Bu yakın homologları, Nor1 ve Nur77 karşı çapraz-reaktivite Nurr-1 spesifik olan poliklonal antikorlar Free üretimi

Özet

Burada, hayvanları en farklı bölgeleriyle bağışıklayarak ve ardından ön adsorpsiyonla çapraz reaktif antikorları çıkararak, yüksek oranda korunmuş bir protein ailesinin belirli bir üyesine karşı antikorları seçici olarak hedefliyoruz.

Özet

Nükleer reseptör alt ailesi 4 (NR4A), bir DNA bağlanma alanını (DBD) ve bir ligand bağlama alanını (LBD) paylaşan 3 ilişkili proteinden oluşur. Nükleer reseptörle ilgili 1 proteini (Nurr1 veya NR4A2), dopaminerjik sistemin korunmasında anahtar rol oynar. Nurr1 geni ile ilişkili dopamin fonksiyon bozuklukları arasında Parkinson hastalığı, şizofreni ve manik depresyon bulunur. Ayrıca, son kanıtlar Nurr1'in hipokampus gibi diğer beyin bölgelerinde de ifade edildiğini ve öğrenme ve hafıza için kritik roller oynadığını göstermektedir. Ailenin diğer üyeleri sinir büyüme faktörü IB (Nur77 veya NR4A1) ve nöron kaynaklı yetim reseptör 1'dir (NOR1 veya NR4A3). Nurr1'in dopaminerjik ve diğer beyin bölgesi ile ilgili nöronal disfonksiyonlardaki kesin fonksiyonel rollerinin araştırılmasına yardımcı olmak için, Nur77 ve NOR1'e karşı çapraz reaktivitelerden yoksun antikorlara ihtiyaç vardı. Proteinler LBD'lerinde DNA bağlanma alanlarından daha farklı olduğundan, saflaştırılmış LBD'lerle bağışıklama, Nur77 ve / veya NOR1'e karşı minimum reaktivite ile Nurr1'e özgü antikorlar vermelidir. Anti-Nurr1 antikorları başarılı bir şekilde üretilmesine rağmen, bunlar ailenin diğer üyelerine karşı önemli immünoreaktivite gösterdi. İmmobilize Protein A üzerinde afinite kromatografisi ve ardından immobilize Nur77 ve NOR1 LBD'lere karşı ön adsorpsiyon, çapraz reaktivite içermeyen Nurr1 spesifik antikorları verdi. Burada, hayvanları en farklı bölgeleriyle bağışıklayarak ve ardından ön adsorpsiyon ile çapraz reaktif antikorları uzaklaştırarak, yüksek oranda korunmuş bir protein ailesinin belirli bir üyesine karşı antikorları seçici olarak hedefliyoruz. Protokolün amacı, çapraz reaktif antijenlere karşı ön adsorpsiyon yoluyla poliklonal antikor özgüllüğünü arttırmaktır.

Giriş

Transkripsiyon faktörü Nurr1 ve homologları (Nur77 ve Nor1), nükleer reseptör alt ailesi 4A (NR4A) ¹ aittir. Onların endojen ligandlar henüz tespit edilmemiş çünkü onlar da yetim reseptörler vardır. Nurr1 ilk olarak 1992 klonlandı ve bilinen, ancak beyin ^{2'de belirtildiği} üzere, geliştirme ve orta beyin dopamin nöronlarının bakımı için de önemli bir rolü nakavt fare çalışmaları ³ konuldu. Buna ek olarak, orta beyin dopamin nöronlarının bakım için çok önemli bir rol son şartlı bir nakavt çalışma ⁴ ile gösterilmiştir. Nedeniyle orta beyin dopamin nöronları için Nurr1 en kritik roller gösteren bu zarif çalışmalara, birçok sonraki çalışmalarda büyük ölçüde dopamin nöronları ve dopamin ile ilişkili nörodejeneratif bozukluk orta beyin odaklanmıştır, Parkinson hastalığı (PH) ^5.

