Yöntem makalesi

Belirli Duyu Hücre bağıntılı Konfokal ve 3D Elektron Mikroskobu

DOI:

10.3791/52918

⸱

19 Temmuz 2015

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Duke University Medical Center, 2Department of Chemistry, University of North Carolina - Chapel Hill, 3Renovo Neural Incorporated

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, konfokal ve seri blok yüz taramalı elektron mikroskobu arasında köprü kurarak belirli bir hücrenin doğal dokusundaki üst yapısını ortaya çıkarmak için bir yöntem olan cocem3D'yi tanıtıyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir hücrenin ultrastrüktürü tarif işlevini anlamak için önemlidir. Bu, bağırsak epiteli enteroendokrin hücreleri gibi çeşitli hücre tiplerinde, yapılmış dokular boyunca yayılan nadir hücre tipleri için zor bir proje olabilir. 1000: Şekiller 1 oranında diğer epitelyal hücreleri arasında dağılmış nedeniyle gıda ve bakteri bu mide-bağırsak sensörler çalışma zor olmuştur. Son zamanlarda, transjenik farenin raportör flöresan ile enteroendokrin hücreleri tanımlamak için üretilmiştir. Bunlardan biri peptid YY-GFP faredir. Bu Fareyi kullanarak, biz konfokal ve seri blok yüz taramalı elektron mikroskobu ilişkilendirmek için bir yöntem geliştirdi. Biz yöntem cocem3D adında ve doku belirli bir enteroendokrin hücresini tanımlamak ve 3D hücrenin ultrastrüktür açıklayacak uygulamıştır. cocem3D çözünürlüğü hacmi yeniden hücre zarlarını salgı veziküllerinde gibi küçük organellere tanımlamak ve ayırt yeterlindering. Cocem3D kolayca doğal doku Diğer özel hücre tiplerinin 3D ultra yapısını incelemek için adapte edilebilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir hücrenin içinde hayat zaman ve mekan yer alır. Zamanla değişiklikler genellikle süper çözünürlük mikroskobu gibi floresan görüntüleme teknikleri ile kombine time-lapse mikroskopi kullanılarak incelenmiştir. Uzay, bir hücre ya da hücre-hücre etkileşimleri içindeki organellerin düzenlemesi, özellikle, sadece hücre ince yapısı tam bir hesabı ile elde edilebilir. Bir hücrenin ince yapısı kapsamlı bir hesabı da C gibi, genom mevcut olduğu durumlarda genomik işlevine açıklık getirebilir elegans nematod 1 veya düz placozoa tricoplax 2. adherens. Seri kesit elektron mikroskopisi artık verimli tekrarlanabilir, zaman ve seri blok yüz taramalı elektron mikroskobu 3 (SBEM) gibi otomatik 3D elektron mikroskopisi teknolojilerin geliştirilmesi, daha ucuz bir görev sayesinde.

fonksiyonu aydınlatmak için yapısal bilgiye ihtiyaç belli cel çok açıktırnöronlar, glia ya da duyu epitel hücreleri gibi işlevi fiziksel hücre-hücre etkileşimlerine bağlıdır l türleri. Biz bağırsak lümeninde besin duyusal sinyaller sonuçta appetitive davranışları modüle bir elektrik sinyaline dönüştürür transdük nasıl durulaştırmada özellikle ilgilendi. Devre karmaşıktır, ancak besin duyu epitel hücreleri, adı enteroendokrin hücreleri ile temas haline geldiği bağırsak duvarından başlar. Mesela lezzet hücreleri gibi diğer duyusal epitel hücreleri, farklı olarak, enteroendokrin hücreler bin 4-7 arası bir oranda bağırsak epiteli boyunca dağılmıştır. Sonuç olarak, onlar tanımlamak ve incelemek için zor olmuştur, ve uzun bir süre için sadece bağırsak hormonları kaynağı olarak görüldü. Ama hücre özel floresan muhabiri farelerin gelişmesiyle birlikte, bu hücrelerin karmaşık duyusal işlevi ortaya çıkmaktadır. Bu muhabir farelerin birini bir peptid YY-GFP (PyyGFP) Fareyi kullanarak, biz o enteroendocr bulunduine hücreleri biz neuropod adında ünlü bir sitoplazmik kuyruk var. neuropods görünümü, hücre-hücre bağlantılı bir korunmuş işlevi önerdi. Böylece, bir enteroendokrin hücresinin ultrastrüktürünü belgeleyerek, neuropods fonksiyonu elde edilebilir ki gerekçeli.

tespit edilmesi zor bir dağınık hücrede bir uzantısı yapısını anlamak için ihtiyaç konfokal mikroskopi ve SBEM birleştirmek için bir yöntem geliştirmek için ana gerekçe oldu. İlgili hücre PyyGFP enteroendokrin hücreye spesifik raportör fareler kullanılarak belirlenmiştir. yöntem bize bir enteroendokrin hücre ve onun neuropod tüm ultrastrüktürünü belgelemek için izin verdi. Neuropods içinde, nöronal akson yapısal özelliklerini bulundu ve neuropods dışında, biz enterik glia 8 fiziksel bir ilişki bulundu. Gerçekten de, neuropods bu hücrelerin sekretuar işlevde önemli bir rolü olduğunu düşündürmektedir Tüm salgı vezikülleri yaklaşık% 70 içerir. Binayapısal veriler, daha yakın zamanda, bu neuropods yoluyla enteroendokrin hücreleri ve nöronların bağırsak dil 8,9 tat hücreleri benzer bir nöroepitelyal devresini oluşturur innerve bulundu.

