik olarak zor olduğu.

Bu sınırlamalar bir farmakogenetik yaklaşım (Tasarımcı-Reseptörler-Münhasıran-Aktif-by-Designer-İlaçlar, DREADDs) 1,2 kullanılarak aşılabilir. Farmakogenetik kavramı gelişmiş iken önemlisi, tekniğin yürütme basittir. Bir tadil edilmiş inhibitör G-proteine ​​akuple bir reseptör için bir DNA fragmanını içeren bir toksin (örneğin, NMDA, ibotenik asit) ayn beyin bölgeleri içine, bu teknik, bir adeno-bağlantılı virüs (AAV) infüzyonu içerir infüzyonu içeren geleneksel bir stereotaksik cerrahi yöntemlere benzer (hM4Di; tasarımcı reseptörü) standart laboratuar kemirgenler ilgi bölgeye (Şekil 1). viral vektör, bir floresan haberci (mcitrine) içerir. Dahil kezhücrelere, tasarımcı reseptörü (ve raportör protein) maksimum ~ 3 hafta sonra infüzyon ifade edilir ve seçici olarak, aksi biyolojik olarak eylemsiz tasarım ilacın sistemik olarak uygulanması, klozapin-N-oksit ile 2-5 st için aktive edilebilir (CNO) 1 3. Deneyci, belirli beyin bölgelerinde nöral aktivitenin üzerinde kesin, ancak uzaktan kumanda zamansal sahip olduğundan, farmakogenetik birden aşamalarda yürütülen davranışsal paradigmalar ile özellikle de birleştirir. Bu örnekte, retrosplenial korteks katkısı (RSC) uyaran-uyaran öğrenme Pavlov öğrenmedeki rolü ile karşılaştırıldığında, ancak yaklaşımların bu kombinasyon beyin bölgelerinin nasıl katkıda özgü tespit etmeye sorulardan herhangi bir sayı için uygundur Karmaşık davranış.

Bu protokolde tarif edilmemiş ise ek olarak, viral ve transjenik yaklaşımlar hücre tipine spesifik DREADD ifade 2 elde etmek için kullanılabilir. IDREADD yaklaşımı kullanıldığında s doğasında deneysel manipülasyonlar, deneysel tasarım ve sonraki kantitatif analiz dikkatli dikkate farmakolojik ve / veya diğer türde içeren davranışsal paradigmalar gereklidir. DREADD yaklaşım yeni Deneyciler mevcut DREADD teknolojisi 2 kapsamlı bir inceleme adlandırılır.

Her gün, organizmalar yeni uyaranlara ve olayları ve birbirlerine olan ilişkileri hakkında bilgi edinin. Hatta tanıdık bir ortamda, örneğin ev, biri bu değişikliklerin anlamlı olayların tahmin olabilir, çünkü uyaranlara arasındaki ilişkilerde değişiklikler tespit etmek hızlıdır. Böyle bir uyaran-uyaran (örneğin, ilişkisel) öğrenme birden uyaranların conjoining içerir ve geleneksel medial temporal lobda 4 içinde merkezi bulunduğu hipokampus ile ilişkili olmuştur. Ancak, hipokampus var, ne de tek başına hareket etmez; içinde ve dışında hem kortikal bölgelermedial temporal lob yan hipokampal formasyon 5-7 kritik duyusal bilgi sağlar. Geleneksel kalıcı lezyon çalışmaları hipokampus bağımlı öğrenme kortikal bölgelere (örneğin, retrosplenial postrhinal ve entorinal korteks) bir dizi katılımı için ikna edici bir kanıt sağlar, ancak ayrı aşamalarında belirli bir bölgede rolünü ayırt etme yeteneği sınırlıdır 8-10 öğrenme.

Mevcut protokol RSC 3 fazlı duyusal önkoşullamasının paradigma 11,12 tek bir aşamasında RSC susturma yoluyla uyaran-uyaran öğrenme için gerekli olan hipotezini test eder. Kısaca, sıçanlar tasarım reseptörü içerir ve ~ 3 hafta sonra davranış testleri başlamadan önce tasarım madde (CNO) 30 dakika süresince verilir bir AAV infüzyonu yapılan. Mevcut protokolde, deneysel fareler test ilk aşamasında (uyarıcı-uyarıcı lear sırasında CNO alıyorsunuzning oluşur) ve test sonraki 2 aşamalarında aracı alırsınız. Davranışına CNO yanlışlıkla etkilerini kontrol etmek için, tasarım reseptörü (hM4Di) farelere süzülür ve bunun yerine CNO bir araç ile enjekte edilir. Viral infüzyon ve reseptör ifadesinin genel etkileri hesaba katmak için, tasarımcı reseptörü içeren ve CNO yönetmek değil bir kontrol virüsü demlenmeye.