Özellikle, Nurr1 orta beyin dopamin (MDA) nöronlarda, aynı zamanda di sadece ifade edilirşiddetle Nurr1 çeşitli beyin fonksiyonlarında önemli rol oynadığını gösteren daha yeni çalışmalar tarafından desteklenmektedir olmayan birçok DA alanlarda işlevsel rollere sahip olabileceğini düşündüren ayet beyin bölgelerinin ^2. Örnekler için, bu gibi öğrenme gibi bellek indükleyici aktiviteleri gösterilir, ya da diğer hipokampus bağımlı görevler yukarı regülasyonu hipokampus ^6,7 Nurr1 ifade ile sonuçlanır. Buna ek olarak, aşağı hipokampus Nurr1 ifade vurmak şiddetle Nurr1 birçok beyin bölgelerindeki çeşitli roller oynadığını düşündüren, uzun süreli hafızayı ve / veya sinaptik plastisite ^8-11 zarar için yeterli oldu. Bu nedenle, daha Nurr1 hücre-tipi-spesifik ve hücre içi ifade anlamak için, onun homologları ya da Nur77 Nor1 herhangi bir çapraz reaktivite sergilemez Nurr1 özgü antikorları kullanmak için tercih edilir. Bu kağıt özgüllüğü gösteren Nurr1 özgü antikorlar ve bu ek verileri oluşturmak için bir ön-adsorpsiyonu protokolü tarif eder.

Protokol

Not: Aşağıda belirtilen tüm çözümlerin kompozisyon Malzemeleri / Ekipman Tablo bulunabilir.

1. Protein A Sütun Antikor Arıtma

1. Bir protein A spin kolon ve önceki işleme başlamadan 15 dakika boyunca oda sıcaklığına kadar gerekli tüm tamponları dengelenmesi.
2. Bağışıklık serumu 1 seyreltin: 1 Protein A IgG Bağlama Tamponu ile. (Serum 5 mi tavsiye edilir).
3. Yavaşça kapağı açılmış olabilecek reçineyi çıkarmak için bir proteine ​​tezgah üstünde bir spin kolon dokunun. Üst kapağı çıkarın ve yavaşça alt kapatma koparmak. 15 ml toplama tüpüne sütun yerleştirin ve depolama çözümü süzülmesini bekleyin.
4. Bağlama Tamponu Protein A IgG 5 ml ilave edilir ve çözelti, kurumasına izin verin.
5. Sütuna seyreltilmiş bağışıklık serumu uygulayın ve flow-through toplamak. En iyi sonuçlar için, sütunun antikor-bağlanma capacit% 80 daha az bir antikor konsantrasyonunu içeren bir örnek hacim eklemeky.
6. Bağlama Tamponu Protein A IgG, 15 ml ya da 280 nm'de absorbans aşağıdaki 0.1 kadar sütun yıkayın.
7. Beş etiketli toplama tüplerine Nötralizasyon Tamponu 100 ul ekleyin.
8. Protein A sütun IgG Elüsyon Tamponu 5 ml ilave edilir ve Nötralizasyon tampon 100 ul ihtiva eden tüplerin her biri, 1 ml'lik fraksiyonların toplanması.
9. 0.5'den daha büyük olan bir absorbans 280 nm ve havuz fraksiyonlar her fraksiyondan absorbansı ölçülür. Diyaliz için hazır olana kadar buz üzerinde Bir araya toplanan fraksiyonlar tutun.
10. IgG Elüsyon Tamponu 8 ml ekleyerek sütun yeniden oluşturun ve çözelti sütun üzerinden akmasına izin verir.
11. 7.4'e yıkama sıvısı, pH dönene kadar Protein A IgG bağlanma solüsyonu ile sütun durulayın.
12. Depolama çözeltisi 5 ml (PBS içinde% 0.02 sodyum azid) eklenerek sütun saklayın. Yaklaşık 3 ml sütun, kapak altındaki kalır ve üst kapağı emniyete zaman. 4 ° C 'de sütun saklayın.
13. Uzunluk o belirleyinf Diyaliz tübü, üreticinin talimatlarına uygun olarak gerekli. 16 mm, düz çaplı boru çözeltinin ml'si başına boru uzunluğunun 5.47 cm kullanımı kullanılarak diyaliz edilmesi. Boru kesme ve 15-30 dakika boyunca PBS pH 7.4 ile yıkayın.
14. Katlama ve diyaliz hortumun bir ucunu klip, PBS pH 7.4 içinde dengelenmiş diyaliz tüp içeren fraksiyonlar bir araya toplanmış IgG aktarmak ve diğer ucu kapatın.
15. 2 saat süre ile, PBS, pH 7.4, 200 hacmine karşı oda sıcaklığında Dialyze.
16. Diyaliz tamponu (taze PBS pH 7.4) değiştirin ve oda sıcaklığında başka bir 2 saat boyunca diyaliz.
17. Diyaliz tamponu (taze PBS pH 7.4) değiştirin ve 4 ° C'de gece boyunca diyaliz.
18. Daha fazla saflaştırma adımları ile devam etmek için hazır olana kadar 4 ° C'de diyaliz edilir antikor çözüm tutun.
19. 280 nm'de absorbans kullanılarak antikor konsantrasyonuna ve 210,000 ^{M-1 cm-1 12} ve 280 nm 'de antikor Molar soğurma katsayısı değerlendirin.

