Ozmotik implantasyonu Pompalar ve Sistem izleyicilerin teslim fizyopatolojik Koşullarında Beyin Reorganizasyon Çalışması için

Özet

Patolojik koşullar altında beynin yeniden düzenlenmesini incelemek için, kan beyin bariyerini atlayarak beyne doğrudan protein iletimi için miniozmotik pompalar kullandık. Daha sonra proteinin etkisi altında beyin bağlantısındaki değişiklikleri incelemek için kanal izleyicileri enjekte edilir.

Özet

Serebral hastalığın hayvan modellerinde farmakolojik tedavi, hayvanlarda strese neden olabilecek ve ilacın kalıcı olmayan doku seviyelerine neden olabilecek tekrarlanan enjeksiyon protokolleri sorununu ortaya çıkarır. Ek olarak, beyne ilaç dağıtımı, kan beyin bariyeri (BBB) nedeniyle hassastır, bu nedenle sistemik uygulamadan sonra seçici ilaçların intraserebral konsantrasyonlarını önemli ölçüde azaltır. Bu nedenle, hem pik seviyeleri olmadan sürekli ilaç verilmesine hem de BBB'nin atlatılmasına izin veren bir sistem, BBB'ye geçirimsiz olan yeterince yüksek intraserebral ilaç konsantrasyonları elde etmek içindir. Bu bağlamda, miniozmotik pompalar, hayvanlarda günlük enjeksiyon stresi sorununu ortadan kaldıran ve ilaçların doğrudan beyin iletimi için de kullanılabilen, bilinen sabit bir oranda sürekli ilaç dağıtımı için ideal bir sistemi temsil eder. Burada, bu tekniği başarılı bir şekilde uygulamak için hayvanlara verilmesi gereken miniozmotik pompa implantasyonu ve ameliyat sonrası bakım için bir yöntem tarif ediyoruz. Yukarıda bahsedilen deneysel paradigmayı, C57BL6 farelerinin beynindeki nöroplastisiteyi incelemek için kullanılan standart prosedürlere yerleştirdik. Bu nedenle, hayvanları 30 dakikalık beyin enfarktüsüne maruz bıraktık ve plastisite yanlısı bir ilaç vermek için bir kanül aracılığıyla kafatasına bağlanan miniozmotik pompalarla implante ettik. Tedavi süresinin 30 günü boyunca davranış testi yapıldı. Çıkarıldıktan sonra, hayvanlara, iyileşmenin kronik fazında nöronal plastisiteyi analiz etmek için anterograd sistem izleyicileri enjeksiyonları yapıldı. Sonuçlar, verilen ilacın nöroproteksiyonuna, hedef yapılarda beynin orta hattını geçen motor liflerde artışın eşlik ettiğini gösterdi. Sonuçlar, modern sinirbilimde ilaç uygulaması ve beyin plastisitesi çalışmaları için bu tekniklerin değerini doğrulamaktadır.

Giriş

Proteinlerin ve farmakolojik bileşiklerin beyne verilmesi, beyin hastalıklarının altında yatan mekanizmaları incelemek ve yeni tedaviler için aday molekülleri değerlendirmek için önemli stratejilerdir ^1,2. Deneysel sinirbilimde, plazmitler veya adenovirüsler gibi vektörlerin verilmesi, beyindeki proteinlerin uzun vadeli etkilerini incelemek için önemli bir araç haline gelmiştir ^3,4. Tek vektör enjeksiyonları, beyindeki terapötik ajanın kendi başına oldukça stabil seviyelerini koruyacak bir sistemin avantajını sunar ⁴. Bununla birlikte, saflaştırılmış ilaçlarla yapılan uzun süreli deneyler için, intraperitoneal enjeksiyon yoluyla sistemik uygulama, farelerde veya sıçanlarda strese neden olur ve ayrıca yüksek dozlarda ilaç⁵ gerektiren, hedeflenen bir beyin tepkisi gerektiğinde en iyi seçim değildir. Miniozmotik pompalar, ilacın verilmesi doğrudan beyinde hedeflenen bir yere ve seçilen pompa modeli tarafından belirlenen sabit bir akış hızında gerçekleştiğinden, hem beyne düşük erişilebilirliği hem de ilaç konsantrasyonunun zirvelerini atlatarak beyne uzun süreli doğrudan ilaç iletimi için ideal bir sistemi temsil eder^2,6,7. Gerçekten de bu sistem, rekombinant insan eritropoietin (rhEpo) ve vasküler endotelyal büyüme faktörü ^6,7 gibi çeşitli ilaçların verilmesiyle inme sonrası beyin iyileşmesini başarılı bir şekilde incelememize izin verdi.