AAV, farklı serotiplerin çok sayıda genetik bir malzeme uygulamak üzere kullanılır. rekombinant veya sentetik moleküllerini içeren Araştırma mevcut NIH Kılavuzu transgen potansiyel tümörijenik gen ürünü ya da bir toksin molekülü ya da kodlamak etmez ve yokluğunda üretildiği bu AAV (bütün serotipler) ve rekombinant ya da sentetik AAV yapıları korur Yardımcı virüs, BSL-1 önlemler (Ek B-1. Risk Grubu 1 (RG1) Acenteleri) 13 gerektirir. AAV yapısı, programı ve güvenlik ile ilgili yorumunun sayısı 14,15 mevcuttur. Özellikle, olsaAAV ile çalışırken, kemirgenlerde muhtemel üreme 16,17 ve potansiyel kanserojen mekanizmalar 18-20 ilişkin endişeler nedeniyle, bazı kurumlar BSL-2 önlemlerin kullanılmasını gerektirir. Araştırma Hastalık Kontrol ve ABD'de gen manipülasyonu için viral vektörler kullanılırken Rekombinant DNA Moleküller 13 İçeren Araştırma NIH Rehberi için, Merkezleri yapılacaktır bireysel kurumlarında gözetim komiteleri ile danışarak kullanımdan önce uygun BSL doğrulayın. Kişisel korunma, araştırmacı eğitimi, vektör çevreleme, dekontaminasyon, dekontamine malzemelerin imhası ve enjeksiyon sonrası hayvan barınağı gereksinimleri bu yönergelere göre belirlenir. Buna ek olarak, danışmak ve uygun Kurumsal Hayvan Bakım izleyin ve güvenli kullanım, yönetim ve AAV'nin bertarafını sağlamak için komite kurallarına veya eşdeğer kurumsal gözetim komitesi yönergeleri kullanın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

hayvanların kullanımı Oberlin College Kurumsal Hayvan Bakım tarafından onaylanmış ve komite kullanın ve Laboratuvar Hayvanları 21 Bakım Kılavuzu ile uyumlu ve Kullanımı vardır.

Viral İnfüzyon 1. Hazırlık

Not: Bu protokol BSL-1 önlemleri kullanır. BSL-2 önlemleri, tek kullanımlık laboratuvar önlüğü, eldiven, ayakkabı kapakları, göz korumaları ve maske (N95 tipi) kullanıldığında gereklidir. BSL-2 bileşikleri işleme Tüm bireylerin yerel halk sağlığı kurumu tarafından partikül solunum test uyması gerekir. Kullanım ve viral vektörlerin depolama ek ayrıntılar için Lowery & Majewska (2010) 22 Bkz.

  1. 20 ul mikrosantrifüj tüpler ilk kullanımda, kısım ve mağaza kullanılmayan virüs üzerine tekrarlanan donma ve çözülme önlemek için.
  2. Gereksiz nesneler kaldırarak ve% 70 etanol ile yüzeyi sterilize edilerek çalışma yüzeyini hazırlayın. Bir 1 hazırlayınAAV atık dekontaminasyon için% 0 çamaşır suyu çözeltisi. Çalışma yüzeyi üzerine çamaşır suyu çözeltisi ve steril bir 10 ul şırınga dolu bir behere koyun. Kurulması sırasında ezilmiş buz ile bir kapta AAV ile ependorf tüp yerleştirin.
  3. Standart bir tezgah yardımcısı içine virüs ile ependorf tüp yerleştirin. AAV en az 4 ul ile 10 ul şırınga yükleyin. Yükleme sırasında mikrosantrifüj tüp alt karşı şırınga ucu eğmemeye özen gösterin. Şırınga AAV solüsyonu 4 ul hiçbir hava kabarcığı olmadığından emin olun.
  4. % 10 çamaşır suyu içeren beher boş virüs tüp atınız. Tedarikçi tarafından belirtilen virüsün kullanılmayan kısımlarını saklayın.
  5. Atık konteynerine ek% 10 çamaşır suyu ekleyin ve atık dekontamine sıvı atık atmadan önce 30 dakika boyunca bekletin.
  6. Kurumsal rehberlere tarafından talimat olarak bir biyolojik tehlike kapta tüm koruyucu ekipman ve plastik atıkların bertaraf edin. Deco% 10 çamaşır suyu kullanarak virüs ile temas geldi herhangi bir ekipman veya yüzeyleri ntaminate.

