Bu protokol, gıda maddelerinde sınıf 1 integronlarının ve bunlarla ilişkili gen kasetlerinin tespitini açıklar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Sınıf 1 integronlar ve Gen Kasetleri için gıda maddelerinin taranması
Bu makalede
Özet
Özet
Antibiyotik direnci, 21. yüzyılda sağlığa yönelik en büyük tehditlerden biridir. Yanal gen transferi yoluyla direnç genlerinin elde edilmesi, çeşitli direnç mekanizmalarının yayılmasında önemli bir faktördür. Lateral transferi kolaylaştıran DNA elementleri arasında, sınıf 1 integronlar, Gram negatif patojenler arasında antibiyotik direnç belirleyicilerinin yayılmasından büyük ölçüde sorumlu olmuştur. Toplamda, bu integronlar 130'dan fazla farklı antibiyotik direnç geni edinmiş ve yaymıştır. Devam eden antibiyotik kullanımı ile, sınıf 1 integronlar, insanların ve evcilleştirilmiş hayvanlarının kommensallerinde ve patojenlerinde her yerde bulunur hale gelmiştir. Sonuç olarak, artık yeni genler edinmeye devam ettikleri ve besin zinciri yoluyla insanlara geri dönme potansiyeline sahip oldukları tüm insan atık akışlarında bulunabilirler. Bu protokol, kültür ve PCR kullanarak gıda maddelerinde sınıf 1 integronları ve bunlarla ilişkili direnç gen kasetlerini tespit etmek için kolaylaştırılmış bir yaklaşımı detaylandırır. Bu protokolü kullanarak, araştırmacılar şunları yapabilmelidir: zenginleştirilmiş kültürler yapmak ve sınıf 1 integronları taramak için örnekler toplayın ve hazırlayın; integron-pozitif izolatları tanımlamak için tek bakteri kolonilerini izole edin; sınıf 1 integronları içeren bakteri türlerini tanımlamak; ve bu integronları ve bunlarla ilişkili gen kasetlerini karakterize eder.
Giriş
Antibiyotiklerin keşfi 20. yüzyılın en büyük bilimsel başarılarından biri oldu. Ancak, antibiyotik kullanımı ve kötüye antibiyotiğe dirençli bakterilerin hızlı evrim yol açmıştır ve bu artık 21. yüzyılda halk sağlığı için ciddi bir tehdit oluşturmaktadır. En tedavi seçenekleri dirençli bakteri suşlarının yükselişi biz antimikrobiyal ilaçlar artık 1,2 etkili bir döneme giriyoruz olasılığını yükseltir.
Antibiyotik direnci kazandıran genetik makine yıl 3 milyonlarca insanları ve antibiyotik seçimi baskıları predating, antik bir sistemdir. Örneğin plazmidler, transpozonlar, genomik adaları, bütünleş....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Çiğ veya hafifçe pişirilir Gıda insan sağlığı için en endişe vardır. Örnekler salata sebze, meyve, kabuklu deniz ürünleri ve kabuklular yer alıyor.
1. Örnek Toplama
- Kontaminasyonu en aza indirmek koşullarda örnekleri toplamak ve taşıma sırasında ayrı, temiz torbalar içinde saklanan. Toplanan sonra, numuneler 4 ° C'de saklandı ve 24 saat içinde işleme tabi tutulmalıdır.
2. Zenginleştirilmiş Kültür Hazırlık
- Meyve ve sebzeler:
- Dayanıklı bir plastik torba içinde malzemenin, yaklaşık 10 g yerleştirin. Daha büyük malzeme işleme durumunda, meyve veya sebze cilt üzerinde yoğunl....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Karışık kültürler ve intI1 bakteriyel izolatlar taranması
Primer seti HS463a / HS464 PCR sınıfı 1 integron-integraz geninin intI1 (Şekil 1) varlığını tespit etmek için kullanılabilir. Bu primer kümesi karışık kültürlerinde intI1 saptanması için çalışır, ve ayrıca dağılma plakalarından (Şekil 2) hasat bakteri kolonileri taranması için kullanılır. Pozitif izolatlar bu primer seti (Şekil 3A) kullanılarak 471 bp tek bir güçlü bant.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
İntegronların ve bunların ilişkili gen kasetlerinin tanımlanması potansiyel, yeni fırsatçı patojenlerin ortaya çıkması tahmin insan besin zincirine patojenler için yollar izleme ve yeni direnç belirlenmesinde önemli bir adımdır ve virülans 8,21,26 determinantlar. Bu yazının amacı, sınıf 1 İntegronların için örnek tarama onların kaset dizileri karakterize ve ikamet ettikleri bakteri türlerinin belirlenmesi için bir aerodinamik yaklaşım tanımlamak için oldu. Protokolde Kritik adımlar iyi mikrobiyolojik uygulama.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa ilgili hiçbir şey yok.
Teşekkürler
Michaela Hall, Larissa Bispo ve Teknik Yardım Gustavo Tavares teşekkürler.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| GoTaq Renksiz Mastermix | Promega | M7132 | Tüm PCR'lerde kullanılır |
| RNAse (sığır pankreasından Ribonükleaz A) | Sigma | R6513-10MG | Tüm PCR'lerde kullanılır |
| HinFI kısıtlama enzimi | Promega | R6201 | 16S rDNA PCR ürünlerini sindirmek için kullanılır. Enzim, optimum tampon ve BSA |
| 100 bp merdiven | GE Sağlık | 27400701 | Tüm agaroz jellerinde boyut standardı olarak kullanılır |
| GelRed DNA lekesi | Biotium | 41003 | DİKKAT: Bu malzemeyi tutarken kişisel koruyucu giyilmelidir |
| Guanidinyum tiyosiyanat | Yaşam Teknolojileri | AM9422 | DİKKAT: Bu malzemeyi tutarken kişisel koruyucu giyilmelidir |
| CLS-TC Çözelti | MP Biyomedikal | 6540409 | Genomik DNA ekstraksiyonunun başlangıcında kullanılan resüspansiyon çözeltisi |
| Lysing Matrix E FastPrep tüpleri | MP Biomedicals | 116914500 | Bakteri hücre duvarlarının mekanik olarak bozulması için gerekli olan tüp. Bu kod 500 tüplük paketler için kullanılır, daha küçük miktarlar mevcuttur. |
| Bağlayıcı matris | MP Biyomedikaller | 116540408 | 6 M guanidinyum tiyosiyanat ile 1:5 oranında seyreltilir ve genomik DNA ekstraksiyon yönteminde kullanılır. |
| Hızlı Hazırlık makinesi | MP Biyomedikal | Mevcut seçenek sayısı | MP Biomedicals, satın alınabilecek bir dizi FastPrep makinesine sahiptir. Daha fazla bilgi için http://www.mpbio.com adresini ziyaret edin |
Kaynaklar
- Bush, K., et al. Tackling antibiotic resistance. Nature Rev. Microbiol. 9, 894-896 (2011).
- Davies, J., Davies, D. Origins and evolution of antibiotic resistance. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74 (3), 417-433 (2010).
- Costa, V. M., et al.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