Beyin plastisitesi, beyin yaralanmalarına yanıt olarak bağlantıların yeniden kablolanması için gereklidir. Plastisite, sinaptik temasların oluşumu veya ortadan kaldırılması, dendritik dikenlerin büyümesi ve ayrıca uzun mesafeli bağlantıların uzaması veya geri çekilmesinden oluşan geniş bir kavramdır^8,9. Beynin daha önce bir lezyondan sonra bağlantıları yeniden yapılandırma yeteneğine sahip olmadığına inanılıyordu. Bununla birlikte, birçok yaklaşım, uygun şekilde uyarılırsa, bağlantıyı yeniden kurabileceğini göstermiştir ^6,7,10. Bunu incelemek için özellikle yararlı olan bir teknik, yol izleyicilerinin kullanılmasıdır. Anterograd yol izleyicileri, somadaki nöronlara girebilen ve daha sonra bunlar hedef yapılarına ulaşana kadar aksonlar boyunca dağılabilen bileşiklerdir. İki örnek, kaskad mavisi (CB) ve biyotinile edilmiş dekstran amindir (BDA). Tersine, kolera toksin B (CTB) veya florogold (FG) gibi retrograd yol izleyicileri, akson terminalinden nörona girer ve daha sonra soma'ya geri dağıtılır, böylece enjeksiyon bölgesini hedefleyen nöronların köken bölgesini ortaya çıkarır.

Burada, nöral plastisite üzerinde potansiyel etkileri olan proteinlerin veya ilaçların doğrudan verilmesi için miniozmotik pompaların implantasyonu için kullandığımız yöntemleri ve motor kortekse giriş ve çıkış bağlantılarını ortaya çıkarmak için BDA ve FG enjeksiyonunu sunuyoruz. BDA ayrıca, rhEpo tedavisi altında inme sonrası ko'dan çıkan aksonların artmış plastisitesini göstermek için kullanılan bir yol izleyicinin bir örneği olarak kullanılacaktır.

Protokol

Hayvan deneyleri hükümet onayı ile yapıldı (G1361 / 13, AZ84-02.04.2013.A192 ve G1362 / 13, AZ84-02.04.2013.A194; Bezirksregierung Düsseldorf) Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım NIH Rehberi dayalı.

1. Hazırlık, mini-ozmotik pompalar ve

1. Steril bir ortamda (yani., Hücre kültürü davlumbaz), pompa, kateter elde moderatör, beyin infüzyon kanülü ve aralayıcı diskler kullanılabilir (Şekil 1) akar.
2. Kanül iğnenin sadece ucu ventrikül ile temas halindedir ve böylece doğrudan ventriküller içine ilaçların verilmesi için tek bir boşluk disk kullanın. Baş aşağı forseps ile kanül tutun. Siyanoakrilat yapıştırıcı (CA) iki damla ekleyin ve bir boşluk diski tanıtmak.
3. Yukarı bakacak şekilde düz bir yüzeye kanül bırakın, böylece boşluk disk ve kanül kurudukça arasındaki tutkal.
4. Yaklaşık 2.5 cm bölümlerinde kateter kesilir.
5. Ea içinBu kateter içinde kabarcıkların oluşumunu önlemek için bunun içinde tamamen ve böylece tüm havayı ekstrüzyon pompa doldurmak için gerekli olacak kadar kanal pompası, ilgi konusu çözeltinin 300-350 ul az hazırlar. Kabarcıklar akışını engelleyecektir beyin içine çözeltisi.
6. Dikkatle akış moderatörlüğe kateter bağlayın.
7. Çözeltinin az miktarda, böylece bunun içindeki hava kabarcıklarını önlemek, pompa çıkana kadar beyin infüzyon kiti tarafından sağlanan iğnesine bağlanır 2 ml'lik bir şırınga kullanarak, pompa doldurun.
8. Dikkatle akış moderatör doldurup dikkat kateter kateter içinde kalan kabarcıklarını engellemek için.
9. Pompa içindeki akış moderatör tanıtın.
10. Doldurulduktan sonra, dikkatli bir şekilde kateterin ucuna kanül bağlayın. Bir kabarcık kanül çıkarın ve dikkatli bir şekilde taşıyıcı veya ilaç solüsyonu ile kateter dolum ve daha sonra kanül yeniden gündeme oluşturulduğu görülmektedir edin.
11. Pu yerleştirinSteril tuzlu su çözeltisi ile bir kapta mp ve 37 ° CO / N de bırakın.
12. Implantasyon öncesi kabarcık oluşumu için tekrar kontrol edin. Gerekli (yani., Kabarcıklar izlenir) Eğer kanül kaldırmak ve tüp dolum. Kanül takın. Bu çözeltinin bir kaç mikrolitre almalıdır.