Yapısal verilere kaynaklanmıştır gastrointestinal kimyasal-duyusal mekanizmaların bu özellikleri ortaya çıkararak, bu bağlaşık mikroskopi yöntemi kullanılarak toplanmıştır. Bu yöntem, hücrelerin, çok düşük oranda dokular içinde dağılmış olan, özellikle hücre biyolojisi diğer alanlarda faydalı olabilir inanıyoruz. Biz 3D (Cocem3D) 'de bağlaşık konfokal ve seri blok yüz taramalı elektron mikroskobu yönteme başvurdu. yöntem aşağıdaki ana adımlardan oluşur: doku diseksiyonu, konfokal mikroskopi, SBEM görüntüleme, SBEM ve konfokal görüntü korelasyon ve manuel segmentasyon. Korelasyon fiziksel ziyade kimyasal olduğundan diğer bağıntılı yöntemlerle karşılaştırıldığında, kavram oldukça basittir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvan bakımı ve deneyler Duke Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmış bir protokol uyarınca yapılmıştır.

Cocem3D daha önce yayınlanmış protokollere 10,11 bir kombinasyonundan kaynaklanmıştır ve PyyGFP raportör fare 12 kullanarak belli bir enteroendokrin hücre çalışma için uygulanmıştır. Bu yöntem, hali hazırda ticari olarak temin edilebilen transgenik raportör fareler kullanılarak ilgi diğer hücrelere de uygulanabilir. Korelatif konfokal mikroskopi, seri blok yüz taramalı elektron mikroskobu (SBEM) ve 3D rendering veriler: yöntem üç bölümlerde açıklanmıştır.

Korelatif Konfokal Mikroskop

Bu bölümün amacı, karşılıklı konfokal ve SBEM görüntüleme sağlayan boyutları distal kolonda bir doku segmenti hasat etmektir. aşağıdaki gibi protokol:

1. Hasat Doku

  1. HazırlamakPBS içinde 50 ug / ml heparin solüsyonu 10 mi.
  2. 10 ml ketamin (100 mg / ml) ve xylazine 1 ml (20 mg / ml) karıştırarak ksilazin / ketamin anestezi stok hazırlayın.
    1. 0.1M PBS 4: ksilazin / ketamin Stokta 1 seyreltin.
  3. PBS içinde% 4 paraformaldehit ve% 0.1 glutar aldehit içinde sabitleyici çözeltisi bir 100 ml hazırlayın.
  4. Ksilazin / ketamin anestezik öldürücü bir dozu ile, 6-10 haftalık bir PyyGFP fare anestezisi. Fare ağırlığı 20 g başına 0.15 ml intraperitoneal anestezik enjekte edilir.
  5. Kuyruk veya ayak kısma doğru fare anesthetization onaylayın ve kuruluğunu önlemek için gözleri merhem kullanın.
  6. Fiksatif intrakardiyak 10 serpmek için bir değişken akış peristaltik pompa kullanın. Cerrahi makas kullanarak (13 cm uzunluğunda) kesim bağırsak, kalp, akciğerler ve ortaya çıkarmak için karın boşluğuna açın. Dar kalıp kavisli bir forseps (12 cm uzunluğunda) ile kalbi tutun ve peristaltik pompa gelen kelebek iğne (19 G) takın iNto sol ventrikül. Hemen, bahar düz makas (uzunluğu 4 mm) sağ atrium kesti. 2 ml'lik bir oranda serpmek / dk, ilk fare kuyruk kadar 15 dakika boyunca buz soğukluğunda sabitleyici çözeltisi ile daha sonra heparin 1 dakika için çözelti ve tamamen katıdır.
    Not: Bu, bağırsak mukozasında küçük damarların patlamasını önlemek için yavaş bir hızda perfüze edilmesi için çok önemlidir. Gemilerin Patlama dokusunun ultrastrüktür uzlaşma olacak. Perfüzyon yeterli ise, karaciğer 3-5 dakika içinde renk soluk açmalısınız.
  7. Kullanımı küçük makas karın boşluğu açın ve distal rektumun için çekum ile kavşağından tüm kolon tüketim. Buz soğukluğunda PBS doku yerleştirin. PBS batmış olsa da, küçük yaylı makas ile mezenter boyunca kolon açık kesti.

2. Doku Bölümleri Kesme ve Sabitleme

  1. Bir bisturi kullanılarak, distal kolon ila yaklaşık 6 Küçük doku bölümleri (2 mm2) kesti. Bir yaprak o bu yapınf diş mum ve PBS birkaç damla gömülmüş.
  2. 4 ° C 'de 3 saat süre ile sabitleştirici çözelti içinde doku bölümleri sonrası sabitleyin.

