Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Bütünleşmeyen episomal plasmidler kullanılarak dondurulmuş Buffy tüylerdeki uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

12.8K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/52885

⸱

5 Haziran 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Biomedicine, European Academy Bozen/Bolzano (EURAC), 2Laboratory of Medical Genetics, Fondazione IRCCS Ca´ Granda, Ospedale Maggiore Policlinico, 3Del E. Webb Center for Neuroscience, Aging & Stem Cell Research, Sanford-Burnham Medical Research Institute

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs), klinik uygulamalar ve temel araştırma için hastaya özgü dokuların bir kaynağı temsil eder. Burada, non-entegre epizomal plasmidleri kullanılarak viral içermeyen iPSCs içine donmuş buffy kat elde edilen insan periferal kan mononükleer hücreleri (PBMNCs) yeniden programlamak için detaylı bir protokol mevcut.

Özet

Somatik hücreler, dört transkripsiyon faktörlerinin (Ekim-4, Sox-2, Klf-4 ve c-myc) ekspresyonunu zorlayarak uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs) içine yeniden olabilir, tipik olarak insan embriyonik kök hücreleri tarafından (hESC) olarak ifade . Nedeniyle hESC ile benzerliği, iPSCs hESC ile ilgili etik sorunlar kaçınarak, olası hastaya özgü rejeneratif tıp için önemli bir araç haline gelmiştir. Klinik uygulamalar için, uygun hücreler elde etmek için, transgen içermeyen iPSCs transgen reaktivasyonu, değiştirilmiş gen ekspresyonunu ve yanlış farklılaşmasını önlemek için söz konusu olacaktır. Ayrıca, yüksek ölçüde verimli ve pahalı olmayan bir yeniden programlama yöntemi, terapötik amaçlar için yeterli iPSCs elde etmek gereklidir. Bu ihtiyacı göz önüne alındığında, etkin bir sivil entegre episomal plazmid yaklaşımı iPSC türetme tercih seçimdir. Şu anda yeniden programlama amaçlı kullanılan en yaygın hücre tipi fibroblastlar vardır, izolasyon hangi bir i doku biyopsisi gerektirirhasta için nvasive cerrahi prosedür. Bu nedenle, insan periferik kan iPSC nesil için en erişilebilir ve en az invaziv doku temsil eder.

Bu çalışmada, bütünleşmeyen epizomal plasmidleri kullanılarak uygun maliyetli ve viral içermeyen protokolü tam kan, santrifüj işleminden sonra ve yoğunluk dereceli ayırma olmadan dondurulmuştur buffy kat elde edilen insan periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMNCs) için iPSCs üretilmesi için rapor edilir.

Giriş

2006 yılında, Shinya Yamanaka 1 grubu, yetişkin farelerde ve insanlarda somatik hücreler, dört yeniden programlama faktörleri (Ekim-4, Sox-2, Klf-4 ve ektopik ekspresyonu ile pluripotent haline dönüştürülebilir ilk defa burada gösterilmektedir c-myc), sözde uyarılmış pluripotent kök hücrelerin (iPSCs) 2 üretilmesi. Hastaya özgü iPSCs yakından morfoloji, çoğalması ve üç germ hücre tipleri (mezoderm, endoderm ve ektoderm) içine ayırt etmek için yeteneği bakımından insan embriyonik kök hücreleri (hESC) benzer hESC ve baypas kullanımına bağlı etik kaygıları eksik ise olası bağışıklık reddi 3. Böylece, iPSCs temel araştırma, ilaç tarama, hastalık modelleme, toksisite değerlendirilmesi ve rejeneratif tıp amaçlı 4 hasta-spesifik hücrelerin en önemli kaynaklarından biri olarak görünür.

Çeşitli yaklaşımlar iPSC üretimi için kullanılmıştır: Viral entegre vektörler(Retrovirüs 5, lentivirüs 6), viral olmayan entegre vektörleri (adenovirüs 7), Sendai-virüs 8, BAC transposonlar 9, epizomal vektörleri 10, proteinler 11 veya RNA teslim 12. Virüs aracılı yöntemleri kullanımı yüksek verimlilik yeniden programlama neden olabilir, ancak, viral vektörler, konak hücreler ve bu nedenle, potansiyel rastgele girmeyle mutagenez genomu içine entegre, farklılaşması sırasında gen ekspresyonu ve susturulması transgenlerin yeniden aktive kalıcı değişiklik 13 göz ardı edilemez.

Rejeneratif tıp iPSCs daha güvenli hale getirmek için, çaba hücre genomlarına ekzojen DNA'nın entegrasyonu olmadan iPSCs elde etmek için yapılmıştır. Vergiye tabi viral vektörler ve transposonlar geliştirilmiş olmasına rağmen, bu kaçınılmaz olarak kesilip çıkarılmasından sonra dönüştürülmüş hücreler kalır ve ifade transposaz kısa vektör sekansları, hücre içinde değişikliğe sebep olup olmadığı hala belirsizular 13 işlev. Yüksek yeniden programlama verimliliği rağmen, Sendai virüsü translasyonel çalışmalarda uygulanmasını sınırlamak potansiyeline sahip bu sistem geliştirdi şirket ile pahalı bir yaklaşım ve ulaşmak geçiş lisans kaygıları temsil etmektedir. Ayrıca, protein ve RNA doğrudan sokulması için bir ihtiyaç bu getirmektedir içsel teknik sınırlamalar molekülleri yeniden programlanması birden fazla teslimat gerektirir ve genel olarak yeniden programlama verimi 14 çok düşüktür. Dikkat çekici bir şekilde, epizomal plasmidlerin kullanımı göre düşük maliyetli bir viral ve serbest olmayan entegre yöntem başarılı bir şekilde deri fibroblastları 15 yeniden programlama için rapor edilmiştir. Daha önce 10,15 bildirdiği gibi Özellikle, mevcut çalışmada biz, ticari mevcut entegrasyon serbest episomal plasmidlerini kullanmaya karar verdi.