Ozmotik 2. implantasyonu Pompalar

Not: Bu deneyler hayvanların% 1 izofluran (% 30 _O 2,% 70 _N 2 O) ile anestezi yapıldı için. Bu mevcut değildir ancak eğer anestezi intraperitoneal kullanımı da ¹¹ mümkündür.

1. Anestezi altında stereotaktik cihazda hayvan bulun ve anestezi altında iken kuruluğu önlemek için koruyucu bir merhem ile gözleri kapsamaktadır. Parmaklarla ya da bir forseps ile basıldığında arka ayağın içinde yanıt eksikliği gözlemleyerek anestezi onaylayın. Hayvan tamamen uykuda kadar devam etmeyin.
2. O aşkın kürk Cutmakas veya tıraş makinesi ile ya reklam. Cilde zarar vermeden mümkün olduğunca kesin.
3. Antibakteriyel ve fungisit özelliklere sahip% 70 etanol ve dezenfektan ile cildi temizleyin.
4. Bir neşter ile orta hatta biraz sağında 1 cm'lik kesi açıp kafatası maruz.
5. Bir pamuklu çubuk ile kafatası temizleyin. % 70 etanol ile ıslatın ve kafatası üzerinde geçmek. Bu kafatası kurumaya neden olacaktır.
6. Kafatası ışığı kanaması varsa, herhangi bir kanama noktaları ortadan kaldırmak için bir cauterizer kullanın. Kan kanül yerleştirilir kez kemik üzerinde düzgün kurumasını CA önler.
7. Kanül implante edilecek kafatası noktasında bir işareti yapmak için stereotaktik aygıtı kullanın. Sol hemisfer koordinatlarına ventriküler infüzyon için -0.2 mm kaudal, bregmaya 0.9 yanal mm (Şekil 2A) bulunmaktadır.
8. Yavaşça 45 ° açı yaparak kafatası üzerinde matkap; Bu kazayla Brai girmesini engeller matkapn. Tekrar tekrar birkaç saniye matkap ve sonra delik ne kadar derin olduğunu kontrol edin. Kafatası inceltilmiş ama hala tam olarak nüfuz değil edildikten sonra sondaj durdurun.
9. Beyin tamamına erişim elde edilene kadar steril bir iğne ucu ile meninks kırın. Beyin zarar vermeyecek şekilde yavaşça çekin.
10. Bir pamuklu çubuk kullanarak% 70 etanol ile kafatası temizleyin.
11. Bir ön-kaudal yönde hayvanın derisinin altına düz bir forseps tanıtın. Pompa implante edilecek hayvanın sırtına deri altına alan açmak için forseps kullanabilir. Dış kateter ve kanül (Şekil 2B) ayrılan hayvanın sırtına Pompayı tanıtılması. Kaldırılır ve tespitin her türlü ihtiyacı yoktur kadar pompa bu konumda kalacaktır.
12. Dikkatle sonraki kanül iğne tutkal dört küçük damla koyun.
13. Dikkatle yanlara doğru hareket ettirmeden kafatası yoluyla iğne tanıtmak. 15-30 saniye konumda tutun uKanül, tamamen bağlı ntil (Şekil 2C.1). Bir ara disk kullanılmış ise bir kez yerinde, kanül dorso ventral yönde 2.5 mm ulaşacak. Düzgün takılı ise, kanül deneyin sonuna kadar kemiğe bağlı kalacaktır.
14. Çıkarılabilir sekmesinin üzerine bir parmağınızı yerleştirin ve sonra makas bir dizi (Şekil 2C.2) ile boynundan kesti diğer elinizi kullanın.
15. 5-0 sütür ile cilt üzerinde yara kapatın ve (Şekil 2D) enfeksiyonunu önlemek için yara üzerine povidon-iyot çözeltisi (PVP-I) ve bir kaç damla ekleyin.
16. Yeni kafes içine hayvan taşıyın. Hala ameliyat edilmemiş hayvanlara ameliyat hayvanları koymayın. İlaç uygulamaları sırasında kafeslerine yalnız pompalarla implante edilmiş hayvanları tutun.
17. Onlar uyanık ve sternum yatma kazanmış kadar sahipsiz fareler bırakmayın.