2. Cerrahi

  1. Stereotaksik aparat altında ve özel bir virüs taşıma alanı olarak belirlenen bir komşu uzayda emici tezgah kağıdı koyarak cerrahi alan hazırlayın.
    1. Cerrahi aparat yakın adanmış virüs taşıma alanında% 10 çamaşır suyu atık kabını yerleştirin.
  2. Anestezi istikrarlı bir seviyede neden ve cerrahi sıçan hazırlar.
    1. Bilinç ve brüt maksatlı hareket eksikliği kaybı olana kadar izofluran gazı (1 ila 3% aralığı) ve oksijen (% 100 yaklaşık 1 L / dk) bir karışımını içeren bir indüksiyon odasına sıçan yerleştirin. Cerrahi prosedür boyunca izofluran anestezisi koruyun.
    2. 6 derin anestezi elde edildikten sonra, biraz kulakların arkasında gözleri arasından sıçan tıraş.
    3. Bir indüksiyon odasına geri sıçan yerleştirinEk 1-3 dk.
    4. Izofluran anestezi sistemi stereotaksik cerrahi burun konisi bağlı olduğundan emin olun. Stereotaksi için izofluran akışını başlatmak için izofluran boru üzerine musluğunu açın. Yukarıda belirtilen seviyelerde izofluran ve oksijen koruyun.
    5. Isırık bar üzerine ağız güvence ve kulak çubukları güvence altına alarak bir stereotaksik aparat sıçan yerleştirin.
    6. Kesi öncesinde cerrahi siteye göz gözler için yağlayıcı ve betadin uygulayın.
  3. Gözleri kaudal yaklaşık 2 mm başlangıç ​​kafatasının dorsal yüzeyi üzerinde bir deri 2.4 cm'lik orta hat kesi olun. Kafatası açığa çıkarmak için cildi çekin. Periyodik kurumasını önlemek için dokuların cerrahi sitenin marjları üzerinde steril% 0.9 steril tuzlu su aşılamak.
  4. Bregma ve lambda kadar kafatası temizle membranöz doku açıkça görülebilir.
  5. Kafatası dorsal-ventral koordinatları ölçerek düzeyi olduğundan emin olunBregma ve lambda de. Bregma ve lambda dorsal-ventral koordinatlar fazla 0.04 mm farklılık kadar buna göre stereotaksik cihaz ayarlayın.
  6. Şu anda,% 2 ila 2.5 izofluran gazı azaltır.
  7. Koordinatlar rezero, bregma matkap dönün ve sonra istenen medial-lateral için matkap taşımak ve ön-arka koordinat.
  8. Bir delik delin bir 28 G infüzyon şırınga için uygun bir boyut deliği üreten bir 0.9 mm matkap ucu kullanarak koordinat.
  9. 0.2 ul / dakikalık bir oranda virüs sunmak için infüzyon pompası olarak ayarlayın. Stereotaksik cihazın infüzyon koluna şırınga yerleştirin ve koordine istenen içine şırınga indirin. Virüs istenen miktarda (0.1 ul 0.8 arasındadır). Örneğin, 4 dakika boyunca AAV 0.8 ul sağlar.
    Not: İdeal infüzyon hacmi ve ilgi her bölgede virüsün yayılmasını tipik belirlemek için pilot çalışmalar yapmak.
    1. Virüsün teslim eş sonra10 dk iğne yolu içine geri akmasını önlemek için mplete yerinde şırınga bırakın. Yavaşça yaklaşık 5 mm / dakikalık bir oranda bir şırınga kaldırın. Tüm koordinatları AAV ile aşılanmış edilene kadar tekrarlayın.
  10. Cerrahi zımba ve kat topikal antibiyotik merhem ile yara yara kullanarak kapatın.
  11. Post-operatif ağrı yönetimi için kurumsal yönergeleri izleyin.
  12. Yatak, bir kapak ve uygun tabela ile bir kafeste sıçan yerleştirin ve hayvan tesis sıçan dönün.
    1. BSL-2 önlemler altında çalışan ise, kurumsal kurallar tarafından belirlenen süre (genellikle 48-72 saat) için yatak toplamak. Bir biyolojik tehlikeli atık kabına yatak yerleştirin.
    2. Güvenli bertarafı için kurallar tarafından belirtilen tüm AAV-kontamine malzemelerin imha ediniz.

3. Davranış Aparatı

Not: duyusal ön şartlandırma cihazı, standart edimsel koşullanma cham oluşurber paslanmaz çelik ızgara zemin ile (12 "L x 9.5" W x 11.5 "H), 2 pleksiglas yanaklar ve 2 metal duvarlar.