3. Mikro-diseksiyon Doku Blokları

  1. Agaroz PBS içinde% 5 düşük erime hazırlamak ve 45 ° C'de bir su banyosu içinde muhafaza edin.
  2. % 5 agaroz düşük erime standart boyutta Tissue-Tek cryomold gibi, küçük bir plastik kap kullanarak doku segmentleri gömün.
  3. Titreşimli bıçak mikrotomda gömülü bölümler monte ve buz gibi soğuk PBS ile tampon tepsisini doldurun.
  4. 0.8 genlik ve 0.04 mm / sn hızında 300 mikron doku şeritlerini kesin. Not: Bu noktada, kağıt şeritleri agaroz yerinden edilecektir.
  5. Yeniden embed agaroz 300 mikron doku şeritleri ve vibratome en bıçak dik mikrotomda takar.
  6. Bir vibratome kullanarak, 50 um kadar bir kalınlıkta doku şeritler kesilir. Not: Nihai doku blokları yaklaşık 300 um genişliğinde x 50 mikron kalınlığında olacaktır. Bunlar dimensions enteroendokrin hücrenin kalınlığı 15-20 mikron ve neuropod uzunluğu 30-70 nm arasında olduğunu göstermiştir Pilot konfokal deneylerden optimize edilmiştir. Hücrenin oryantasyon doku bloğun yüzüne paralel, bu nedenle, bütün bir hücre 50 mikron kalınlığında tarafından dokuya 300 mikron genişliğinde bir blok içinde yer olabilir. Ilgi konusu doku ve hücre tipine bağlı olarak, bu boyutlar değişir.
  7. 4 ° C de PBS içinde doku blokları saklayın.

4. Konfokal Görüntüleme

  1. 4000: 1 PBS içinde DAPI seyrelterek nükleer leke çözüm hazırlayın.
  2. 5 dakika boyunca DAPI Nükleer soya doku blokları inkübe edin. Not: DAPI boyama konfokal ve SBEM görüntüleri ilişkilendirilmesi için yararlı onların çekirdekleri tarafından ayırt tek tek hücrelerin kolaylaştırır.
  3. Tahsil cam slayt Mount doku blokları, PBS birkaç damla ekleyin ve bir lamel ile bunları kapatın.
  4. Konfokal mikroskop kullanılarak, blok tespitbozulmamış villus ve ilgi PyyGFP hücreleri ile s ve z-process optik bölümleri elde etmek için onları görüntülenmiş.
    1. 1 mikron optik bölümleri z-yığınları elde etmek için bir 20X / 0.8 Zeiss Plan Apochromat hedefini kullanın.
    2. Z yığın için, başka hücrelere ilişkiyi belirlemek için 405 nm'de (DAPI) kanalları kullanarak 488 nm endojen GFP ilgi hücre lokalize etmek ve diferansiyel girişim kontrast (DIC) hücre göre konumunu belirlemek için lümen.
    3. 1.024 piksel veya daha yüksek görüntü çözünürlüğü kullanın.

Agaroz 5. Gömme bloklar

  1. PBS içinde% 4 paraformaldehit ve% 2.5 glutar aldehit içinde sabitleyici 10 ml hazırlayın.
  2. Dikkatlice doku bloğu zarar vermeden uzak cam slayt lamel slayt kapak kayma kenarları PBS eklenerek cam slayt doku blokları kaldırmak. Sonra, bir 1 slayt doku bloğu aktarmak için bir sanat fırça kullanın.5 Ml% 4 paraformaldehid ve% 2.5 glutaraldehit fiksatif içeren mikrosantrifüj tüp.
  3. Sonrası düzeltme doku blokları O / N 4 ° C'de.
  4. PBS doku blokları aktarın. Sonra,% 5, iki cam slaytlar arasında onları sandviç agaroz düşük erime düz blokları embed.
    Not: agaroz ince bir tabaka halinde bloklar gömülmesi boyama esnasında arka manipülasyon kolaylaştırır.
  5. Bir meydanda agaroz kesin ve üst tarafta bir çentik yapmak. Not: Bu adım, daha sonraki kademelerde yönünü sağlamak için gereklidir.
  6. Daha sonra işlenene kadar 4 ° C 'de PBS ile 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü saklayın blok.