LBD Proteinlerin 2. Bağlantı Bağlantı Reçine AminoLink için

1. Iki sütun, Nor1 diğeri Nur77 diğer hazırlayın. Her iki protein için de aynı protokol takip edin.
2. Protein çözülme buz üzerinde reçineye bağlanmak üzere. Onun moler sönüm katsayısı ve 280 mil ^12, emiciliğinin kullanarak protein konsantrasyonunu belirleyin.
   1. Alternatif olarak, bu bisinkoninik asit yöntemi ¹³ gibi bir protein tayini testi kullanılır. Protein bağlama tamponuna karşı bir amin-içeren tampon diyaliz ya da tampon alışverişi içinde eritildi edin. Protein, Uygun bir tampon maddesi içinde (serbest aminler) ise bu, bağlayıcı tampon içinde 4 kat seyreltilir.
3. Protein 2 mg reçine 2 ml kullanın. Izleyen tüm adımlar 10 mi sütununda 2 mi reçine içindir. Protein 10 mg kadar reçine, 1 ml (1: bulamacın 1 2 ml) başına bağlanabilir.
4. Altına bir cam hamuru bastırıyor ve içinden PBS pH 7.4 çalıştırarak bir 10 ml sütun hazırlayın. Cap tO kolonun alt ve Kaplin Tampon 2 ml ekleyin.
5. , Kolona (reçine 2 ml elde etmek için 4 ml) çamurun istenen hacim ekleme alt kapağı çıkarın ve sütun drenaj sağlar. Bağlayıcı tampon içinde 6 ml (3 reçine yatak hacmi) 'in bir toplam sütun durulayın ve sütun boşalmasını sağlar. Kavrama tampon süzüldükten sonra, alt kapağı değiştirin.
6. (280 nm'de emicilik ya bisinkoninik deneyi kullanarak adım 2.11 elüatın protein konsantrasyonu karşılaştırarak bağlanma verimliliğini değerlendirmek için protein çözeltisi bir kısım devam) kolonuna bağlayıcı tampon içinde süspansiyon haline getirilmiş protein, 2-4 ml ekleyin . Cap ve homojen bir çözüm var uca üzerine sonunu karıştırın.
7. Boş 1.8 ml'lik ependorf tüp tartılır ve davlumbaz taşımak. Dikkatli bir şekilde önceden tartılmış bir tüp içinde _NaCNBH3 (yaklaşık 0.05 g) aktarın. Tüp kapatılır ve _NaCNBH3 içeren tüp tartın. Kaput dışında tüp açmayın.
8. Ağırlığına göre_NaCNBH3, tüpüne aktarıldı, 1 M NaOH ilave edilerek 5 M bir solüsyon yapmak. _NaCNBH3 moleküler ağırlığı 62.84 gr, bu nedenle 0.05 g (0.05 / 62.84 = 7.96 x 10 ^-4 mol) 7.96 x 10 ^-4 mol eşit olmasıdır. 5 M solüsyonu (7.96 x 10 ^-4/5), 1 M NaOH ile 159 ul yapmak için.
9. Reaksiyonun toplam hacmi dikkate reçine hacmi alarak ölçün. Reaksiyonun, ml başına 5 M _NaCNBH3 10 ul ekle.
   1. Örnek: Bir 4 ml reaksiyon hacmi için 5 M _NaCNBH3 40 ul ekle. Reçine 1 ml ilave protein, 3 ml için, toplam hacim 4 ml'dir.
10. Sütun Cap ve sonunda üzerinde sonunu karıştırın. Bir tüp döndürücü sütun Güvenli ve reaksiyon 4 ° C'de gece boyunca devam edelim.
11. Sabah, kimyasal kaput sütun getirmek ve dikkatli bir gaz oluşmuş olabilir gibi kapağı çıkarın. Temiz bir tüp içine sütun boşaltın ve protein con ölçmek için eluatı kaydetmek280 nm yöntemiyle ¹² absorbans veya bisinkoninik asit deneyi ve adım 2.6 başlayarak protein konsantrasyonu ile karşılaştırmak kullanarak santrasyonu.
12. Kavrama 4 ml tampon ile reçinenin yıkanır ve sütun süzdürülür.