  1. 2 Hz parladı zaman görsel uyaranın ev ışık olarak hizmet alüminyum duvarlarının birinde ve bir 2.8 W ışık monte edin. Işitsel uyaranlara teslim odasının bir hoparlör monte (10 sn, 1500 Hz, 78 dB saf ses ve 10 sn 78 dB beyaz gürültü).
    1. Gıda kap içine 45 mg gıda pelet teslim etmek için bir gıda hazneyi kullanın. Gıda fincan içinde, kızılötesi fotoseller sırasında ve uyaranlara ve gıda ödülleri sunumların ardından, daha önce gıda fincan harcanan toplam zamanı algılar.
    2. Ev egzoz hayranları ile donatılmış ses azaltıcı dolapları odaları (22 "W x 22" H x 16 "D) (~ 68 dB).
    3. Veri edimsel odasına kontrol etmek ve elde etmek için Med Associates yazılım ile PC bilgisayar kullanın. Klima oturumları sırasında, presenta sırasında gıda fincan kafa ile harcanan toplam zaman hakkında veri toplamakIşık uyarıcı (5 sn çağında) ve tion ve gıda ödül (5 sn çağı) sunumu sırasında. Deney oturumu sırasında, (işitsel uyaranlar sonlandırılır 10 sn dönem başında) işitsel uyaranların sunum tepki olarak gıda fincan harcanan toplam zaman hakkında veri toplamak.

Duyu Önkoşullama Paradigma 4. Bakış

  1. Ameliyatın sonra, yavaş yavaş gıda serbestçe beslendikleri vücut ağırlığının% 85 sıçan sınırlar. Uygun bir yiyecek kısıtlaması paradigma için veteriner personel danışın.
    Not: 3-faz duyusal ön şartlandırma paradigması, Şekil 2'de tasvir edilmiştir.
  2. Önkoşullama Sessions (Faz 1; Günlük 64 dakika eğitimler 4 gün üst üste genelinde yürütülen):
    1. Işitsel ve görsel uyaranlara teslim oluşan 12 karışmış çalışmalar ile mevcut sıçanlar. Arası deneme aralıkları dahil her a sonra ortalama 4.5 dakika (aralık 4,0 dk 5,0) olduğunuuditory sunumu.
    2. 10 saniye boyunca denemeler, mevcut bir ton (ön şartlandırılmış uyaran) ile 6 günü, yanıp sönen ışık uyaran bir 5 sn sunumu hemen ardından.
    3. Diğer 6 çalışmalarda üzerinde 10 saniye boyunca yalnız beyaz gürültü (eşleşmemiş uyaran) sunuyoruz.
  3. Klima oturumları (Faz 2, 5 ardışık gün boyunca yapılan günlük 64 dk eğitimler):
    1. 5 saniye görsel uyaranın (yanıp sönen ışık uyaran) teslim oluşur 8 çalışmalar ile mevcut sıçan iki 45 mg gıda pelet teslim hemen ardından. Arası deneme aralıkları dahil her yargılamadan sonra ortalama 7 dakika (aralık 6.0 dk 8.0). Bazen fareler hafif yiyecekler dernek öğrenmek için 5'ten fazla klima oturumları gerektirir.
  4. Deney Session (Faz 3; tek 78 dakika oturumu):
    1. Yalnız işitsel uyaranların teslim oluşan 12 karışmış çalışmalar ile sıçan sunun. Ave arası deneme aralıkları dahilöfke 4.5 dakika (aralık 4,0 dk 5.0) Her işitsel sunumdan sonra.
    2. Çalışmaların, 6, 10 saniye boyunca tek başına ton uyaran (ön şartlandırılmış uyaran) sunuyoruz.
    3. Diğer 6 çalışmalarda üzerinde 10 saniye boyunca yalnız beyaz gürültü (eşleşmemiş uyaran) sunuyoruz.
  5. Şartlandırılarak uyarıcı olarak beyaz gürültü ve eşleşmemiş uyarıcı olarak sesi almak sıçanların ikinci seti ile çalışmayı tamamlayarak uyaranlara dengelemek.