Bugüne kadar, cilt fibroblastlar en popüler donör hücre tipi 5 temsil etmektedir. Bununla birlikte, diğer hücre kaynakları başarı olmuştursfully keratinositler 16, kemik iliği mezenkimal kök hücrelerin 17, adipoz stromal hücreler 18 olmak üzere iPSCs içine yeniden programlanması, saç folikülleri 19 ve dental pulpa hücreleri 20. Bu hücrelerin izolasyonu cerrahi prosedürler gerektiren ve birkaç hafta birincil hücre kültürünün oluşturulması için in vitro hücre genişlemesi için ihtiyaç vardır.

Bu ışığında, hücre tipi başlangıç ​​seçimi kritiktir ve kan gibi kolay erişilebilir ve daha az invazif dokulardan iPSCs üretebilmek için aynı derecede önemlidir. Her iki kordon kan tek-çekirdekli hücreleri (CBMNCs) 21,22 ve periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMNCs) 14,22-24 iPSCs türetilmesi için hücrelerin uygun bir kaynağıdır.

Yetişkin PBMNC yeniden programlama verimliliği CBMNCs 22 daha 20-50 kat daha düşüktür rağmen, örnekleme amacıyla en uygun hücre tipi kalır. IçindeAslında, PBMNC numune minimal invaziv olma avantajına sahiptir, ve buna ek olarak, bu hücrelerin yeniden programlama deneyleri daha önce in vitro olarak geniş bir genişleme gerekli değildir. Bugüne kadar, farklı protokoller yoğunluk gradyan ayrıldıktan sonra PBMNCs dondurulup çözülmüş gün birkaç aya kadar dondurma sonra iPSCs 22,23 içine yeniden programlama birkaç gün önce genişletilebilir bildirmiştir. Bununla birlikte, kadarıyla biz hiçbir rapor dondurulmuş buffy kat gelen PBMNCs yeniden programlamayı tarif var farkında olarak. Önemlisi, yoğunluk gradyan ayırımı olmaksızın toplanan dondurulmuş buffy mantolar böylece daha örnek toplama önler iPSC üretimi için malzeme kolay ulaşılabilir bir havuz temsil nüfus çalışmalardan elde büyük ölçekli biyobankalar saklanan en sık kan örnekleri temsil etmektedir.

Burada biz, daha önce tanımlanmış olan protokole göre 22 insan dondurulmuş buffy kat ilk defa virüs içermeyen iPSCs üretilmesini rapor etmektedir. IçindeAyrıca, iPSCs olmayan yoğunluk gradyanı saflaştınldı PBMNC sonuçlar için bir kontrol protokolü olarak, yoğunluk gradyanı ayrıldıktan sonra elde edilen dondurulmuş PBMNCs elde edildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Periferik kan mononükleer hücreleri (PBMNCs) sonra bilgilendirilmiş onam ve Güney Tirol Eyaleti Etik Kurul onayı imzalı sağlıklı donörlerin insan periferik kan örneklerinden izole edilmiştir. Deneyler Helsinki Bildirgesi ifade esaslar doğrultusunda yapılmıştır. Tüm veriler toplanmış ve anonim analiz edildi.

Çevresel Kan Tek Çekirdekli Hücrelerin İzolasyonu 1. (PBMNCs)

  1. PBMNCs yoğunluk gradyan separasyonu olmaksızın, tam kan, santrifüj işleminden sonra ince beyaz kat elde edilen.
    1. Sodyum sitrat içine venöz periferal kan 8 mL kan, oda sıcaklığında (25 ° C) 'de plastik boru ve mağaza tamponlu. Toplandıktan sonra 12 saat içinde Süreç kan.
    2. Kapatıldıktan santrifüj fren, bir sallanan kepçeli rotor içinde 4 ° C'de 15 dakika boyunca 2000 x g'de tüp santrifüjleyin.
    3. Bulutlu buffy coat (üst plazma fazı ve alt arasındaki katmanı toplayınFaz kriyotüpe tüp içine zenginleştirilmiş PBMNC kısmını (500 ul) ihtiva eden), eritrositlerin en ihtiva etmektedir.
    4. % 10 DMSO konsantrasyonu ile 1 ml 'lik bir toplam hacim elde etmek üzere% 90 FBS ve% 20 DMSO içeren 2x dondurma ortamı içinde 500 ul buffy coat 500 ul yeniden süspanse edin.
    5. -80 ° C'de, bir hız denetimli dondurma kapta şişeyi dondurun. Daha uzun süreler boyunca sıvı azot içinde mağazası hücreleri.
  2. PBMNCs yoğunluk gradyan ayırma sonrası elde edilen
    1. Sodyum sitrat içine venöz periferal kan 12 ml toplamak oda sıcaklığında plastik tüp, ve mağaza tamponlu. Toplandıktan sonra 12 saat içinde Süreç kan.
    2. 35 ml'lik bir son hacme kadar steril PBS ile kan seyreltin.
    3. Dikkatli ve yavaş yavaş, katman 50 ml konik bir tüp içinde (yoğunluk gradyan ayırma için kullanılır) polisükroz çözeltisi (p = 1,077), 15 ml seyreltilmiş kan 35 mi (oran 3: 1).
    4. Oda sıcaklığında, 30 dakika içinde 800 xg'de santrifüj tüpüsallanan bir kova rotor, anahtarlama-off santrifüj frenler.
    5. Üst, sarı faz içeren plazma aspire ve atın. Dikkatle, yeni 50 ml konik tüp PBMNCs içeren opak beyaz interfaz katmanı aktarın.
    6. Steril PBS ile 30 ml toplam hacmi getirmek ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj.
    7. Süpernatantı atın ve PBS 30 ml hücreleri tekrar süspansiyon. Tripan mavi eksklüzyonu ile 25 göre canlı hücre sayısı, saymak.
    8. Santrifüj PBMNCs oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g'de, süpernatan aspire ve atın.
    9. 5 x 10 6 hücre / ml'lik bir konsantrasyon elde etmek üzere,% 90 FBS ve% 10 DMSO ihtiva eden dondurma ortamına uygun bir miktarda hücre pelletini.
    10. Kısım başına 1 ml'lik şişe (5 x 10 6 hücre / ml) ve en kabı dondurma hız denetimli bir flakon dondurma - 80 ° C. Daha uzun süreler boyunca sıvı azot içinde mağazası hücreleri.