3. Pompa Removablel

Not: Genellikle deney pompası tarafından izin verilen teslimat süresi sonunda sona erecek, ancak bir uyuşturucu teslim takip olarak ikincil deneyler yapmak için pompayı kaldırmak mümkündür. Yolu izli enjeksiyonları yapmak için bu pompayı kaldırmak ve böylece gereklidir.

1. Anestezi altında seterotactic cihazda hayvan koyun ve anestezi altında iken kuruluğunu önlemek için koruyucu merhem gözleri kapsamaktadır. Parmaklarla ya da bir forseps ile basıldığında arka ayağın içinde yanıt eksikliği gözlemleyerek anestezi onaylayın. Hayvan tamamen uykuda kadar devam etmeyin.
2. Dikkatle pompa implantasyon gününde yapılan kesiden keserek cilt açın.
3. Cerrahi kelepçe ile kanül tutun ve çekin. Kolayca kafatası çıkarılmalıdır. Nazik kanama beklendiği gibi, bir pamuklu çubuk yerleştirerek onu durdurmak ve 1-2 dakika bekleyin.
4. Kateter pompayı dışarı çekin. Kendisio iterek cilt üzerinde baskı oluşturarak çıkıp lp.
5. 5-0 sütür ile tekrar yara kapatın ve PVP-I birkaç damla ekleyin.
6. Yeni kafes içine hayvan taşıyın. Do hala ameliyat edilmemiş hayvanlara ameliyat hayvanları koymak değil. Ameliyat geçiren hayvanlar bir araya getirilebilir.
7. Onlar uyanık ve sternum yatma kazanmış kadar sahipsiz fareler bırakmayın.
8. Hayvan yolu tracer enjeksiyonundan geçmeden önce 10 gün boyunca kurtarmak için izin verin.

Sağ Motor cortex 45 ° Açılar at 4. Basınç Yolu Tracer Enjeksiyon

1. Anestezi altında stereotaktik cihaz üzerinde hayvan koyun ve anestezi altında iken kuruluğu önlemek için koruyucu bir merhem ile gözleri kapsamaktadır. Parmaklarla ya da bir forseps ile basıldığında arka ayağın içinde yanıt eksikliği gözlemleyerek anestezi onaylayın. Hayvan tamamen uykuda kadar devam etmeyin.
2. Baş yara açın.
3. C% 70 Etanol bir pamuklu bir bez kullanarak kafatası yalın.
4. Cihazın dikey tutucu bir 5 ul cam şırınga (26S ga) tanıtın. Cam tutucu alt uç tutucu parçasına tam olduğundan emin olun. O zaman dikey konumdan 45 ° yerleştirin ve enjeksiyon yapmak imkansız olacak gibi şırınga çok altında olmamalıdır.
5. Bregma üzerinden doğrudan şırınga yönlendirmek ve ardından istediğiniz koordinatları bulun. Point # 1: 0,5 mm rostral ve 2,5 mm bregma göre yanal motor korteks koordinatları bir enjeksiyon içindir. Point # 2: 1,34 mm rostral, bregma göre 2,5 mm yanal.
6. Koordinatları bulunduktan sonra, ince bir ucu ile bir işaretleyici ile kafatası üzerinde konumlarını gösterir. Doğru koordinat gizlemek olabilir aşırı mürekkep sürümü olarak kafatasında tek bir nokta yapın.
7. Dikkatle 45 ° matkap tutan kafatası matkap. Tam perf değildir, böylece adım 2.8 olduğu gibi, sık kafatası kontrolmatkap yol açtığı beyin hasarı önlemek için orated. Tüm kemik kaldırıldı emin olmak için bir şırınganın ucu kullanın.
8. Şırıngaya yolu izleyici seyreltme 600 nl yükleyin.
9. Hayvanın sağ tarafına doğru 45 ° dikey konumunu ayarlar. Mikroskop altında, sağ deliğin önünde şırınga en iğne ucu yerleştirin.
10. 1,5 mm dikey yönde hareket ettirin. Basınç enjeksiyonları yapmadan önce 30 saniye ile 1 dakika boyunca bu pozisyonda iğne istikrarlı edelim.
11. 30 saniye süre ile birbirinden ayrılmış 100 nl üç adımda izleyici seyreltme 300 nl enjekte edilir. Son enjeksiyondan sonra beyin akmaya izleyici önlemek için 30 saniye ile 1 dakika için sürekli şırınga bırakın.
12. Yavaşça, şırıngayı çekin ikinci deliğin üzerine taşınmaya ve şırınga içinde olan, kalan 300 nl aynı işlemi tekrarlayın.
13. İkinci enjeksiyondan sonra, şırınga kaldırmak ve Wou kapatmak için devamnd ve 5-0 sütür ile PVP-I birkaç damla ekleyin.
14. Yeni kafes içine hayvan taşıyın. Do hala ameliyat edilmemiş hayvanlara ameliyat hayvanları koymak değil. Ameliyat geçiren hayvanlar bir araya getirilebilir. Onlar uyanık ve sternum yatma kazanmış kadar sahipsiz fareler bırakmayın.
15. Hayvan kurban önce 10 gün boyunca kurtarmak için izin verin.