5. Farmakolojik ve Davranış Prosedürü

  1. Davranışsal alete güç açın ve uygun davranış oturumu için Med-PC kodunu yükleyin. Tel ve programın davranış cihaz ses zayıflatma dolapları monte edilmiş fanları güç açıldığında açın böyle.
  2. Klozapin, N-oksit (CNO) bir 1 mg / ml çözelti hazırlamak için, 15 ml konik bir tüp içine CNO 5.0 mg ağırlığında ve steril% 0.9 SalI 5 steril su ml ya da 5 mlne. Çözelti kadar Vortex açıktır.
    1. CNO çözeltisi içine çözülmez veya CNO daha konsantre çözeltiler, örneğin DMSO 23 gibi çözündürücü bir ajan eklemek istendiğinde. Spesifik olarak,% 0.5 DMSO ile CNO bir 1 mg / ml çözelti hazırlamak CNO 5.0 mg ağırlığında ve 15 ml konik tüp DMSO 25 ul ekleyin. Fiske yavaşça içeriği tüpün tabanında kalmasını sağlamaktır. Çözelti berraklaştığında, steril su 5 ml ya da steril% 0.9 tuzlu su içinde 5 ml ekleyin. CNO çözeltilerini hazırlamak için ayrıntılı talimatlar DREADD wiki kaynak sayfa 25 mevcuttur.
    2. Uygulandığı her gün yeni CNO çözeltisi hazırlayın.
  3. 1 mg dozunda intraperitonal olarak enjekte edilir CNO / yaklaşık 30 dakika önce davranış testi kg. Örneğin, 1 mg / ml CNO çözeltisi 0.2 ml ile 200 g sıçan enjekte edilir. CNO yönetiminin dozu ve zamanı ders önce yayınlanan raporlara 2,12 dayanarak seçildi.
    1. (Faz 1, enjeksiyonların 4 gün toplam) her ön hazırlık oturumu öncesinde CNO 30 dakika enjekte ama tüm sonraki davranış oturumlar öncesinde araç yönetmek.
  4. 30 dakika sonra, davranış testi odalarına sıçanlar yer ve uygun davranış oturumu için bir bilgisayar kodu başlatır.
  5. Davranışsal görevin tamamlanmasının ardından hemen odalarından fareler kaldırmak ve hayvan koloni sıçanları dönün.

Davranış Verilerin 6. Analizleri

Not: Tüm davranışsal oturumlar için bağımlı değişken gıda fincan kızılötesi fotosel kesintisi ile tespit edilen sıçan kafası gıda fincan içinde olan süredir. (sn) veriler toplandı ve bilgisayar yazılımı tarafından kaydedilir.

  1. Davranış etmeyin Preconditioning aşamasında üretilen veriler üzerinde analiz eder.
  2. Klima oturumları için: Her farelerin a analizbility 5 davranışsal seans boyunca görsel uyaranın sunumu sırasında gıda fincan davranışını karşılaştırarak hafif yiyecekler dernek öğrenmek için. Özellikle, / oturum 8 çalışmaların her biri için 5 sn ışık çağında sırasında gıda fincan harcanan ortalama zamanı hesaplamak (yani, süresi / sıçan her 5 sn 8 çalışmaların ortalama). Ortalama kontrol ve 5 günlük oturumlar her biri için deneysel değerleri (Şekil 3A bakınız) öneririz.
    1. Yukarıdaki 5 saniye ışık yılı için belirlenen aynı hesaplama ile 5 davranışsal oturumları arasında gıda ödül (5 sn çağı) teslimi sırasında gıda fincan davranışını karşılaştırarak gıda ödül elde etmek için farelerin motivasyonunu analiz edin. Bu değerler, görsel uyaranın sunumu sırasında edinilen daha tutarlı yüksek olacaktır (Şekil 3B).
  3. Test oturumu için: pres yanıt farelerin yiyecek fincan davranışını açıklayan bir ayrımcılık oranını hesaplamakHer işitsel uyaran entations.
    1. Özellikle, her sıçan için, 6 sunumlar her Aşağıdaki gıda fincan harcanan ortalama süre toplamına duyusal koşullanan uyaran 6 sunumlar (yani, sesi) her Aşağıdaki gıda fincan harcanan ortalama süre bölmek duyusal ön şartlandırılmış uyaran (örneğin, ton uyaran) artı eşleştirilmemiş uyaran (yani, beyaz gürültü uyarıcı) 6 sunumlar her Aşağıdaki gıda fincan harcanan toplam süre ortalama. Her dönem süresi 10 saniyedir.
      Not: 0.5 veya daha büyük bir ayrımcılık puanı sıçan duyusal önkoşullanma paradigma doğasında dernekleri öğrendiğini göstermektedir.