2. Çözülme ve PBMNCs ve Kaplama (GÜN 0)

  1. PBMNCs yoğunluk gradyan separasyonu olmaksızın, tam kan, santrifüj işleminden sonra ince beyaz kat elde edilen.
    1. Dondurulmuş buffy kat arasında PBMNCs kullanarak protokolü başlatmak için 37 ° C'de bir su banyosu içinde hücreleri 1 şişe çözülme ve 2 ml nihai hacme kadar steril PBS ile buffy coat seyreltin.
    2. 50 ml konik bir tüp içinde seyreltildi buffy coat transfer kırmızı hücre lisis tampon maddesi, 10 ml ilave edilir ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edilir.
    3. Kırmızı hücre lisis tampon 500 ml hazırlanması potasyum bikarbonat, 0.5 g amonyum klorür 4,145 g, ultra saf su, 500 ml, pH 7.2-7.4, 0.5 M EDTA çözeltisi 100 ul ekleyin.
    4. Steril PBS ile 50 ml toplam hacmi getirmek ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj.
    5. Süpernatant atılır ve steril 50 ml PBS ile pelet yıkama, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g'de buffy coat santrifüj.
    6. Hücrelerin yeniden süspanseIMDM ve Ham F-12 (oran 1: 1), İnsülin-Transferrin-Selenyum-etanolamin (ITS-X), kimyasal olarak% 1,% 1 Tanımlı lipid Konsantre PBMNC ortamın 1 mi, daha önce oluşan, 22 tarif edilen (KTL),% 1 Penisilin / Streptomisin, L-askorbik asit,% 0.005, Sığır Serum Albümini (BSA)% 0.5, 1-Tiogliserol (nihai konsantrasyon 200 uM), Hücre Faktörü SCF (100 ng / ml) ile kök, İnterlökin -3, IL-3 (10 ng / ml), Eritropoietin (EPO 2 U / ml), insülin-benzeri büyüme faktörü, IGF-1 (40 ng / ml), deksametazon (1 uM) ve holo-transferrin (100 ug / ml ).
    7. 2 x 10 6 hücre / ml'lik bir yoğunlukta, kaplama olmayan, standart doku kültürü tedavi yüzeyi olan bir 12-yuvalı plakanın bir kuyunun içine aktarın. Orta değiştirme aşamasına kadar (bakınız Bölüm 3), 37 ° C'de, 48 saat boyunca nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde% 5 CO2 ile inkübe hücreleri.
  2. PBMNCs yoğunluk gradyan ayırma sonrası elde edilen
    1. Sonra donmuş PBMNCs kullanarak protokolü başlatmak içinyoğunluk gradyanlı ayrıştırma, çözülme 37 ° C'de bir su banyosu içinde hücreleri 1 şişe, PBMNC ortamın 5 ml hücre transfer edin. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin.
    2. PBMNC ortam 1 ​​ml hücrelerin yeniden süspanse edin ve 2 x 10 6 hücre / ml'lik bir yoğunlukta bir 12-yuvalı plakanın bir kuyunun içine aktarın. Orta değiştirme aşamasına kadar (bakınız Bölüm 3), 37 ° C'de, 48 saat boyunca nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde% 5 CO2 ile inkübe hücreleri.

3. Kültür ve PBMNCs genişletilmesi (GÜN 2-13)

  1. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g'de 15 ml konik bir tüp ve santrifüj, 1 ml ucu olan bir pipet kullanılarak, süspansiyon kültüründe PBMNCs toplayın.
  2. Süpernatantı atın ve taze PBMNC orta 1 ml hücreleri tekrar süspansiyon.
  3. Kaplama olmadan, standart doku kültürü muamele edilmiş yüzey ile 12 oyuklu plaka 1 kuyuya hücreleri aktarın ve nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de,% 5 CO2 inkübe.
    4. iki günde bu adımları yineleyin ve oranı 1 hücreleri bölmek.

Episomal plasmidler ile PBMNCs 4. transfeksiyonu (14. GÜN)

Not: Dört ticari intergation içermeyen epizomal plasmidlerin izole gerçekleştirme plazmid arıtma için bir ticari kit kullanılarak pluripotense genleri taşıyan bir agaroz jel analizi kullanılarak saflaştırılmış plasmidler kalitesini değerlendirmek, üreticinin talimatlarına göre yöntem.