Seri Blok-yüz Taramalı Elektron Mikroskobu (SBEM)

Bu bölümde, doku bloğu hazırlanır ve düşük büyütmede SBEM ile görüntülendi. Blok yüz anket görüntü daha sonra ilgi hücreyi içeren bölgeyi tanımlamak için konfokal verilerle ilişkilidir. Bölgede keztanımlanır, doku 7 nm / piksel ve 70 nm dilim çözünürlükte görüntülü. Bu sorunu gidermek ve diğer organelleri büyük yoğun çekirdek salgı veziküller ayırt etmek için yeterli oldu. Enteroendokrin hücrelerde, veziküller, bu tür çapı 13 ila 100 nm ila 150 arasında değişir. aşağıdaki gibi protokol:

6. Boyama Doku Bölümler

  1. PBS doku çıkarın ve 0.1 M kakodilat tampon içinde üç kez, her biri 5 dakika durulayın.
  2. 1 saat 0.1% tannik asit leke blok hücre zarları 14 kontrastı arttırmak için, 0.1 M kakodilat tampon maddesi içinde çözülmüştür.
  3. Yayınlanan protokole göre 11 sonraki boyama ve doku dehidratasyon yürütmek. Deerinck et al izlenerek. Protokol, bu çözüm hazırlanması: 1)% 1 (ağırlık / hacim) thiocarbonhydrazide (THC); 2) aspartat çözüm kurşun; 3)% 1 uranil asetat ve 4) ozmiyum tetraoxyde / potasyum ferrosiyanür (OsO 4 / K ferrosiyanür). % 4 OsO 4 ve 2x karıştırın1 at [10 ml H 2 O K ferrosiyanür ve 0.86 g Na kakodilat ile 0.3] K ferrosiyanür stok: 1 oranında OsO 4 / K ferrosiyanür yapmak. Not: agaroz gömülü doku olması boyama esnasında kullanımını kolaylaştırır. Dikkatle takip eden reçine sızması için agaroz kaldırmak.
  4. Durulama numuneler daha sonra, üç, 0.1 M kakodilat tampon içinde katı, her biri 5 dakika, 4 ° C 'de 2 saat süre ile OsO4 / K ferrosiyanür çözeltisi ile boyanır.
  5. 60 ° C'de 30 dakika boyunca TCH ultra saf su ile üç kez, her biri 5 dakika ve leke ile durulayın.
  6. Oda sıcaklığında 60 dakika boyunca% 2 OsO 4 (Resim K ferrosiyanür) ultra saf suda üç defa, her biri 5 dakika ve leke durulayın. Ultra saf su içinde tekrar üç kere, her biri 5 dakika durulayın.
  7. 4 ° C'de /% 1 uranil asetat O ile N Leke. Ultra saf su içinde üç kez, her biri 5 dakika durulayın.
  8. 60 ° C'de 30 dakika boyunca talebi aspartat ile Leke. Ultra saf su içinde üç kez, her biri 5 dakika durulayın.
  9. Solutio durulayarak dokuları dehydrateEtanol konsantrasyonları artan ns. % 50,% 75,% 85,% 95, ve mutlak% 100 etanol ile 2 defa, her biri 5 dakika durulayın. Sonunda, propilen oksit ile iki kez, 10 dakika her biri bölümleri yıkayın.

Reçine 7. sızmakta ve katıştırma doku kesitleri

  1. Reçine, ticari olarak avaialble kiti kullanılarak bloklar sızmak. Bir EPON gömme kiti kullanılarak reçine gömün dokular. % 48 Epoksi,% 20 mi DDSA,% 30 mi NMA ve% 2 DMP30 bir reçine karışımı hazırlayın. 5 dakika boyunca kuvvetlice reçine karışımı karıştırın ve daha sonra kabarcıklar yüzeye gelmek için izin 30 dakika süreyle vakum karışımı yerleştirin.
  2. 1 de propilen oksit ile reçine karıştırın: 1 oranını ve şiddetle çalkalanır. Dokulardan Nihai dehidrasyon durulama çıkarın ve propilen oksit ile karışık reçine ilave edin. Bir döndürücü O'da örnekleri ile yerleştirin flakon / N ve flakon kapaksız bırakın. Ertesi gün, taze EPON Reçine ekleyebilir ve rotatör içinde 90 dakika boyunca karıştırın.
  3. Onları sandviç mümkün olduğunca düz bir reçine gömün bloklarbirbirlerine 15 yapışmasını engellemek için, sıvı salma maddesi ile tedavi edilmiş cam slaytlar arasındadır.
  4. Blok, düz gömülü sonra, 60 ° C'de ilave bir 48 saat boyunca blok tedavi.
  5. Blokları serbest bırakmak için birbirinden slaytları çekin.

8. Montaj ve Görüntüleme Doku Blok Kırpma

  1. Diseksiyon kapsamında, blok kesme önce ilgi hücreleri içeren bölgelerin belirlenmesi kolaylaştırmak için konfokal mikrograflar bununla reçine gömülü doku blokları yönünü maç.
  2. Elle aşağı ~ 500 x 500 mm blok yüz reçine gömülü blok Trim.
  3. 30 dakika boyunca iletken epoksi ve kuru içeren bir pim üzerine düz blok monte edin. Ardından, 60 ° C'de bir yüzeye ve kuru O / N blok düz koymak.
  4. Coat kolloidal gümüş sıvı ile blok. Co kolaylaştırmak için dik açıyla bloğun dilimleme sağlamak için doku kesitleri düz BakımSeri blok yüz ve konfokal mikrografikleri rrelating.

