Kapalı Başkanı Travmatik Beyin yaralayabilecek Bir Yöntem<em&gt; Drosophila</em

Özet

Burada Drosophila kapalı kafa travmatik beyin hasarı (TBI) indirebilmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, sinekler için deneysel araçları ve teknikleri geniş bir dizi kullanarak TBI patolojiler altında yatan hücresel ve moleküler mekanizmaları araştırmak için bir ağ geçidi sağlar.

Özet

Travmatik beyin hasarı (TBH), fiziksel, bilişsel, davranışsal ve fonksiyonları ve ölüm bozukluğu neden her yıl milyonlarca insanı etkilemektedir. Drosophila kullanılarak yapılan çalışmalar nörolojik süreçlerin anlaşılmasında önemli atılımlar katkıda bulunmuştur. Böylece, insanlarda TBI patolojilerin hücresel ve moleküler temelini anlamak amacıyla, biz sinek kapalı kafa TBI indirebilmek için High Impact Travma (HIT) cihazı geliştirdi. Sinekler gibi geçici ehliyetini kaybetmesi ve ilerici nörodejenerasyona gibi insan TBI ile uyumlu HIT cihaz ekran fenotipleri tabi. HIT cihaz sinek beyinde mekanik hasara neden bir şişenin duvara sinekleri itmek için bir yay-tabanlı mekanizması kullanır. Cihaz operasyon basit ve hızlı olan, yapımı pahalı olmayan, kolayca ve tekrarlanabilir sonuçlar üretir. Sonuç olarak, HIT cihazı mevcut deneysel araçları ve sinekler temel adrese teknikleri ile kombine edilebilirTBI için teşhis ve tedavilerin gelişmesine yol açabilir TBI ilgili sorular. Özellikle, HIT cihazı TBI patolojilerin genetik temelini anlamak için geniş çaplı genetik ekranlar gerçekleştirmek için kullanılabilir.

Giriş

Travmatik beyin hasarı (TBI), harici bir mekanik kuvvet ile ilgili beyin yaralanması olarak tanımlanmaktadır. En yaygın tür künt kuvvetler ve atalet hızlanma ve beyin kafatasının içini grev neden yavaşlama güçleri olarak kapalı kafa kuvvetlerinden TBI sonuçlar. Amerika Birleşik Devletleri'nde, 50.000 kişi TBI her yıl ölmektedir ve 2,5-6.500.000 bireyler, TBI sonuçları ile yaşayan fiziksel, bilişsel zayıflatıcı dahil ve ^1,2 davranış sorunları olduğu tahmin edilmektedir. TBI sonuçları beyne primer mekanik yaralanma için değil, aynı zamanda zaman ^3-5 içinde meydana beyin sekonder hücresel ve moleküler yaralanmalar gibi diğer dokularda değil sadece bulunmaktadır. teşhis ve TBI tedavi yaklaşımların geliştirilmesi TBI karmaşık bir hastalık süreci olduğu için zor olduğu kanıtlanmıştır. Birincil yaralanmalar, insan fizyolojisi ve çevresel faktörlerin değişken doğası heterojen ikincil i sonuçlanırnjuries ve patolojileri. Altta yatan değişken faktörler bireyin temel yaralanmanın şiddetini, tekrarlayan primer yaralanma arasındaki süreyi ve yaş ve genotipi içermektedir. Her bir değişken faktör TBI sonuçları nasıl katkıda anlama teşhis ve TBI ^6,7 tedavisinde yaklaşımlar geliştirilmesine yardımcı olmak için muhtemeldir.

Burada TBI sonuçları değişken faktör katkı tanımlamak için kullanılabileceğini Drosophila melanogaster (meyve sineği) 'de kapalı baş TBI kasten için bir yöntem tarif eder. yöntem yoğun bir elin avuç içi karşı bir sinek kültür flakon yan isabet vahşi tip neden bir ilk gözlem dayanmaktadır geçici TBI olası bir sonucu sakat hale uçar. Böylece, el vurma eylem hızlanma ve yavaşlama kuvvetleri özetlemek için Yüksek Etki Travma (HIT) aygıtı inşa. Yüksek hızlı film gösterir tek bir grevCihaz neden HIT onların baş ve gövdesinin ⁸ flakon duvarı birkaç kez temas uçar. Bir dereceye kadar, tüm kişiler sekerek ve düşme ve araba kazası ⁹ insanlara ne benzer kafa kapsül, karşı deforme olmasına sinek beyin neden muhtemeldir. Buna göre, beyinde ¹⁰ ataksi ardından geçici ehliyetini kaybetmesi, hareketlilik kademeli bir toparlanma, baş gen ifade değişiklikleri ve ilerleyici sinir dejenerasyonuna dahil beyin hasarı, tutarlı HIT cihaz ekran fenotipleri ile tedavi sinekler. Böylece, HIT cihazı mümkün deneysel araçları ve sinekler için geliştirilen tekniklerin büyük cephanelik kullanarak TBI çalışma yapar.