  1. 15 ml konik bir tüp içinde PBMNCs toplamak ve 25 (tripan mavi dışlama bazında) canlı hücre sayısı.
  2. Santrifüj oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g'de 2 x 10 6 hücre.
  3. 100 Tekrar süspansiyona, Tampon T ul ve her bir plazmid DNA 1 ug ihtiva eden transfeksiyon karışımı içinde süspanse 2 x 10 6 hücre (p53 karşı Zeiss OCT3 / 4 ve shRNA taşıyan bir plazmid, bir plazmid taşıyan ve Sox2 Klf4, tek birplazmid L-MYC ve LIN28 taşıyan ve bir plazmid) transfeksiyon verimini kontrol etmek, EGFP taşıyan.
  4. Üreticinin talimatlarına uygun olarak, bir 100 ul ucu içine hücreleri ihtiva eden transfeksiyon karışımı aspire ve elektroporasyon makinesi pipet istasyonuna yerleştirilen Elektrolitik Tampon E2 3 ml ile doldurulmuş tüp içine dikey olarak örnek, pipet yerleştirin.
  5. Aşağıdaki programı kullanarak Verimli electroporate hücreler: 1.650 V, 10 msn, 3 bakliyat.
  6. 0.25 mM sodyum bütirat (NaB) ekleyerek önceden ısıtılmış PBMNC ortamının 2 ml Elektroporasyona tabi tutulan hücreler (2 x 10 6 hücre) yeniden süspanse edin ve 25 (tripan mavi dışlama bazında) elektroporasyon protokolü sonra yaşayan hücrelerin sayısını.
  7. Kaplama olmadan 6 oyuklu plakanın bir oyuğuna transfer hücreleri hafifçe plaka kaya ve nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de,% 5 CO2 inkübe hücreleri.
  8. elektroporasyon, ülkeleri gün sonratransfeksiyon etkinliğini değerlendirmek için, 8-10 rastgele alanlardan floresan mikroskobu altında GFP-pozitif hücrelerin sayısını t.
  9. MEF'ler (Bölüm 6) bunları kaplama kadar 3 gün boyunca bölme olmadan transfekte hücreleri korumak.
  10. Taze PBMNCs ortam 2 ml artı 0.25 mM NaB her iki günde bir değiştirin.

5. Ortak kültür için Besleyici-hücreleri ile Yemekleri hazırlayın (GÜN 16)

  1. Ceket 15 dakika boyunca bazal membran matrisi, 1 ml olan bir 6-yuvalı plakanın yuvalarına 37 ° C'de ve FBS ihtiva 2 ml% 10 ile / oyuk 2 x 10 5 hücre yoğunluğunda fare embriyonik fibroblastlar (MEF'ler) plaka DMEM (MEF ortamı) MEF besleyici hücreleri üzerine elektropore PBMNCs Pasajlanması bir gün önce.

MEF'ler üzerine 6. Kaplama transfekte PBMNCs (GÜN 17-19)

  1. 10 dakika boyunca 300 x g'de 15 ml konik bir tüp santrifüj transfekte PBMNCs olarak 1 mi ucu olan bir pipet kullanılarak, süspansiyon kültüründe PBMNCs toplamakoda sıcaklığında karıştırıldı.
  2. MM NAB Süpernatantı atın ve taze PBMNC orta 2 ml pelletini artı 0,25.
  3. MEF kaplı 6 iyi levha üzerine, hücreler plaka ve nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de,% 5 CO2 inkübe hücreleri.
  4. İki gün sonra, ortam aspire ve DMEM (KO-DMEM),% 20 KO-serum Değiştirilmesi (KOSR), 1 mM NEAAs,% 1 Penisilin / Streptomisin, 20 mM nakavt oluşan iPSC ortam, 2 ml ile değiştirin L- Glutamin, 0.1 mM β-merkaptoetanol, 10 ng / ml FGF (temel bFGF) ve 0.25 mM NaB.
  5. Taze iPSC orta 2 ml her gün değiştirin ve günlük hücreleri kontrol ediniz.
    Not: yaklaşık günde 22-25 anda, iPSCs ilk kolonileri görünür olmalıdır.

7. Toplama ve uyarılmış pluripotent kök hücrelerin Genişleme (iPSCs) klonlar (GÜN 30-35)

Not: transfeksiyondan sonra yaklaşık 30-35 gün sonra, iPSC kolonileri toplama ve şarjı için hazır olmalıdır. yeniden programlama verimliliği esti olmalıdırDaha önce rapor edildiği gibi 26, iPSC koloni / elektroporate edilmiş hücrelerde toplam sayısı sayısının yüzdesi olarak şeklindeki.

  1. iPSC koloniler pasaj bir gün önce, 12 oyuklu plaka (1.25 x 10 5 hücre / oyuk) MEF besleyici hazırlar.
  2. Aspire MEF orta ve 10 ng / ml bFGF ve 10 uM Y-27632 ile birlikte iPSC ortamı 1 mL değiştirin. El, bir ızgara elde etmek için çekme başlığı içinde mikroskop altında her seferinde bir iğne, bir koloni ile incelemek pipetleme küçük kümeleri toplamak ve MEF'ler ile kaplanmış 12-yuvalı plakanın bir kuyuya her biri tek tek aktarın.
  3. Daha fazla yayılması için 4: 1 oranında daha sonra, 2 adet 6-çukurlu plaka: Geçiş oranı 1, 6 gözlü bir plakanın her bir 12-çukurlu plaka genişletmek. Incelemek ve daha sonra bir enzim ayrışma yordamı kullanın (as iyice aşama 7.2 tarif edilmiştir) ilk 2-3 geçişleri için elle iPSCs genişletin (adım 7.4 başlayarak).
  4. Bir enzim ayrışma protokolü için, temiz iPSC kolonitoplama-kaput diseksiyon mikroskop altında, farklılaştırılmış bölümlerini aspire es.
  5. 37 ° C'de 10 dakika boyunca kolajenaz IV, 1 ml (1 mg / ml) ile iPSCs inkübe edin.
  6. Enzim çözeltisi aspire KO-DMEM, 1 ml hücre yıkayın ve 15 ml konik bir tüp içinde koloniler toplanır. Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 100 x g'de santrifüjleyin.
  7. Süpernatanı havalandırın, MEF-kaplı 6 çukurlu bir levha üzerinde 10 ng / ml bFGF ve 10 uM Y-27632 ve bunların plaka iPSC ortamının 2 ml koloniler tekrar süspansiyon (oran 1: 4).