9. SBEM

  1. Görüntü SBEM sistemi ile donatılmış bir Taramalı Elektron Mikroskobu kullanılarak blok (e .g., 3View).
  2. Set başlangıç ​​kalınlığı ~ 2 mikron artışlarla bölüm ve doku yüz blok çıkana kadar kesti.
  3. Tüm blok yüzünün surver görüntü kazanır.
  4. Fiji yazılımı kullanarak, sabitleme sırasında ve 16 boyama örnek çözgü için ortak bir payda ve hesap oluşturmak için seri blok yüz ve konfokal hem mikrograflar ölçümleri almak.
  5. Konfokal görüntüler koordinatlarına paydayı çarpılarak blok yüzünde ilgi alanını bulun. Bir referans olarak, mikrovillus, goblet hücreleri, ya da lamina propria konumu gibi, aynı zamanda diğer yapısal özellikleri kullanın.
  6. En ilgi Görüntü bölge 2.25 kV ve yüksek vakum modunda 7 nm / piksel (veya 15,147X büyütme). Dilim artışları ayarlanması gerekir70 nm ya da daha az.
  7. Ham 16-bit .dm3 formatta SBEM verileri toplayın.

Yüzey segmentasyonu 10. Optimizasyon SBEM Görüntüler

  1. 8-bit tiff ham .dm3 biçiminden SBEM görüntüleri dönüştürün.
  2. Fiji 0.8 gaussian blur filtresi kullanarak görüntüleri .tiff Filtre.
  3. Orijinal boyutunun% 25'ine veri seti küçültün ve set işlemek için gerekli olan RAM belleği miktarını en aza indirmek için bir .tiff yığınının olarak kaydedin.
  4. Çeviri modunda Fiji eklentisi "SIFT lineer yığın uyum" seçeneğini kullanarak SBEM görüntülerin yığınını hizalayın ve "ekin 3D" eklentisi kullanarak kırpılmış. Not: Kırpma daha segmentlere ve volume rendering için gerekli RAM belleği miktarı azalır yardımcı olur.

3D Veri Oluşturma

11. Konfokal Mikroskop

  1. Otomatik "yüzeyler" aracı modunu aşmak kullanarak z-yığınları yeniden yapılandırma. Şekil 1D, bir rec gösterirMutlak yoğunluk olarak 0.126 um de yüzeyler alan detay, pürüzsüz seçeneğini kullanarak her kanalın onstruction ve eşikleme.

12. Seri Blok-yüz SEM

Not: Manuel veri segmentasyonu çok zaman alıcı prosedür ve birkaç hafta sürebilir prosedürü işlenecek özelliklere bağlı olarak olduğunu. Bohórquez ark sunulan videolar ve şekiller için Segmentasyon. 2014 8 elle yapılır ve emek yaklaşık 500 saat sürdü. Bu bölümleme işlemine başlamadan önce render gerek temel özellikleri öncelik önerilir. Prosedür aşağıdaki gibidir:

  1. Beraberlik modunda "yüzeyler" aracını ve ilgi hücreyi hale manuel segment ve hacmi 50 milisaniye modu çizim "kontur" seçeneğini kullanın.
  2. Yumuşak render veya daha hızlı render için her 5 dilim için hücrenin her dilim üzerinde konturları Trace.
  3. İhracat son im300 dpi veya daha fazla bir çözünürlükte "anlık" aracını kullanarak yaşları.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sunulan yöntem epitel bir katman içinde belirli bir hücrenin ultra yapısını incelemek için kullanılmıştır. bu durumda ilgi hücre zor enteroendokrin hücresidir. Yerinde Onların kimlik sadece hücre spesifik floresan muhabiri farelerin gelişmesi ile son yıllarda mümkün olmuştur. 2011 yılında, hormon PYY'nin promotörü yeşil floresan protein 17 ekspresyonunu tahrik eden bir fare geliştirdi. Bu PyyGFP farede, ince bağırsak ve kolon distal kısmının enteroendokrin hücreleri kolayca UV ışığı altında ayrılır. Bu fare modeli, enteroendokrin hücre ihtiva eden bir doku bloğu tanımlamak ve SBEM için işlemek için bir olanak sağlamıştır. korelasyon yöntemi cocem3D burada adlandırılır ve daha önce yayınlanmış protokolleri 10,11 üzerine inşa edilmiştir.