Protokol

HIT Cihazın 1. İnşaat

1. İki kelepçeler ve dört vidayı (Şekil 1A) kullanarak kuruluna yayı takın. Yönetim kurulu genişliğine göre kelepçeleri ortalamak ve yönetim kurulu kenarı ile dış kelepçe floş ile birbirlerine karşı onları popo. Önce kelepçeler takılarak için, yay üzerinde sıkıca uyacak şekilde pense ile bükün.
   NOT: HIT cihazı oluşturmak için gerekli malzemelerin açıklamaları için Tablo 1'e bakınız. Baharın kenetlenmiş uç kurulu kenarından 1/8 inç (3.2 mm) olmalıdır ve serbest ucu 3/4 inç (19 mm) ile tahta üzerinde uzanmalıdır. Bu yönetim kurulu uzunluğu ile paralel yatıyor böylece yayı ayarlayın.
2. Velcro döngüler yapışkan bant kez etrafında bahar serbest ucunu sarın. Velcro dış kenarı bahar sonu ile aynı hizada olmalıdır. O CRE tarafından bahar flakon güvenliğini sağlamak için kullanılan, çünkü Velcro önemlidirSıkı bir sıkıştırma uydurma ating. Velcro, aynı zamanda pek çok küçük şişeler kısa bir süre içinde işlenecek sağlayan, kolay bağlantı ve şişeler çıkarılmasını mümkün kılar.
3. Sıkı tahta karşı merkezli baş aşağı buz kovası kapağı yerleştirin. Uzun kenarı kurulu genişliğine paralel olacak şekilde buz kovası kapağının kaldırılmış bölgesini yönlendirmek. Bir şişe yayı bağlıyken bahar tahtada düz yalan olmayacak şekilde buz kovası yükseltilmiş bölge, tahta daha 1/2 inç (13 mm) yüksek olduğunu unutmayın.
4. Buz kovası kapağı kurulu ve nesne arasında sıkışmış ve hareket etmiyor, böylece, örneğin bir duvar gibi sabit bir nesneye karşı tüm cihaz kaydırın.
5. Bant, bir karton altına kağıt iletki flakon tepsiyi sinek ve mükemmel dikey konumuna geri çekildiğinde 90 ° işareti yay ile aynı hizada olacak şekilde kurulu uzunluğuna karşı kenarında stand it.