IPSCs 8. Karakterizasyonu (5-15 geçiş arasında)

  1. Alkali Fosfataz Boyama
    1. Kültür 10 ng / ml bFGF ile iPSC ortam içinde 3-5 gün süreyle iPSC kolonileri.
    2. Bir alkalin fosfataz boyama protokolü çalıştırmak için, bir kez PBS ile yıkayın iPSCs ve daha sonra oda sıcaklığında 20 dakika süreyle% 4 PFA 1 ml sabitleyin.
    3. Artık PFA kaldırmak için, PBS ile hücreleri üç kez yıkayın.
    4. Kullanarak Leke sabit hücrelerüreticinin talimatlarına göre bir ticari bir alkalin fosfataz boyama kiti.
  2. İmmünofloresan
    1. Kültür 10 ng / ml bFGF ile iPSC ortam içinde 3-5 gün süreyle iPSC kolonileri.
    2. Bir imüno-deneyi başlatmak için, bir kez PBS ile yıkayın iPSCs ve daha sonra oda sıcaklığında 20 dakika süreyle% 4 PFA 1 ml sabitleyin.
    3. Artık PFA kaldırmak için, PBS ile hücreleri üç kez yıkayın.
    4. Oda sıcaklığında 1 saat süreyle% 4 keçi serumu,% 0.1 BSA,% 0.1 Triton X-100 ve% 0.05 sodyum azit ihtiva eden bloke etme çözeltisi Permeabilization 1 ml / (NaN3) ile sabitlenmiş iPSCs tedavi edin.
    5. Bloke solüsyonu aspire edildi ve 4 ° C 'de primer% 3 BSA içinde antikorlar ve% 0.05 NaN3 çözeltisi O / N ile sabitlenmiş hücreler inkübe (birincil antikor listesi için malzeme tabloyu kontrol ve antikor seyreltme faktörü tavsiye edilir).
    6. Ertesi gün, Alexa Fluor 488 keçi anti-fare ve Alexa Fl hücreleri inkübe PBS ile iPSCs üç defa yıkamak37 ° C'de 1 saat boyunca,% 3 BSA ve% 0.05 NaN3 çözeltisi içinde 1000: u veya 555 keçi anti-tavşan antikorları, 1 seyreltilmiştir.
    7. PBS ile üç kez yıkanır, karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika için DAPI (1 ug / ml) ile çekirdekleri Leke.
  3. Embriyoid Vücudumuzdaki iPSCs Farklılaşma (EBS)
    1. Kültür 10 ng / ml bFGF ile iPSC ortam içinde 5-6 gün süreyle iPSC kolonileri.
    2. Toplama-kaput diseksiyon mikroskobu altında, aspire iPSC kolonilerden farklı bölümlerini çıkarın.
    3. 37 ° C'de 10 dakika boyunca kolajenaz IV, 1 ml (1 mg / ml) ile iPSCs inkübe edin.
    4. Enzim çözeltisi aspire KO-DMEM, 1 ml hücre yıkayın ve 15 ml konik bir tüp içinde koloniler toplanır. Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 100 x g'de santrifüjleyin.
    5. Süpernatant aspire 2 KO-DMEM oluşan EB ortamı mi,% 20 tanımlı sığır fetus serumu (FBS), 1 mM NEAAs,% 1 Penisilin / Streptomisin, 20 mM L-Glutamin, 0.1 mM koloniler tekrar süspansiyon46; p-merkaptoetanol.
    6. Sferoidal üç boyutlu embriyoid organları (EBS) oluşumuna izin vermek için, ultra-düşük bağlanma 6 oyuklu plakalar üzerine 6 gün süspansiyon içinde iPSC kolonileri. Taze EB orta 2 ml her iki günde değiştirin.
    7. 7. günde, EBS toplamak ve EB ortam 2 ml% 0.1 jelatin kaplı 6 oyuklu plakalar üzerine bunları plaka ve 20 gün boyunca farklılaşmasında EBS korumak.
    8. Taze EB orta 2 ml her iki günde değiştirin.
  4. Gen İfadesi Analizi Mah-PCR
    1. Kültür 10 ng / ml bFGF ile iPSC ortam içinde 5-6 gün süreyle iPSC kolonileri.
    2. Üreticinin talimatlarına uygun olarak, ticari reaktif madde 1 ml kullanılarak PBMNCs, iPSCs veya EBS toplam RNA ekstrakte edin.
    3. Örneğin 27 (260 / A 280 ve A 260/230 oranları> 1.8 olan, yüksek kalitede RNA), bir spektrofotometre kullanımı gibi uygun yöntemlerle RNA yoğunluğu ve saflığı, değerlendirir.
    4. KontrolÜreticinin protokolü (yüksek kalitede RNA RQI> 9.5) 28 uygun bir ticari kit kullanılarak RNA bütünlüğü.
    5. Üreticinin talimatlarına göre bir ticari bir ters transkriptaz kiti kullanılarak total RNA'nın 1 | ig bir ters transkripsiyon reaksiyonu gerçekleştirmek.
    6. CDNA, şablon 5 ng, 7.5 ul SYBR Green Supermix, 5 uM primer 2 ul ihtiva eden qPCR karışımları hazırlanması (ileri doğru: 1 ul ve ters: 1 ul) ve her bir tepkime 29 RNaz / DNase içermeyen su 6 ul.
    7. 45, 60 ° C 'de 10 dakika süre ile 95 ° C'de bir ilk denatürasyon adımı, 15 saniye ve primer tavlama ve uzatma aşaması için 95 ° C' de denatürasyon adımı ayrılmıştır 40 döngü ve ardından aşağıdaki programı kullanılarak QRT-PCR gerçekleştirme sn 29.
    8. Ev bakıcısı geni 28 olarak GAPDH kullanan diğer genlerin ekspresyonunu normalize (Tablo 1 'de listelenen primerler bakınız).