Doku bloğu boyutlarını en iyi duruma getirme korelasyon için önemlidir. Ön deneylerde,Bu ilgi, hücrenin tüm vücudu kaplayan sırasında doku bloğu 300 um uzunluğunda ve 50 um kalınlığında SBEM görüntü sayısı en aza indirilmiş olduğu tespit edilmiştir. Şekil 1A, bir titreşimli bıçak microtrome kullanarak diseksiyon Bir Bakış göstermektedir Doğru boyutlara sahip doku bloğu edinin. En az 100 blok ilgi bozulmamış hücrelere sahip olanlar almak için içlerinden sıralamadan önce elde edilir. Seçilen bloklar konfokal mikroskopi ve görüntü z-yığınları tarafından görüntülü optik her 1 mikron (Şekil 1B ve C) aralıklı. Şekil 1D fare ileumda bir enteroendokrin hücresinin hacmi render görünümünü göstermektedir. Bu tanınmış neuropod ~ 60 um için epitel hücreleri altında uzanır.

ilgi hücre tüm blok yüz bir SBEM görüntüsü ile konfokal z-yığınları ilişkilendirilerek bulunur. Sözgelimi, bir PyyGFP distal kolon bir blok burada sunulmuşturfare. Konfokal z yığınları (Şekil 2A) elde edildikten sonra, blok düşük erime agaroz ince bir tabaka (Şekil 2B) gömülüdür. Bu blok sonraki manipülasyon için gereklidir. Bu SBEM dilimleri ile optik dilim uygun olmaları için mümkün olduğu kadar düz bir blok yönünü muhafaza etmek önemlidir. Şekil 2C, bir temsili görüntüsü doku bloğu tüm yüzü gösterilir. Bu rakamın parçaları önceden Bohorquez ark yayınlandı. 2014 8. Bu sonradan hesap doku yerlerinden ve boyutları dikkate alınarak konfokal görüntü korelasyon. Şekil 2B açığa blok konfokal ve SBEM görüntünün bir kaplamasını göstermektedir ilgi, bizim hücrenin hassas konum.

Hücre tespit edildikten sonra, SBEM görüntüleme salgı vezikülleri ve diğer hücre organelleri tespit için yeterince yüksek bir çözünürlükte yapılır. veri seti diye sunulanblok görüntüleri her 70 nm çekildiği gibi yeniden piksel başına 7 nm'de görüntülendi. veri seti doku derinliği 45 mikron yayılan 643 fotoğraf içeriyordu. Birkaç mikron düşük büyütmede tüm blok yüzü ilk görüntüleme sırasında traş edilir. Ham SBEM veri seti .dm3 formatında edinilen ve sonraki kullanım için tiff dönüştürülmüştür. SBEM yığını ilgi sadece bölgeyi içeren Fiji yazılımı eklentisi "ekin (3D)" blok kullanılarak kırpılmış edildi. Bu volume rendering için gerekli RAM belleği miktarını azaltır. Hücre konumu ve salgı veziküller tarafından belirlenen ve Imaris yazılımı kullanılarak segmente edildi. 3 enteroendokrin hücre 3D render bir içeriyor Şekil.

figure-results-1

Şekil 1:. Korelatif konfokal mikroskopi (A) İş Akışı bir parça incelemekBir doku içine bağırsak dokusu 300 x 50 mikron kalınlığında blok. (B) doğru boyutlarda bir temsilci doku bloğu. Fare küçük bağırsak ile ilgili bu boyutların doku bloğu kolon 8 kript durumunda, yaklaşık 3 villi yayılan ya da dikkat edin. Ilgi konusu bir hücreyi ihtiva eden küçük bağırsak (C) bir tüy. Imaris yazılımını kullanarak 3D render (D) A konfokal z-yığın önemli bir neuropod bağırsak epiteli altında çalışan bir enteroendokrin hücre gösterir. Mavi = DAPI nükleer leke. Barlar = 10 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-2
Şekil 2: Seri blok yüz taramalı elektron mikroskobu (A) sele Konfokal görüntü.Çevrede PyyGFP enteroendokrin hücreleri (yeşil) içeren kolondan CTED doku bloğu. Blok konfokal mikroskobu ile görüntülenmiş sonra (B), daha sonra agaroz cam slaytlar kullanarak düşük erime düz gömülür. Agaroz doku bloğu gömülmesi sonraki manipülasyon kolaylaştırır ve sol köşede çentik sağ yönde SBEM içinde blok monte yardımcı olur. Bloğun yüzeyinin (C) SBEM görüntüsü. SBEM ile confocal verilerin (D) Korelasyon faiz (beyaz ok) hücreyi tespit etmek. C ve bu rakamın d görüntüleri Bohorquez ark. Değiştirilmiş olan 2014 8. Mavi DAPI nükleer leke =. Barlar = 10 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-3
Şekil 3:. Imaris yazılımını kullanarak enteroendokrin hücresinin Veri 3D render (A) Ses render. Hücre salgı veziküller ile dolu bir neuropod içeriyor. Bir enteroendokrin hücresinin ultrastrüktürü tam bir açıklaması için, Bohorquez ve diğ., 2014 8 başvurun. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gastrointestinal chemosensation biyomedikal araştırmalarda heyecan verici yeni bir alan olarak ortaya çıkmaktadır. Bunun nedeni enteroendokrin hücrelerinde 18 fonksiyonel tat reseptörlerinin keşfine büyük bir parçası olduğunu. Daha sonraki çalışmalar, enteroendokrin hücreler karbonhidratlar, yağlar, amino asitler ve 5,6,19,20 içeren besin, özel reseptörlerini ifade olduğunu göstermiştir. Bu keşiflerin katalitik etken enteroendokrin hücreler, flüoresan 20 etiketli olan raportör farelerin geliştirilmesi olmuştur. Distal ince bağırsak ve kolon 17,21 enteroendokrin hücreleri incelemek için, bu farelerde biri PyyGFP fare geliştirdi. Tokluk 22,23 indükleyicileri, her ikisi de PYY ve glukagon-benzeri peptid 1, salgılayan çünkü bu hücreler, ilgi çekicidir. Anda, bu hücrelerin tam bir ultra-yapısal hesap biz onların sinyal mekanizmaları anlamak için gerekli olduğuna inanıyordu ki, eksik oldu.