AAV Yerleştirme ve İfade 7. Doğrulama

  1. Uyutmak ve transcardially% 4 paraformaldehid kullanarak sıçan serpmek. Nedeniyle floresan etiketlerin kullanılması, min 2 saat bir post-fiksasyon süresini aşmamakhadde indirgenmesi kaybı antijenisite ve flüoresan sinyal korumak için.
  2. 2 günlük bir minimum ya da beyin, beyin kavanozun dibine batar dek fosfat tamponlu tuzlu su (1x) ve% 20 sukroz çözeltisi 30 ml ihtiva eden bir beyin kavanoz içine aktarılması ile perfüze beyinleri kurutmak.
  3. Ilgili bölgenin tamamını rostro tamamı boyunca koronal beyin kesitleri (20-40 um) yapmak için, bir donma kayar mikrotom kullanın.
  4. Tasarımcı reseptörü ve / veya muhabir 12 konumunu ve ifadesini anlamak için etiketli reseptör veya raportör proteine ​​yönelik immunhistokimya yürütün. Bir immünohistokimya boyama protokolü DREADD wiki kaynak sayfa 25 sağlanır.
  5. Sulu montaj orta 100-200 ul kullanarak SuperFrost-artı slaytlar ve lamel üzerine bölümleri monte edin.
  6. AAV yerleştirme ve protein ifadesini 12,24 doğrulamak için beyin dokusu üzerinde floresan mikroskobu gerçekleştirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Davranış Sonuçlar

Deneyin tamamlanması üzerine, bölgeye özgü geçici inaktive etkinliği nicel ve nitel olarak değerlendirilmelidir. Mevcut örnek CNO RSC nötr uyarıcılara 12 arasında dernek oluşumu için gerekli olan hipotezini test etmek Preconditioning oturumları sırasında RSC nöral aktiviteyi azaltmak için uygulanan edildiği bir 3 fazlı davranışsal paradigma (duyusal önşartlama), içerir. Önemli olarak, deneyi davranış paradigma ya farmakogenetik yaklaşım en davranışsal modeller ile b...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, belirli bir beyin bölgesi çok fazlı karmaşık öğrenme görevi nasıl katkıda araştırmak için bir farmakogenetik yaklaşım (DREADD) uygulamak açıklamaktadır. Geçici ve uzaktan öğrenme aşamalarında farklı beyin bölgelerinde nöral aktiviteyi susturmak için yeteneği ile, yaklaşımların bu kombinasyon öğrenmenin daha nüanslı ve maskeli formları dahil olmak üzere davranışları geniş bir yelpazede, araştırmak için bir platform sağlar. Bu protokol açıklanan örnekte, retrosplenial korteks (RSC) tasarımcı reseptörü ifade s...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz bu protokol kısmen türediği yazının katkılarından dolayı Robinson ve ark., 12 yazarları teşekkür ederim.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Erkek, Uzun Evans Sıçanları, 55-60 günlükHilltop Lab Animals Inc
rAAV8/hSyn-HA-hM4D(Gi)-IRES-mCitrineVirüsü Vektör ÇekirdeğiDikkat: Bu bir BSL-1 bileşiği
rAAV8/hSyn-GFPVirüs Vektör ÇekirdeğidirDikkat: Bu bir BSL-1 bileşiği
Klozapin-N-oksitR& D Systems4936-10Tasarımcı ilaç
Sıçan Kafesi kapağı (polikarbonat)Alternatif Tasarım FT 8XL-PCİnfüzyondan 48-72 saat sonra hayvan kafeslerini örtmek için kullanılır
Filtre kağıdı (değiştirme)Alternatif TasarımFP-R-1018XADKafes kapaklarıyla birlikte gelen filtre kağıdı