5. Yolu Tracer Gözlem

1. Kurumsal kurallarına göre tamamen hayvan anestezisi. Parmaklarla ya da bir forseps ile basıldığında arka ayağın içinde yanıt eksikliği gözlemleyerek anestezi onaylayın. Hayvan tamamen uykuda kadar devam etmeyin.
2. Standart protokoller ⁶ altında PBS içinde% 4 paraformaldehid (pH 7) ile hayvanların serpmek.
3. % 4 paraformaldehid O / N daldırma yoluyla beyin ve sonrası düzeltme onu kaldırın.
4. Beyin lavaboya kadar% 30 sakaroz olarak beyinleri cryoprotect. Sonra beyinleri çıkarın ve 10 saniye Imme onları dondurmaksıvı nitrojen içinde rsion. Bölümler üretilmektedir kadar -80 ° C'de beyinleri tutun.
5. Bir cryostate üzerinde kesit ile retrograd yolu tracer analizi ve anterograde yolu izleyici analizi için 40 mikron 20 mikron de bölümleri üretin.

Not: FG etiketli nöronlar ultraviyole ışık uyarma altında beyaz hücreler olarak görülebilir. BDA elyaf ^6,7 kontrastının arttırılması için bir avidin-biyotin-peroksidaz kompleksi ve% 0.4 nikel ilavesiyle 3,3 'diaminobenzidin ile O / N içerikli inkübasyon ile tespit edilir.

Sonuçlar

Biz 3 gün sonra başlayan 30 gün boyunca ozmotik pompalar (Şekil 1, Şekil 3) vasıtasıyla doğrudan beyne rhEPO teslim sonra sol striatum lezyon ve uyaran intraluminal sütür yöntemiyle orta serebral arter tıkanıklığı 30 dakika hayvanların teslim strok ^6. Şekil 4 CB ve BDA enjeksiyonu ve izleyiciler enjekte edildi alana sonrasında takip edildi kortiko spinal kanalın şemasını göstermektedir. Biz sırasıyla rhEPO teslimat 14 ve 42 gün sonra kavrama gücü ve motor performansı (Şekil 5) bir iyileşme gösterdi. Sol striatum bir inme alınan hayvanların sağ motor korteksin içine BDA teslim olarak lifleri çimlenme başarılı boyama gösteren kırmızı ve yüz çekirdek düzeyinde orta çizgiyi motor lifler bir artış (Şekil 5) gösterdi miniosmot ile farmakolojik bir tedavi sonucuic pompalar. rhEPO tedavisi de yaygın astrositoz gecikmiş nöronal hayatta kalma artmış glial skar oluşumu azalır ve çalışılan dönemde ⁶ anjiyogenez arttı. Yolu izleyici enjeksiyon için aynı tekniği kullanarak başarılı retrograd yolu izleyici FG enjeksiyonu (Şekil 6) tarafından korteks bağlı talamik çekirdekleri algılayabilir.

Şekil Bu protokolde kullanılan mini-ozmotik pompa 1. Bileşenleri. Aralama disk, kanül ve çıkarılabilir sekme, kateter, akış moderatör ve mini-ozmotik pompa görülebilir. Tam olarak monte pompa yönü Şekil 2A görülebilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