"ontent> Burada SBEM ile konfokal mikroskopi köprü görsel bir yöntem tarif. yöntem bize enteroendokrin hücrelerinin tam ultrastrüktürünü belgelemek için. Biz bu hücrelerin üç içeren bir neuropod sahip olduğunu bildirmiştir izin Cocem3D olarak adlandırılır Hücreleri enteroendokrin bu neuropods fiziksel olarak nöronlara bağlanmak olsa salgı veziküllerin 8 tüm dörtte. neuropod içinde nörofilament ve nöronal akson gibi çok var, neuropods enterik glial hücreler 8 ile beslenir. Daha da önemlisi, o bağırsak innerve ve Kolon 9.

Cocem3D güçlerinden biri sadeliği olduğunu. Konfokal tarafından görüntülenmiş ve SBEM bir doku içinde belirli bir hücre belirlenmesini kolaylaştırır edilebilir bir bloğa doku örneği azaltılması. Salgı keseleri ve diğer organeller 7 nm / piksel çözünürlükte kolaylıkla tespit edilebilir. SBEM bölümler atılır için, başka süreçproteinlerin belirli dokuların şarkı, bu noktada bir seçenek değildir. Bununla birlikte, bu doku bloğu kesitleri muhafaza edildiği atum 24 gibi yöntemlerinin geliştirilmesi, hücre spesifik proteinlerin tanımlanmasını sağlamak olasıdır. Enteroendokrin hücreleri beyinde bağırsak ve tokluk gıda arasında duyusal bir arayüz olduğundan enteroendokrin hücreleri üzerinde kimyasal-duyusal reseptörleri belirli bir konuma belirlenmesi, obezite için ilaç tedavilerinin geliştirilmesi için gerekli bilgilerdir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr. Satish Medicetty çalışanı ve Renovo Sinir Inc% 100 maaş alır; Ancak, bu veri paylaşımı ve malzemelerde vallahi politikalarına yazarın bağlılığını değiştirmez. Çıkar çatışması kalan yazarlar için ilan edilir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aşağıdaki kişilere içten takdirlerimizi sunarız: Duke Işık Mikroskobu Çekirdek Tesisi'nden Dr. Sam Johnson ve Benjamin Carlson'a veri görselleştirme yazılımı konusundaki yardımları için ve Kuzey Carolina Eyalet Üniversitesi Elektron Mikroskobu Merkezi'nden Bayan Valerie Lapham ve Dr. John M. Mackenzie, Jr.'a elektron mikroskobu konusundaki tavsiyeleri için. Editöryal yardımı için Dr. Elaine B. Bohórquez'e teşekkür ederiz. Yazarlar şu şekilde katkıda bulundular: DVB, SM ve RAL deneyler tasarladı ve verileri analiz etti. DVB deneyler gerçekleştirdi ve FH verilerin manuel olarak işlenmesini gerçekleştirdi. SM, SBEM verilerinin elde edildiği Renovo Neural'ın direktörüdür. DVB taslağı yazdı ve tüm yazarlar son taslağı gözden geçirdi ve düzenledi. Bu çalışma, NIH hibeleri R01DK091946 ve Gazi İşleri hibe I01BX002230 RAL'a ve F32DK094704 da DVB'ye hibe ile desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Heparin sodyum tuzu
Sigma158127%4, PBS'de taze yapılmış, nihai pH 7.4
GluteraldehitSigmaG5882
Diş balmumuElektron Mikroskobu Bilimleri72660
Düşük erime noktalı agarozYaşam teknolojileri16520-100%5, PBS Standardında taze üretilmiştir
Doku-Tek Kriyokalıp ElektronMikroskobu Bilimleri62534-25
DAPI  nükleer lekeYaşam teknolojileriD1306
Sonradan yüklenmiş cam slaytlar ve lameller Güzel sanatlar
boya fırçası #1
Kakodilat tamponuElektron Mikroskobu Bilimleri11650
Tanik asitElektron Mikroskobu Bilimleri21700
EMbed 812 kiti ve nbsp;Elektron Mikroskobu Bilimleri14120
Sıvı ayırıcı ajan Elektron Mikroskobu Bilimleri70880
Sıvı gümüş kolloidal     Elektron Mikroskobu Bilimleri12630
CircuitWorks iletken epoksi   ITW ChemtronicsCW2400
Değişken akışlı peristaltik pompaVWR70730-064
VT1200S Titreşimli bıçak mikrotomuLeica
Zeiss 780i konfokal mikroskopCarl Zeiss 
Sigma VP Taramalı Elektron Mikroskobu Carl Zeiss 
3view sistemiGatan
Renovo Neural Inc (Cleveland, OH)http://www.renovoneural.comRenovo 3d EM hizmetleri sağlar
Fiji yazılımıAçık erişim yazılımı
16 GB veya daha fazla
Veri görselleştirme yazılımı Imaris 7.5 Bit düzlemi
10010023 fosfat tamponlu salin Yaşam teknolojileri Sigma H4784 Paraformaldehit RAM'e sahip bilgisayar istasyonu