Masa üstü mengeneJETS2201-265AAV içeren mikrosantrifüj tüplerini davlumbazda tutmak için
Biyolojik tehlike çöp torbalarıZımbalar113444Medline biyolojik tehlike gömlekleri
Biyolojik tehlike çöp kutusuUnited Solutions 34 galonluk dikdörtgen tekerlekli çöp tenekesi, kanca ve kilit saplı
Isoflurane, 100 mlPatterson Veteriner Malzemeleri A.Ş.07-890-8540Anestezik
Dijital ekranlı çift küçük hayvan stereotaksik okuma konsoluDavid KopfModel 942Cerrahi ekipman
Yırtılmayan kulak çubukları, 2'li set (sıçan)David KopfModel 955Cerrahi ekipman
Anestezi maskesi (sıçan)David KopfModel 906Cerrahi ekipman
Yüksek hızlı stereotaksik matkap, masa üstü motor kontrolörü, ayak pedalı, el aleti, stereotaksik başlık tutucusu içerirDavid KopfModel 1474Cerrahi ekipman
Mikro matkap çapakları, 0,9 mmFine Science Tools Inc19007-09Cerrahi malzeme
Micro4 denetleyicili otomatik şırınga pompasıDavid KopfModel UMP3-1Cerrahi ekipman
Pro-animal çıkarılabilir seramik bıçak kesme kitiAhdis21420Cerrahi malzeme
Betadine cilt temizleyiciPerdue Products L.P67618-149-04Cerrahi malzeme
Üçlü antibiyotik merhemMedline Supply53329-087-01Cerrahi malzeme
Puralube veteriner merhemSadece Veteriner Kaynağı17033-211-38Cerrahi malzeme
Dino-liteMikroskopAD7013MTLGeleneksel diseksiyon kapsamına bir alternatif
Dino-lite sert masa üstü bom standıMikroskopMS36BCerrahi ekipman
28 G 10 & mu; l şırıngaHamilton80308-701SNCerrahi ekipman
Ekstra uzun MDF ses azaltma kabiniMed Associates, IncENV-018MD22 'G x 22" Y x 16 " D
Ekstra uzun modüler test odasıMed Associates, IncENV-007Davranışsal ekipman
Paslanmaz çelik ızgara zeminMed Associates, IncENV-005Davranışsal ekipman
Ev ışığıMed Associates, IncENV-215MEv ışığı ve uyaran ışığı olarak kullanılır
Modüler pelet dağıtıcıMed Associates, IncENV-203M-45Davranışsal ekipman
Pelet haznesi, fincan tipiMed Associates, IncENV-200R1MDavranışsal ekipman
Sıçan Med Associates, Inciçin kafa giriş dedektörüENV-254-CBDavranışsal ekipman
Tozsuz hassas gıda peletleri, 45 mgBio-ServF0165Davranışsal tedarik
Sıçan odası için kafes hoparlörüMed Associates, IncENV-224AMDavranışsal ekipman
Programlanabilir ses üreteciMed Associates, IncANL-926Davranışsal ekipman
Akıllı ctrl 8 giriş/16 çıkış paketiMed Associates, IncDIG-716P2Davranışsal ekipman
Büyük masa üstü dolap ve güç kaynağıMed Associates, IncSG-6510DDavranışsal ekipman
PCI arayüz paketiMed Associates, IncDIG-700P2-R2Davranışsal ekipman
MED X Pro 19" monitörlü Intel çekirdek bilgisayar paketiMed Associates, IncCOM-103VDavranışsal ekipman
Paraformaldehit (granül), 1 kgElektron Mikrosopisi Bilimler19210Tehlike: kanserojen, davlumbazda tartın
Tavşan monoklonal antikoru (HA-Tag)Hücre Sinyalleme Teknolojileri3724SHistoloji reaktifi
XP Tavşan monoklonal antikoru (GFP)Hücre Sinyalizasyon Teknolojileri2956SHistoloji reaktifi
Anti-tavşan IgGHücre Sinyalizasyon Teknolojileri4412SHistology,
Superfrost artı slaytlar sağlarVWR uluslararası483111-703Histoloji malzemeleri
Amazon.com