ithin-page = "1">
Pompa implantasyonu kilit noktaları 2. Özeti Şekil. Yanında tam olarak inşa, mini-ozmotik pompa ile stereotaktik cihaz yerleştirilir (A), fare gösterilmiştir. Ok implantasyonu için seçilen koordinatları gösterir. (B) pompa hayvanın sırtında tanıttı ve sadece kanül dış yüzeyinde kalır edilmiştir. İmplantasyondan sonra baş kafatası önceden delinmiştir. (C) boy. (C.1) kanül konumuna ancak çıkarılabilir sekme kesilmiş edilmemiştir. (C.2) çıkarılabilir sekme kesilmiş ve dikiş arasında olmuştur Yara hemen başlayabilir. (D) yıldız 30 gün implantasyon (#) sonra, bir hayvan ile karşılaştırıldığında, bir son implante hayvan gösterir. Doğru yer zaman görüntüde gösterildiği gibi, yara prosedürü sonuna kadar kapalı kalmalıdır.ove.com/files/ftp_upload/52932/52932fig2large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3. korteks üzerinde implantasyon siteyi gösteren Nissl boyama. Küçük bir kesi, sol korteks (ok) kısmında görülebilir. Nüfuz alanının genişliği yaklaşık 50 mm. Karşılık gelen karşı taraftaki bölgede (*) ile karşılaştırıldığında Nissl boyama göre belirgin bir ciddi doku değişiklikler vardır. R: Sağ hemisfer. L: Sol yarım küre. Ölçek çubuğu = 300 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4. YoluReitmeier ve ark., ^6,7 ile daha önce yayınlanmış olan izleyici enjeksiyon stratejisi. (A) CB ise kontralateral motor korteks de yolu izleyici BDA için şematik belirten enjeksiyon siteleri enfarkte yarımkürenin motor kortekste enjekte edildi. Lifler gösterilen kırmızı çekirdeğe (gösterilmemiştir) ve yüz çekirdeğe (Şekil 5). (B) aşağıdaki motor korteks anterograd yolu izleyici BDA enjeksiyon site takip edildi. Siyah ok BDA etiketli birkaç kortikal hücreler gösterir, oysa iğne izi gösteren kırmızı ok unutmayın. Cx: Cortex. CC: Korpus kallosum. V: Ventrikül. FN: Sakal çekirdeği. B Ölçek çubuğu = 200 mikron. Şekil 4A tür izni ⁶ çoğaltılamaz. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

RhEPO doğum sonrası enfarkte beyin Şekil 5. Kurtarma. (A) BDA contralesional motor korteks enjekte daha sonra yüz çekirdeğin seviyesinin (bregma -5.8 mm -6,3 mm) kortikobulbar lifleri tespit edilir. Her bir yarım küre üzerinde kesişme hatları orta hat ve ipsilesional ve contralesional yarımküre yönünde her satırı geçen liflerin paralel çizildi sayılır ve kortikospinal sistem toplam etiketlenmiş liflerin yüzdesi olarak ifade edildi. Araçlar + Eritropoietin contralesional yüz çekirdek Veri yönünde lif geçişleri arttı vardır - SD. Veriler en az önemli farklar testleri, §P <0.05 araçla tedavi edilen iskemik olmayan fareler ile karşılaştırıldığında. (B) motor davranışı rota çubuk testinde el kavrama gücü ve koordinasyon bir iyileşme göstermiştir ve ardından tek yönlü ANOVA ile analiz edilmiştir. Veriler ortalama valu vardıres + - SD. Veriler, her zaman noktası için tek yönlü ANOVA / en az önemli farklar testleri, ardından iki tekrarlı ölçümler ANOVA ile analiz edilmiştir. §P 5A ve B tür izni ⁶ ile yeniden üretilir Şekil. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 6. Hedef yapıları Fluorogold (FG) enjeksiyonundan sonra ulaştı. (A) motor korteksin yanında FG enjeksiyon sitesi Şekil 1'de gösterildiği gibi. İğne parça ve birkaç etiketli hücreleri gösteren beyaz ok gösteren kırmızı ok Not Korteks. (B) FG motora yakın enjektekorteks VPL saptanır. Fi: fimbria. IC: İç kapsül. RT: Talamik retiküler nükleus. VPL: Talamik ventral posterolateral çekirdek. Ölçek çubuğu = 200 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışma

Uzun yıllar boyunca, iskemik inme veya travmatik beyin hasarı gibi nörodejeneratif koşulları araştırma akut inme aşamasında nöronal canlılığı teşvik etmeyi amaçlamaktadır nöroprotektif tedavilerin geliştirilmesi üzerine odaklanmıştır. Kliniğe çevrilirken bulunmuştur ilaç tedavilerinin büyük çoğunluğu başarısız kemirgen modellerinde etkili olduğu bulunmuştur. Bu tedavi başarısızlığının nedenleri arasında, ancak fonksiyonel nörolojik iyileşme kalıcı sonuçlanan sürekli ilaç etkileri olmaması sınırlı değildir. Bu uzun vadede beyin yenileme teşvik stratejileri geliştirmek ve böylece önemlidir. Nöronal hayatta kalma promosyon yalnız başarılı inme kurtarma izin vermek için yeterli değildir, çünkü başarısız nöro çalışmaların çok sayıda tarafından önerilen, nöronal plastisite uyarılması son zamanlarda alanında büyük bir ilgi aldı.