2.HIT Cihazının Operasyonu

1. Boş bir şişe içinde uçar ve bir dar pamuk kullanarak flakon kapağı kapatılır -anesthetized 1 ile 60 CO ₂ arasındaki yeri.
2. Bu alttan 1 inç (2.5 cm) kadar şişe içine pamuk iterek şişenin taban 1 inç (2.5 cm) sinekler öngörebilir. Bu 1 inç (2.5 cm) işaretine flakon üzerinde bir çizgi çizmek için yararlıdır. Şişenin büyük veya daha küçük bölgelere sinekler hapsetmesi fenotipleri şiddetini etkileyebilir unutmayın.
3. Sinekler CO ₂ hareketlilik kurtarmak için 5 dakika bekleyin. O 5 dk tamamen CO ₂ etkilerini ortadan kaldırmak için yeterli olup olmadığı bilinmemektedir unutmayın.
4. Velcro iç kenarı flakon (Şekil 1B) üst ile aynı hizaya gelene kadar şişenin içine yayın ucunu. Bahar düz yalan olduğunda, flakonun 1 inç (2.5 cm) buz kovası kapağının kaldırılmış bölgeyi örtüşmelidir. Şişeler m yeniden kullanılabilirher zaman.
5. Otururken, sol elin baş ve işaret parmağı kullanılarak Velcro bölgede flakon tutun. Sağ elinizi kullanarak Benchtop yönetim kurulu sıkı tutun. Alternatif olarak, masa üstü sıkı yönetim kurulu tutmak için C-kelepçeler kullanın.
6. Mükemmel düz geri istenen açıya yayı çekin. Bahar bırakın. Bahar tamamen durmasını bekleyin.
7. Bahar şişe çıkarın ve sinekler ≥5 dk kurtarmak için izin verir. Başka bir greve sinekler Konu veya sinek gıda ile flakon sinekler aktarın.
   Not: birçok analiz HIT cihazından vuruş fenotipik etkilerini değerlendirmek için kullanılabilir. Örneğin, uzun ömürlü etkileri yaralanma sonrası zaman hayatta sinekler yüzde analizi ile tespit edilebilir, beyin morfolojisi üzerinde etkisi kafasının histolojik analiz ile tespit edilebilir, ve gen ifadesi üzerindeki etkisi, mRNA seviyelerinin niceliksel analizi ile belirlenebilir ^10.
8. Determinaynı grev tabi değildir kontrol sinekler tedavi ederek grev nedeniyle değil prosedürün e etkileri. Buz kovası kapağı karşı flakon etkisi bir gürültü üretir, çünkü işitme koruması giyin.

Sonuçlar

Biz sinekler birincil yaralanma kısa bir süre sonra ölür neden anlamak ilgilendi. Ölümü ölçmek için, birincil yaralanma 24 saat içinde ölen sineklerin yüzde 24 saatte Ölüm İndeksi (MI _24), tespit. HIT cihazdan saldırılarından Sinekler uçucu gıda ile bir şişe içinde 25 ° C'de inkübe edilmiştir, ve ölü sinek sayısı, 24 saat sonra sayılmıştır. Biz MI ₂₄ etkileyen faktörleri belirlemek için bu yaklaşımı kullanılır ve MI ₂₄ bir şişeye (10 ila 60 sinekler test edildi) sinek sayısına göre e...

Tartışma

HIT cihaz yöntemi TBI ¹¹ delici yerine kapalı kafa neden gerçeği ile sinekler travmatik yaralanma indirebilmek diğer yöntemlerden ayrılır. Ayrıca, HIT cihaz yöntemi birçok sinekler TBI indirebilmek için daha az zaman, çaba ve beceri alır, bu yüzden yöntem büyük ölçekli genetik ekranlar diğer yöntemlere göre daha müsait. Son olarak, HIT cihazı tarafından uygulanan birincil yaralanmalar, beyin sınırlı değildir aslında bir sınırlama ve bir avantaj niteliğindedir. Ek çalışmalar fenotipleri beyne ya da diğer vücut...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Çinko kaplama sıkıştırma yayı	The Hillman  Grup	540189	9 7/8 inç (uzunluk, 2,2 cm), 15/16 inç (dış çap, 2,4 cm), 0,12 inç (tel boyutu, 0,3 cm)
Ahşap tahta			9 inç (uzunluk, 22,9 cm), 6,5 inç (genişlik, 16,5 cm), 0,75 inç (yükseklik, 1,9 cm)
Kelepçeler	Sigma Electrical Manufacturing Corporation	49822	3.10 inç (uzunluk, 7.9 cm), 0.68 inç (genişlik, 1.7 cm), 1.11 inç (yükseklik, 2.8 cm), EMT İki Delikli Kayışlar, 1 inç (2.5 cm) çelik için tipe tıklayın EMT kanalı
Kendinden yapışkanlı cırt cırtlı			3 inç (uzunluk, 7.6 cm), (3/4 inç genişlik, 1.9 cm)
Poliüretan buz kovası kapağı	Fisher Scientific	02-591-45	9 1/8 inç (uzunluk, 23,2 cm), 9 1/8 inç (genişlik, 23,2 cm), 1 1/4 inç (yükseklik, 3,2 cm)
Plastik sinek şişeleri	Applied Scientific	AS-510	3 11/16 inç (yükseklik, 9,4 cm), 1 1/16 inç (iç çap, 2,7 cm), 1 1/8 inç (dış çap, 2,9 cm)
Büyük pamuk topları	Fisher Scientific	22-456-883
Kağıt iletki			10 inç (çap, 25,4 cm)

halka yarısı