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 314, 1-340 (1986).
  2. Smith, C. L., et al. Novel cell types, neurosecretory cells, and body plan of the early-diverging metazoan Trichoplax adhaerens. Current biology : CB. 24, 1565-1572 (2014).
  3. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS biology. 2, e329(2004).
  4. Engelstoft, M. S., et al. Seven transmembrane G protein-coupled receptor repertoire of gastric ghrelin cells. Molecular metabolism. 2, 376-392 (2013).
  5. Chandra, R., et al. Immunoglobulin-like domain containing receptor 1 mediates fat-stimulated cholecystokinin secretion. The Journal of clinical investigation. 123, 3343-3352 (2013).
  6. Wang, Y., et al. Amino acids stimulate cholecystokinin release through the Ca2+-sensing receptor. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300, G528-G537 (2011).
  7. Rogers, G. J., et al. Electrical activity-triggered glucagon-like peptide-1 secretion from primary murine L-cells. The Journal of physiology. 589, 1081-1093 (2011).
  8. Bohórquez, D. V., et al. An enteroendocrine cell-enteric glia connection revealed by 3D electron microscopy. PloS one. 9, e89881(2014).
  9. Bohórquez, D. V., et al. Neuroepithelial circuit formed by innervation of sensory enteroendocrine cells. The Journal of clinical investigation. , (2015).
  10. Knott, G. W., Holtmaat, A., Trachtenberg, J. T., Svoboda, K., Welker, E. A protocol for preparing GFP-labeled neurons previously imaged in vivo and in slice preparations for light and electron microscopic analysis. Nature protocols. 4, 1145-1156 (2009).
  11. Deerinck, T., Bushong, E., Thor, A., Ellisman, M. NCMIR methods for 3D EM: a new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. , University of California. San Diego San Diego, CA. (2010).
  12. Bohórquez, D. V., Chandra, R., Samsa, L. A., Vigna, S. R., Liddle, R. A. Characterization of basal pseudopod-like processes in ileal and colonic PYY cells. Journal of molecular histology. 42, 3-13 (2011).
  13. Nilsson, O., et al. Distribution and immunocytochemical colocalization of peptide YY and enteroglucagon in endocrine cells of the rabbit colon. Endocrinology. 129, 139-148 (1991).
  14. Mizuhira, V., Futaesaku, Y. New fixation method for biological membranes using tannic acids. Acta Histochem Cytochem. 5, 233-236 (1972).
  15. Reymond, O. L., Pickett-Heaps, J. D. A routine flat embedding method for electron microscopy of microorganisms allowing selection and precisely orientated sectioning of single cells by light microscopy. Journal of microscopy. 130, 79-84 (1983).
  16. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature. 9, 676-682 (2012).
  17. Bohórquez, D., Chandra, R., Samsa, L., Vigna, S., Liddle, R. Characterization of basal pseudopod-like processes in ileal and colonic PYY cells. J Mol Histol. 42, 3-13 (2011).
  18. Jang, H. J., et al. Gut-expressed gustducin and taste receptors regulate secretion of glucagon-like peptide-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 15069-15074 (2007).
  19. Liou, A. P., et al. The G-protein-coupled receptor GPR40 directly mediates long-chain fatty acid-induced secretion of cholecystokinin. Gastroenterology. 140, 903-912 (2011).
  20. Reimann, F., et al. Glucose sensing in L cells: a primary cell study. Cell metabolism. 8, 532-539 (2008).
  21. Bohorquez, D. V., Liddle, R. A. Axon-like basal processes in enteroendocrine cells: characteristics and potential targets. Clinical and translational science. 4, 387-391 (2011).
  22. Batterham, R. L., et al. Gut hormone PYY(3-36) physiologically inhibits food intake. Nature. 418, 650-654 (2002).
  23. Flint, A., Raben, A., Astrup, A., Holst, J. J. Glucagon-like peptide 1 promotes satiety and suppresses energy intake in humans. The Journal of clinical investigation. 101, 515-520 (1998).
  24. Hayworth, K. J., et al. Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits. Frontiers in neural circuits. 8, 68(2014).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Konfokal MikroskopiSeri Blok Y zey Taramal Elektron MikroskopiEnteroendokrin H crelerPeptit YY GFP FareDoku G mmeRe ine nfiltrasyonu3B Ultrayap Olu turmaSalg Vezik l Tan mlamaN ropod G rselle tirmeKorelatif I k Elektron Mikroskopi

İlgili makaleler