Ilaç dağıtım olan intraperitoneal enjeksiyon, kuyruk intravasküler i için araçlarnjection femoral enjeksiyon, tek stereotaktik beyin içine vektörlerin enjeksiyon ve mini-ozmotik pompalar ile sabit teslim sürdürdü. Pompa bir kanül yoktur, ya da biz beyne teslimat için gösterdiği gibi, organı yönlendirilmiş edilebildiği takdirde ikincisi, sistemik teslimat içerebilir. Mini-ozmotik pompalar hariç ve viral vektörlerin kullanımı, tüm diğer stratejiler dalgalı ilaç konsantrasyonları neden olacaktır. Uzun süreli deneyler için böylece sıklıkla enjeksiyonlarını alan strese hayvan göndermek için gerekli olur. BBB beyinde terapötik konsantrasyonları elde etmek için büyük bir protein ya da ilaç dozlarına ihtiyaç sonuçlanan kan protein veya ilaçların beyne alınmasındaki için önemli bir engel getirmektedir. Örnek Pellegrini ve diğerleri için. 30 g (300 g bir fare için 750 IU / gün), bir hayvan için 75 lU / gün eşdeğer bir dozda intraperitonal enjeksiyon yoluyla rhEPO teslim (2013) ^5. Buna karşılık, rhEp teslim hedeflenenbeyne o bize 0,25 ul / saat sabit bir hızda büyük bir zaman ölçeği üzerinde iyileşme elde etmemizi sağladı başarılı inme kurtarma için çalışmamızda, sadece 10 IU / gün çok daha düşük dozda kullanmak için izin.

Bu çalışmada biz, böylece BBB engellemeyi, ventrikül içine doğrudan plastisite teşvik protein rhEPO sunmak için kafatasına bağlı bir kanül mini pompalardan implantasyon yöntemini göstermiştir. Bu yöntem ile, rhEPO enfarktüs boyutunun azaltılması, glial yara oluşumunun azaltılmasına ve anjiyogenez indüksiyonu da dahil olmak üzere, bir dizi yolla, nörolojik düzelme sağlamıştır. rhEPO da nöronal hayatta kalma terfi ve Denerve kırmızı çekirdek ve yüz çekirdekleri karşı contralesional motor korteks gelen projeksiyonlar yükselmiştir. Liflerin filizlenme motor korteks (Şekil 4A ve 5A) içine anterograd yolu izleyici BDA enjeksiyonuyla ortaya çıktı. Liflerin filizlenmesi için fonksiyonel bir korelasyon prmotor becerilerinin geliştirilmesi (Şekil 5B) tarafından ovided. Buna ek olarak, sistem izleyici enjeksiyon için aynı yaklaşım retrograd yolu tracer FG (Şekil 6B) enjeksiyonu ile talamo-kortikal bağlantıları meydana çıkarmak için uygulanabilir olduğunu göstermiştir.

Mini-ozmotik pompası hazırlanmasında, hedef noktası ve aralama kullanımını dikkate için kritik öneme sahiptir. Biz birlikte, 0.9 mm yanal, iğnenin çok uç verilen koordinatlarda ventrikül ile temas (-0.2 mm kuyruktaki bu yolla olduğu gibi 0.5mm 2,5 mm dorso ventral iğnenin uzunluğu azaltmak için bir ayırıcı kullanabilirsiniz Bregma saygı). Derin yapılar Araştırmanın hedefi olan ancak, daha sonra hiçbir pullar ihtiyaç duyulacaktır. Daha harici teslim noktası isteniyorsa Benzer şekilde, (yani., Korteks), daha sonra boşluk diskler gerekli olacaktır. Pompa kafasının çok yakın değildir bu yüzden MM'nin hareketlerini engelleyecektir kateter, yeterince uzun olmalıdırse, aynı zamanda çok uzun zaman olduğu gibi bir kez implante aşırı uzunluğu böylece fare doğal hareketi ile kanül çıkarılması riskini artıran, kateter eğilmesine neden olabilir. Kateterin 2 cm bir bölümü hareketlilik ve implantın stabilitesi (Şekiller 1 ve 2) açısından çok iyi sonuçlar vermektedir. 37 ° CO / N pompanın Kuluçka pompa hemen implantasyon anında beyine ilaç pompalamaya başlamanızı sağlar.