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G-protein coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (12), 5163-5168 (2007).
  2. Urban, D. J., Roth, B. L. DREADDs (Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs): Chemogenetic tools with therapeutic utility. Annu. Rev. Pharmacol.Toxicol. 55, 399-417 (2015).
  3. Weiner, D. M. The role of M1 muscarinic receptor agonism of N-desmethylclozapine in the unique clinical effects of clozapine. Psychopharm. (Berl. 177 (1-2), 1-2 (2004).
  4. Cohen, N. J., Memory Eichenbaum, H. amnesia and the hippocampal system. , MIT Press. Cambridge, MA. (1993).
  5. Strien, N. M., Cappaert, N. L., Witter, M. P. The anatomy of memory: an interactive overview of the parahippocampal-hippocampal network). Nat. Rev. Neurosci. 10 (4), 272-282 (2009).
  6. Agster, K. L., Burwell, R. D. Cortical efferents of the perirhinal, postrhinal and entorhinal cortices of the rat. Hippocampus. 19 (12), 1159-1186 (2009).
  7. Aggleton, J. P. Multiple anatomical systems embedded within the primate medial temporal lobe: implications for hippocampal function. Neurosci. Biobehav. Rev. 36, 1579-1596 (2012).
  8. Robinson, S., Poorman, C. E., Marder, T. J., Bucci, D. J. Identification of functional circuitry between retrosplenial and postrhinal cortices during fear conditioning. J. Neurosci. 32 (35), 12076-12086 (2012).
  9. Bucci, D. J., Saddoris, M. P., Burwell, R. D. Corticohippocampal contributions to spatial and contextual learning. J. Neurosci. 24 (15), 3826-3836 (2004).
  10. Kaut, K. P., Bunsey, M. D. The effects of lesions to the rat hippocampus or rhinal cortex on olfactory and spatial memory: retrograde and anterograde findings. Cogn. Affect. Behav. Neurosci. 1 (3), 270-286 (2001).
  11. Brogden, W. J. Sensory preconditioning. J. Exp. Psychol. 25, 323-332 (1939).
  12. Robinson, S. Chemogenetic silencing of neurons in retrosplenial cortex disrupts sensory preconditioning. J. Neurosci. 34 (33), 10982-10988 (2014).
  13. NIH guidelines for research involving recombinant or synthetic nucleic acid molecules. Available from: http://oba.od.nih.gov/rdna/nih_guidelines_oba.html. , (2013).
  14. Samulski, R. J., Muzyczka, N. AAV-mediated gene therapy for research and therapeutic purposes. Annu. Rev. Virol. 1, 427-451 (2014).
  15. Tenenbaum, L., Lehtonen, E., Monahan, P. E. Evaluation of risks related to the use of adeno-associated virus-based vectors. Gene Ther. 3, 545-565 (2003).
  16. Arechavaleta-Velasco, F., Ma, Y., Zhang, J., McGrath, C. M., Parry, S. Adeno-associated virus-2 (AAV-2) causes trophoblast dysfunction, and placental AAV-2 infection is associated with preeclampsia. Am J Path. 168 (6), 1951-1959 (2006).
  17. Erles, K., Rohde, V., Thaele, M., Roth, S., Edler, L., Schlehofer, J. R. DNA of adeno-associated virus (AAV) in testicular tissue and in abnormal semen samples. Hum. Reprod. 16 (11), 2333-2337 (2001).
  18. Donsante, A. AAV vector integration sites in mouse hepatocellular carcinoma. Science. 317 (5837), 477-47 (2007).
  19. Donsante, A. Observed incidence of tumorigenesis in long-term rodent studies of rAAV vectors. Gene Ther. 8 (17), 1343-1346 (2001).
  20. Wu, K. Enhanced expression of Pctk1, Tcf12 and Ccnd in hippocampus of rats: impact on cognitive function, synaptic plasticity and. 97 (1), 69-80 (2011).
  21. National Academy Press. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. National Academy Press. , Washington, DC. (1996).
  22. Lowery, R. L., Majewska, A. K. Intracranial injection of adeno-associated viral vectors. J. Vis. Exp. (45), (2010).
  23. Cavaletti, G. Effect in the peripheral nervous system of systemically administered dimethylsulfoxide in the rat: a neurophysiological and pathological. 119 (1-2), 1-2 (2000).
  24. Parnaudeau, S., et al. Mediodorsal thalamus hypofunction impairs flexible goal-directed behavior. Biol. Psychiatry. 77 (5), 445-453 (2014).
  25. wiki, D. R. E. A. D. D. , Available from: http://www.dreadd.org (2014).
  26. Ferguson, S. M., Phillips, P. E. M., Roth, B. L., Wess, J., Neumaier, J. F. Direct-pathway striatal neurons regulate the retention of decision-making strategies. J. Neurosci. 33 (28), 11668-11676 (2013).
  27. Cassatarro, D. Reverse pharmacogenetic modulation of the nucleus accumbens reduces ethanol consumption in a limited access paradigm. Neuropsychopharm. 39, 283-290 (2014).
  28. Krashes, M. J., Shah, B. P., Koda, S., Lowell, B. B. Rapid versus delayed stimulation of feeding by the endogenously released AgRP neuron mediators. GABA, NPY and AgRP. Cell Metab. 18 (4), 588-595 (2014).
  29. Gage, F. H., Bjorklund, A., Stenevi, U., Dunnett, S. B. Functional correlates of compensatory collateral sprouting by aminergic and cholinergic afferents in the hippocampal formation. Brain Res. 268 (1), 39-47 (1983).
  30. Nelson, R. J., Young, K. A. Behavior in mice with targeted disruption of single genes. Neurosci. Biobehav. Rev. 22 (3), 453-462 (1998).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Tasar m Resept rlerKemogenetik SusturmaDuyusal nko ulland rmaViral Arac l letimKlozapin N Oksitmm nofloresan MikroskopiStereotaksik nf zyonDavran sal N robilimN ral Aktivite SusturmaAdeno li kili Vir s

İlgili makaleler