3. Engelleme Kalan Siteler

1. Tampon söndürülmesi 4 ml reçine yıkanır. Drenaj ve alt kapağını kapatın. Tampon söndürülmesi 2 ml ekleyin ve reçine askıya.
2. Reçine hacmi ve söndürme tampon hacmi daha sonra reaksiyon hacmi ml başına 5 M _NaCNBH3 10 ul ekleyin ölçerek toplam reaksiyon hacmi değerlendirin.
3. 30 dakika ucu-üzerinde-sonu boyunca oda sıcaklığında yavaşça karıştırın. 30 dakika sonra, davlumbaz sütun getir. Dikkatle üst kaldırmak ve daha sonra alt kapağı çıkarın ve bir atık tüp içine sütun tahliye edelim.
4. Yıkama çözeltisi 5 reçine hacimleri ile sütun yıkayın. Taşıma ürününden en abso ölçülmesiyle bakiye proteinlerinin varlığı için yıkama Monitör280 nm'de rbance. Kuplajsız proteinler yüksek tuz konsantrasyonu ile yıkanır.
5. Gazı alınmış, PBS, pH 7.4,% 0.02 sodyum azid, 6 ml reçine yıkanır. Gerekli olana kadar, 4 ° C 'de sütun tutun.

Nurr1 Özgü Antikorlar 4. saflaştırılması

1. PBS pH 7.4 10 ml Nur77 LBD bağlanmış sütun durulayın ve sütun süzdürülür. Sütunun alt Cap ve yeni bir 15 ml toplama tüpü drene Nur77 LBD birleştiğinde sütun yerleştirin.
2. Protein 5 ml saflaştırılmış bir anti-Nurr1 antikor ekleyin 1 saat boyunca 4 ° C 'de, bir döndürücü üzerinde sütun ve yer kap. Üst ve alt kapaklarını çıkarın ve akışı toplamak. Nor1 LBD birleştiğinde sütuna eklemek için hazır olana kadar buz üzerinde bir kenara koyun.
3. PBS pH 7.4 10 ml Nor1 LBD bağlanmış sütun durulayın ve sütun süzdürülür. Sütunun alt kapağı ve bir 15 ml'lik bir toplama tüpü içinde Nor1 LBD bağlanmış sütun yerleştirin.
4. Nur77 LBD darbeden akışını yoluyla Ekleyol kolon, 1 saat boyunca 4 ° C 'de, bir döndürücü üzerinde sütun ve yer kap. Üst ve alt kapaklarını çıkarın ve akışı toplamak.
5. 280 nm'de absorbans ölçümü ile antikor konsantrasyonu ölçümü.

Saf Anti-Nurr1 Antikor 5. ELISA-tabanlı Analiz

1. 96 oyuklu bir plakanın oyuklarına protein, 100 ul (2.5 ug / ml) ilave et. 3 farklı protein test için, H4 Wells A1, H8 Wells A5 proteinin 2, 100 ul, ve H12 kuyu A9 proteinin 3 100 ul proteinin 1. 100 ul ilave edin. Plaka Kapak ve 4 ° C'de bir gece inkübe edin.
2. PBS pH 7.4, oyuk başına 300 ul iki kez kaplanmış oyuklarına yıkayın ve tüm antijen kaplı oyuklara ELISA Bloke edici tamponun 300 ul ilave edildi ve oda sıcaklığında 2 saat inkübe et.
3. Plakası saflaştırılmış anti-Nurr1 antikorun arzu edilen çıkış seyreltme hazırlanması bloke edilirken ELISA bloke tamponu içinde (10 ile 100 ug / ml arasında değişen).
4. Engelleme 2 saat sonra, tüm oyuklara taze ELISA blok tamponunda 100 ul ELISA blok tamponu değiştirin.
5. Seri olarak C satır satır B çözeltisinin 100 ul aktarma ardından satır B çukurlara satır A çözeltisi 100 ul aktarma ile antikorları seyreltik satır A'da tüm oyuklara seyreltildi saflaştırılmış anti-Nurr1 antikoru 100 ul ekle aşağı doğru devam G ekstra 100 ul atmak aralıksız kuyularda çözüm karıştırıldıktan sonra G. satır. Satır H Wells, sadece tampon engelleme ilk 100 ul alırsınız. 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin.
6. PBS pH 7.4 plaka,% 0,05 Tween 20, oyuk başına 300 ul olan üç (3) defa yıkayın ve fazla yıkama tamponu çıkması için plakayı blot.
7. Yaban turpu peroksidazı (HRP), ELISA Blok tamponu içinde seyreltilmiş biyotinle konjuge edilmiş keçi anti-tavşan IgG, 100 ul ekle (1: 8000 seyreltme, tipik bir aralığı, 1: 25,000: 5,000 ile 1 arası). 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin.
8. Plaka th yıkayınREE (3) defa 5.6 de tarif edildiği gibi. Iyonu giderilmiş su, 300 ul ile doldurarak her kuyu durulayın. Emici kağıt üzerine plakayı baş aşağı çevirerek fazla suyu kurulayın.
9. Tüm oyuklara tetrametilbenzidin (oda sıcaklığına kadar ılıtıldı) 3 100 ul, 3 '5, 5', ilave edilir ve oda sıcaklığında 15 karanlıkta 30 dakika için inkübe edilir.
10. SO _{4 NH2} 2 50 ul ilave ederek reaksiyonu durdurun.
11. 650 nm 'de bir arka plan çıkarılması 450 nm'de absorbansı okumak.