Mini-ozmotik pompa implantasyonu o kafatası düzgün kanül implante önce kurutulur sağlamak için kritik öneme sahiptir. Genellikle kuru kemik neden olacaktır% 70 Etanol ile temizlik, ama sürekli kanama tespit edilmesi halinde, bir cauterizer hafifçe kafatası dokunmadan tamamen kurur. Bu iğne giriş mümkün olduğu kadar dikey ve yavaş olduğundan emin olmak için önemlidir. Pozisyonda, ve tutkal kururken sonra, kanül üstünde parmak yerleştirme ov yanlara hareket etmesini önlerkafatası er. Özel bakım kanül yara ve yerleştirme verilmelidir. Bu kesi tam kafatasının orta hat üzerinde ama biraz sağ tarafında gerçekleştirilmez önemlidir. Yarayı kapatırken insizyon orta hattında yapıldığı takdirde, cilt ve böylece yara açılması riskini artırarak, overstretched olacaktır. Bir tarafa hafifçe kesi yaparak dikiş noktaları kanül en yüksek kesiminde uzak olmasını sağlayacaktır. Sonuç olarak orada dikiş noktaları daha az gerginlik olacak ve yara düzgün iyileşir. Hayvanlar yalnız kafesli ve özellikle implantasyon sonrası ilk 10-15 gün boyunca, her gün kontrol edilmelidir. Yara açılması durumunda, yaralar kısa sürede kapalı olması gerekir. Kanül çıkarılır veya hayvan enfeksiyon sunarsa, deney sonlandırılır için vardır. Kanülün yeniden implantasyonu tavsiye edilmez. Başarılı implantasyon doku reklamın yeterli miktarda kullanmak için çok önemlidirhesive (çok değil!) bu kemik alçaltır ve kanül çıkarılması riskini artırır olarak. Ancak, aynı zamanda kemiğe bağlı kanül tutmayacağını çok az yapıştırıcı kullanılarak. Mini-ozmotik pompalar Çözücü biyolojik olarak uyumlu olan, bu tek sınırlama olarak, maddelerin çeşitli içinde çözülmüş ilaç taşıyabilir. Buna ek olarak, hacim ufak olacak verilen (200 ul), bir deney için gerekli konsantrasyon uygun olup olmadığını tespit olmalı ve pompa içindeki çökelmesine neden olmaz.

Anterograd veya retrograd ya izleyiciler ile izleme Yolu beyin bağlantısı ve plastisite incelemek için çok iyi kurulmuş bir tekniktir. Tek incelemek istediği beyin alanı hedefleme doğruluğunu sağlamak için enjekte dikkatli kullanımı stereotaktik çerçeveler verilmelidir (korteks enjekte ederken, yani korpus kallosum üzerinde enjeksiyon engellemek için).

Tüm cerrahi müdahaleler için ve ağrıyı azaltmak için veinflamasyon, hayvanlar müdahaleden sonra üç gün / kg, günde bir kez 4 mg müdahale ve Caprofen önce 0.1 mg / kg Buprenorfin ile tedavi edilmelidir.

Sonuç olarak, bu yaklaşım, zamanda beyin plastisitesi çalışmalar için uygun olan bir yöntem temsil yaralı beyinde protein ya da farmakolojik bileşiklerin etkisini incelemek için uygun bir araç sağlar.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Alzet miniozmotik pompa. 2004 modeli.	Alzet	000298	İlaç kabı
Beyin infüzyon kiti 3 1-3 mm	Alzet	0008851	İlaç beyin dağıtım sistemi
Loctite  454 Prizma jel	Loctite	45404	Kafatasına kanül yapışması için siyanoakrilat yapıştırıcı
75N cam şırınga	Hamilton	87900/00	Kanal izleyicilerinin enjeksiyonu
Biotin Dekstran Amin (10.000 MW)	Moleküler problar	N-7167	Anterograd yol izleyici
Fluorogold	Fluorochrome, LLC.		Retrograd kanal izleyici
Quintessential Stereotaksik Enjektör (QSI)	Stoelting	53311	Koordinat belirleme, pompa implantasyonu ve kanal izleyici enjeksiyonu için stereotaktik cihaz.