  5. QPCRTransgen Dışlama için
    1. 50 mM Tris, 100 mM EDTA, 100 mM NaCI ihtiva eden liziz tamponu için 1 ml kullanılarak PBMNCs ya iPSCs DNA ekstrakte% 1 sodyum dodesil sülfat (SDS) ve 20 ug / ml proteinaz K
    2. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 10,000 x g'de DNA çökeltme ve santrifüj olanak sağlamak amacıyla, üç kez,% 100 izopropanol, eşit bir hacmi (1 mi) ilave çevirerek karıştırın.
    3. Süpernatantı atın oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 10,000 x g'de 70% etanol ve santrifüj 1 ml DNA pelet yıkayın. Aspire ve supernatant atın ve RNaz / DNaz içermeyen su içinde tekrar süspansiyon.
    4. Örneğin 27 (260 / A 280 ve A 260/230 oranları> 1.8 olan, yüksek kalitede RNA), bir spektrofotometre kullanımı gibi uygun yöntemlerle DNA konsantrasyonu ve saflığı değerlendirmek.
    5. (1 ul ve ters: 1 ul ileri) ve 6-DNA örneğinin 5 ng, 7.5 ul SYBR YEŞİL Supermix, 5 mcM primerlerin 2 ul içeren qPCR karışımları hazırlayın# 181; Her reaksiyon 29 RNaz / DNase içermeyen su l.
    6. (Tablo 1 'de listelenen primerler bakınız) ev idaresi genine 29 olarak FBX-15 kullanarak belirli bir epizomal plazmid EBNA-1 geni ifadesini normalize.
  6. Karyotip Analizi
    1. Kültür, imalatçının talimatları izlenerek iPSCs için ticari tanımlandığı gibidir, besleyici içermeyen bakım ortamı ile besleyici içermeyen bazal membran matrisi kaplı plaka üzerine 5-6 gün iPSC kolonileri.
    2. Kromozom analizi protokolü başlatmak için, tek hücreli bir ayrışma elde edilene kadar, 37 ° C'de 5 dakika boyunca, hücre ayırma çözeltisi, 1 ml iPSC kolonileri ayırmak.
    3. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj hücreleri ve toplayın.
    4. Bir ortam 2 ml yeniden süspanse iPSCs özellikle prenatal tanı için hücrelerin kültürlenmesi için geliştirilmiştir. Bazal membran matrisi kaplı cam tabaklar üzerine levhalar tek hücreli iPSCs ve 37 ° C de inkübe% 5 CO2 </ Sub> inkübatör.
    5. 2-4 gün sonra, kültürlere doğrudan 10 ul / ml kolşisin ekleyebilir ve nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de,% 5 CO2 de 3 saat inkübe edilir.
    6. Orta aspire ve oda sıcaklığında 10 dakika hipotonik çözelti (% 0.6 sodyum sitrat ve% 0.13 potasyum klorür) 1 ml iPSCs inkübe edin.
    7. % 5 asetik asit çözeltisi, 1 ml hücre durulayın ve metanol / asetik asit solüsyonu ile iPSCs tamir (oran 3: 1) ile kontrol edilen sıcaklık ve nem içeren bir makine (28 ° C,% 42 bağıl nem).
    8. Daldırın ve karanlıkta, oda sıcaklığında 15-20 dakika boyunca Kinakrin çözeltisi ile leke sabit hücreler 30 (Q-bandı) elde edilmiştir.
    9. 100X büyütme 29, flöresanlı bir mikroskop altında hücre metafaz elde edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu çalışmada, tam kan merkezkaç ve yoğunluk dereceli ayırma bildirilir sonra elde edilen PBMNCs resetleme ile karşılaştırıldığında sonra dondurulmuş buffy kat izole PBMNCs resetleme viral içermeyen iPSCs üretilmesi için basit ve etkin bir protokol. Şekil 1A şematik bir temsilini göstermektedir ayrıntılı bir protokol. Çözündükten sonra, tipik bir yuvarlak şeklini gösteren izole PBMNCs, 14 gün süre ile belirli bir kan kültür ortamı (Şekil 1B) yayılır ve daha sonra epizomal plasmidler ile ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Geçmişte, tek yolu, belirli bir genetik mutasyon taşıyan insan pluripotent kök hücreleri elde etmek için pre-implantasyon genetik tanı geçiren anne işe ve onların atılır blastosist 31,32 embriyonik kök hücreleri oluşturmak oldu. Bir yeniden programlama yaklaşımı kullanarak, araştırmacılar şimdi hemen hemen her genotipi taşıyan hastaların iPSCs üretebilirsiniz. olasılık hastaya özgü hücre hattından başlamak ve hastalıkların patofizyolojisi ve yeni terapötik yaklaşımların sonraki kimlik soruşturma izin verir çü...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Çalışma, Sağlık Bakanlığı ve Eğitim Yardımları Dairesi, Bolzano Özerk Bölgesi Üniversitesi ve Araştırma Dairesi ve Güney Tirol Sparkasse Vakfı tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Sodyum Sitrat tamponlu Venosafe Plastik TüpTerumoVF-054SBCS07