Sonuçlar

Protein bir karşılaştırması Nur77 LBD ve Nor1 LBD sütunları boyunca geçirilerek ve ardından bir saflaştırılmış anti-Nurr1 antikorları görülebilir Şekil 1. As gösterilmiştir, Protein A sütun saf hale Nurr1-spesifik antikorlar, protein-A saf hale Nurr1 antikor güçlü bir bağlanma sergilemiştir Nurr1 LBD'sine. Bununla birlikte, aynı zamanda Nur77 LBD ve Nor1 LBD bağlanmasını belirgin göstermiştir. Protein A saflaştırılmış Nurr1 antikorlar ayrıca Nur77 LBD ve Nor1 LBD, Nurr1 antikorları Nur77 ve Nor1 ola...

Tartışma

Bu protokolün bir başarı ilgili protein ailesinin belirli bir üye karşı üretilen antikorların karakterizasyonu için, saf proteinler mevcudiyetine dayanır. Bu açık bir şekilde ELISA ve Western blot analizi ile önemli çapraz reaktivite olduğu kurulana kadar protein A / G kullanılarak antikorları saflaştırmak için bir ihtiyaç vardır.

Metinde belirtildiği gibi, bu tür Tris ya da glisin gibi bir amin-ihtiva eden tampon maddesi içinde sütuna çapraz bağlanmış olduğu protein (ler) süspansiyona önlem...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Nurr1, Nor 1 ve Nur77			Kolonu Depolama solüsyonundan
AminoLink Kaplin Reçinesi ve Kiti	Thermo Scientific	44890
Protein A spin sütunu	Thermo Scientific	89978
Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu	Corning	21-031-CV
96 kuyulu Düz tabanlı plakalar, Yüksek Flanş, 330 μ l	Thermo Scientific	3455
%10 Normal Keçi Serumu	KPL	50-675-69
Süt Seyreltici / Bloke Edici Konsantre	KPL	50-82-01
IgG Elüsyon Tamponu	Thermo Scientific	21004
Mikro BCA Protein Test Kiti	Thermo Scientific	23235
At Turpu Peroksidaz konjuge Keçi anti-Tavşan IgG (H + L)	Thermo Scientific	31460
Ni-NTA Reçine	Thermo Scientific	88221
3, 3 ', 5, 5' Tetrametilbenzidin	Thermo Scientific	34028
2N H2SO4	Macron İnce Kimyasallar	H381 05
Protein A IgG Bağlayıcı Tampon	Thermo Scientific	21001
IgG Elüsyon Tamponu	Thermo Scientific	21004
Sütun Depolama çözeltisi			Fosfat Tamponlu % 0.02 sodyum azid içeren salin
Spectra / Por 7 ön işlem görmüş diyaliz tüpü	Spectrum Labs	132128
10 ml Tek kullanımlık sütunlar	Thermo Scientific	29924
AminoLink Birleştirme Tamponu			0.1M sodyum fosfat, %0.05 NaN3, pH 7.0
Söndürme tamponu			1M Tris. HCI, %0,05 NaN3, pH 7.4
Yıkama Çözeltisi			1M NaCl, %0.05 NaN3
ELISA Bloke edici tampon			%1 Normal At serumu (NHS), %1 Normal Keçi Serumu (NGS) 1X KPL süt seyreltici
Depolama Çözeltisinde			PBS pH 7.4 %0.02 sodyum azid içeren
Mikropipetler: 10 μ l; 20 μ l; 200 μ l; 1000 μ l

Saflaştırılmış Ligand Bağlama Alanı