Amodyum klorürSigma-AldrichA9434
Potasyum bikarbonatSigma-Aldrich60339
EDTA disodyum tozuSigma-AldrichE51340.5 M çözelti
Ficoll-Paque Premium GE Healthcare Yaşam Bilimleri17-5442-02Yoğunluk gradyanlı santrifüjleme için polisekroz çözeltisi
Iscove'un modifiye edilmiş Dulbecco's ortamı (IMDM) Gibco21056-023Fenol kırmızı
Jambon F-12Mediatech10-080-CV
İnsülin-Transferrin-Selenyum-Etanolamin (ITS -X)Gibco51500-056 1X (Stok: 100X)
Kimyasal Olarak Tanımlanmış Lipid KonsantresiGibco119050311X (Stok: 100X)
Sığır Serum Albümini (BSA)Sigma-AldrichA9418
L-Askorbik asit 2-fosfat seskimagnezyum tuzu hidratSigma-AldrichA8960
1-TiyogliserolSigma-AldrichM6145200 ve mikroda Nihai Konsantrasyon; M
Rekombinant İnsan Kök Hücre Faktörü (SCF)PeproTech300-07100 ng/ml (Stok:100 & mikro; g/ml) 
Rekombinant İnsan İnterlökin-3 (IL-3)PeproTech200-0310 ng/ml (Stok: 10 & mikro; g/ml)
Rekombinant İnsan İnsülin Benzeri Büyüme Faktörü (IGF-1)PeproTech100-1140 ng/ml (Stok: 40 & mikro; g / ml)
Rekombinant İnsan Eritropoietin (EPO)R & D Sistemleri 287-TC-5002 U/ml (Stok: 50 U/ml)
Deksametazon Sigma-AldrichD29151 & M (Stok: 1 mM)
İnsan Holo-TransferrinR& D Sistemleri 2914-HT100 μ g/ml (Stok: 20 mg/ml)
Amniomax IIGibco11269016Sitogenetik analiz için ortam
mTeSR1Kök Hücre Teknolojileri5850iPSC besleyicisiz kültür için ortam
Nakavt DMEMGibco10829-018
Nakavt Serum ReplasmanıGibco10828-028
Penisilin-Streptomisin (10.000 U/mL)Gibco15140-122
L-Glutamin (200 mM)Gibco25030-024
MEM Esansiyel Olmayan Amino Asit Çözeltisi (100X)Gibco11140-050
2-Merkaptoetanol Gibco31350-0100.1 mM (Stok: 50 mM)
Sodyum ButiratSigma-AldrichB58870.25 mM (Stok: 0.5 M)
Rekombinant İnsan FGF baz, 145 aa Ar-Ge D Sistemleri 4114-TC10 ng/ml (Stok: 10 & mikro; g / ml)
Y-27632 dihidroklorürSigma-AldrichY0503  10 ve mikro; M (Stok: 10 mM)
Fetal Tanımlı Sığır SerumuHidroklonuSH 30070.03
EmbryoMax %0.1 Jelatin ÇözeltisiMerck-MilliporeES-006-B
Matrigel Bazal Membran Matrisi Büyüme Faktörü AzaltılmışBD Biosciences354230
Kollajenaz, Tip IVGibco17104-0191 mg/ml (Stok: 10 mg/ml)
AccutasePAA Laboratories GmbHL11-007Hücre ayırma çözümü
Fare Embriyonik Fibroblast (CF1)Global KökGSC-6201G1*106 hücreler/6 kuyulu plaka
Plazmid pCXLE-hOCT3/4-shp53-FEkle 270771 & g (Stok: 1 &mikro; g/&mikro; l)
Plazmid pCXLE-hSKAddgene 270781 & g (Stok: 1 &mikro; g/&mikro; l)
Plazmid pCXLE-hULAddgene 270801 & g (Stok: 1 &mikro; g/&mikro; l)
Plazmid pCXLE-EGFPEklentisi 270821 &i; g (Stok: 1 &mikro; g/&mikro; l)
Alkalin Fosfataz Boyama KitiStemgent00-0009
Anti-Evre Spesifik Embriyonik Antijen-4 (SSEA-4) AntikoruMerck-MilliporeMAB43041/250
Anti-TRA-1-60 AntikorMerck-MilliporeMAB43601/250
Anti-TRA-1-81 AntikoruMerck-MilliporeMAB43811/250
Anti-Oct-3/4 AntikoruSanta Cruz Biyoteknolojisc-90811/500
Anti-Nanog AntikorSanta Cruz Biyoteknolojisc-337591/500
Anti-Troponin I AntikoruSanta Cruz Biyoteknolojisc-153681/500
Anti-&alfa;-Aktinin (Sarkomerik) AntikoruSigma-AldrichA77321/250
Nöronal Sınıf III ß-Tubulin (TUJ1) AntikoruCovance Araştırma Ürünleri A.Ş.MMS-435P-1001/500
Anti-Tirozin Hidroksilaz (TH) AntikoruCalbiochem657012 1/200
Alexa Fluor 488 Keçi Anti-Fare Moleküler ProblarA-110291/1000
Alexa Fluor 555 Keçi Anti-TavşanMoleküler ProblarA-214291/1000
Ultra Düşük Bağlantılı Hücre Kültürü 6 oyuklu plakaCorning3471
Trizol ReaktifAmbion15596-018 RNA ekstraksiyonu için reaktif
SuperScript VILO cDNA Sentez KitiInvitrogen11754050Ters transkriptaz kiti
iTaq Universal SYBR Green SupermixBio-Rad172-5124
CFX96 Gerçek Zamanlı PCR Tespit SistemiBio-Rad185-5195
Experion Otomatik Elektroforez SistemiBio-Rad700-7000RNA bütünlüğünü kontrol etmek için cihaz
Experion RNA Highsense Analiz kitiBio-Rad7007105RNA bütünlüğünü kontrol etmek için Reaktif kiti
Diseksiyon mikroskobu (SteREO Discovery V12)Zeiss495007
NeonTransfeksiyon Sistemi 100 & mikro; l KitInvitrogenMPK10025Elektroporasyon için Reaktif kiti
Neon Transfeksiyon SistemiInvitrogenMPK5000Elektroporasyon için kullanılan alet
NanoDrop UV/Vis SpektrofotometreThermo ScientificND-2000DNA/RNA miktar tayini için cihaz
EndoFree Plazmid Maxi KitiQiagen12362Plazmid saflaştırma kiti

Kaynaklar

  1. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  2. Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nat. Protoc. 2 (12), 3081-3089 (2007).
  3. Drews, K., Jozefczuk, J., Prigione, A., Adjaye, J. Human induced pluripotent stem cells--from mechanisms to clinical applications. J. Mol. Med. (Berl). 90 (7), 735-745 (2012).
  4. Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells). Curr. Gene Ther. 13 (2), 73-92 (2013).
  5. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  6. Sommer, A. G., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using the STEMCCA lentiviral vector. J. Vis. Exp. (68), e4327(2012).
  7. Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (11), 2667-2674 (2009).
  8. Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus. Methods Mol. Biol. 997, 45-56 (2013).
  9. Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458 (7239), 766-770 (2009).
  10. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat. Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
  11. Kim, D., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell. Stem Cell. 4 (6), 472-476 (2009).
  12. Warren, L., Ni, Y., Wang, J., Guo, X. Feeder-free derivation of human induced pluripotent stem cells with messenger RNA. Sci. Rep. 2, 657(2012).
  13. Stadtfeld, M., Hochedlinger, K. Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications. Genes Dev. 24 (20), 2239-2263 (2010).
  14. Chou, B. K., et al. Efficient human iPS cell derivation by a non-integrating plasmid from blood cells with unique epigenetic and gene expression signatures. Cell Res. 21 (3), 518-529 (2011).
  15. Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494 (7435), 105-110 (2013).
  16. Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat. Biotechnol. 26 (11), 1276-1284 (2008).
  17. Streckfuss-Bomeke, K., et al. Comparative study of human-induced pluripotent stem cells derived from bone marrow cells, hair keratinocytes, and skin fibroblasts. Eur. Heart J. 34 (33), 2618-2629 (2013).
  18. Miyoshi, N., et al. Reprogramming of mouse and human cells to pluripotency using mature microRNAs. Cell. Stem Cell. 8 (6), 633-638 (2011).
  19. Wang, Y., et al. Induced pluripotent stem cells from human hair follicle mesenchymal stem cells. Stem Cell. Rev. 9 (4), 451-460 (2013).
  20. Beltrao-Braga, P. C., et al. Feeder-free derivation of induced pluripotent stem cells from human immature dental pulp stem cells. Cell Transplant. 20 (11-12), 1707-1719 (2011).
  21. Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell. Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
  22. Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nat. Protoc. 7 (11), 2013-2021 (2012).
  23. Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell. Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).
  24. Geti, I., et al. A practical and efficient cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells from adults: blood-derived endothelial progenitor cells. Stem Cells Transl. Med. 1 (12), 855-865 (2012).
  25. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. , Appendix 3-Appendix 3B (2001).
  26. Hasegawa, K., et al. Comparison of reprogramming efficiency between transduction of reprogramming factors, cell-cell fusion, and cytoplast fusion. Stem Cells. 28 (8), 1338-1348 (2010).
  27. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. J Vis Exp. (45), 2565(2010).
  28. Fleige, S., Pfaffl, M. W. RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance. Mol Aspects Med. 27 (2-3), 126-129 (2006).
  29. Meraviglia, V., et al. Human chorionic villus mesenchymal stromal cells reveal strong endothelial conversion properties. Differentiation. 83 (5), 260-270 (2012).
  30. Caspersson, T., Zech, L., Johansson, C. Analysis of human metaphase chromosome set by aid of DNA-binding fluorescent agents. Exp Cell Res. 253 (2), 302-304 (1999).
  31. Alikani, M., Munne, S. Nonviable human pre-implantation embryos as a source of stem cells for research and potential therapy. Stem Cell. Rev. 1 (4), 337-343 (2005).
  32. Tropel, P., et al. High-efficiency derivation of human embryonic stem cell lines following pre-implantation genetic diagnosis. In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 46 (3-4), 376-385 (2010).
  33. Hanna, J., et al. Direct cell reprogramming is a stochastic process amenable to acceleration. Nature. 462 (72-73), 595-601 (2009).
  34. Li, H., et al. The Ink4/Arf locus is a barrier for iPS cell reprogramming. Nature. 460 (7259), 1136-1139 (2009).
  35. Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
  36. Lindner, S. E., Sugden, B. The plasmid replicon of Epstein-Barr virus: mechanistic insights into efficient, licensed, extrachromosomal replication in human cells. Plasmid. 58 (1), 1-12 (2007).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Periferik Kan Monon kleer H creleriBuffy Coat zolasyonuntegrasyon Yapmayan Yeniden ProgramlamaElektroporasyon TransfeksiyonuFare Embriyonik Fibroblast Besleyicilerimm nofloresan AnalizGen Ekspresyon l mMaliyet Etkin Protokol
Bütünleşmeyen episomal plasmidler kullanılarak dondurulmuş Buffy tüylerdeki uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.