İnsan ko-enfeksiyonunun in vitro olarak çoğaltılması zordur. Bununla birlikte, insan sıtma parazitleri, doğal olarak HIV ile enfekte olmuş taze izole edilmiş insan periferik kan mononükleer hücreleri gibi, in vitro olarak kolayca kültürlenebilir. Bu, HIV ko-enfeksiyonu bağlamında sıtma parazitlerine karşı erken bağışıklık tepkilerini incelemek için mükemmel bir model sağlar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Bu makalede
Özet
Özet
Sıtma ve HIV ko-enfeksiyonu giderek artan bir sağlık önceliğidir. Bununla birlikte, sıtma veya HIV ile ilgili çoğu araştırma şu anda her enfeksiyona ayrı ayrı odaklanmaktadır. Bu patojenlerin her biri için hastalık dinamiklerini bağımsız olarak anlamak hayati önem taşısa da, bu patojenler arasındaki etkileşimlerin araştırılması ve anlaşılması da önemlidir.
HIV enfeksiyonu bağlamında sıtmaya karşı konak bağışıklık tepkilerini incelemek için çok yönlü bir in vitro HIV-sıtma ko-enfeksiyonu modeli geliştirdik. Modelimiz, hücresel süpernatanlarda, hücre yüzeyinde ve hücre içi protein belirteçlerinde salgılanan faktörlerin yanı sıra RNA ekspresyon seviyelerinin incelenmesine izin verir. Kullanılan deneysel tasarım ve yöntemler değişkenliği sınırlar ve veri güvenilirliğini ve tekrarlanabilirliğini teşvik eder.
Bu modelde kullanılan tüm patojenler doğal insan patojenleridir (Plasmodium falciparum ve HIV-1) ve tüm enfekte hücreler doğal olarak enfekte olur ve taze olarak kullanılır. P. falciparum ile parazitlenmiş ve sürekli in vitro kültürde tutulan insan eritrositlerini kullanıyoruz. Kronik olarak HIV ile enfekte olmuş gönüllülerden yeni izole edilmiş periferik kan mononükleer hücreleri elde ediyoruz. Kullanılan her koşulun uygun bir kontrolü vardır (P. falciparum parazitli ve normal eritrositler) ve HIV ile enfekte olmuş her donör, hücrelerin aynı gün toplandığı HIV ile enfekte olmamış bir kontrole sahiptir. Bu model, HIV enfeksiyonu bağlamında sıtma parazitleri ve insan bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimleri incelemek için gerçekçi bir ortam sağlar.
Giriş
Co-enfeksiyon, aynı anda birden çok enfeksiyonları ile enfeksiyon, doğal ortamlarında normdur. Co-enfeksiyon hastalığı patolojisi ve her enfeksiyonun klinik yönetimi üzerinde büyük bir etkiye sahip olabilir. Ko-enfeksiyon, aşı ve ilaç etkinliğinin yanı sıra, tanısal testlerin bağlamında, olumsuz etkilenebilir edilebilir (1 gözden). Ancak, onun önemine rağmen, patojen araştırma çoğunluğu sadece tek enfeksiyonları düşünmektedir.
Sıtma ve HIV-1 (HIV) küresel morbidite ve mortalite nedenleri lider vardır. 10 - sıtma ve HIV endemik Alanları ko-enfeksiyon riski milyonlarca insanı koyarak ve dolayısıyla daha ciddi klinik ha....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu protokol, parazit kültürü için kullanılan serum ve RBC için donör alımı gerektirir ve PBMC izolasyonu için, HIV (+) ve enfekte edilmemiş donörlerin. Kurumsal Değerlendirme Kurulları tüm çalışmalarını onaylaması gerekir ve tüm donörler kan beraberlik öncesinde bilgilendirilmiş onam sağlamanız gerekir.
DİKKAT: İnsan kan numuneleri ve insan sıtma parazitleri ile çalışma önlem gerektirir. Her seviye 2 Biyogüvenlik kabinede bir laboratuvar önlüğü, eldiven ve çalışmalarını giyerler. İnsan sıtma yanlışlıkla perkütan maruz kalma durumunda, profilaktik tedavi için Sağlığı ve Güvenliği rapor. Ek güvenlik dikkate de HIV (+) kan ile çalışmak için ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Grafikleri NKT hücreleri popülasyonu elde etmek CD56 +, CD3 + γδ- kapıları kullanan, NKT hücreleri IFNy üretimi (Şekil 2), seviyesini tasvir (veriler gösterilmemiştir). Hücreler boyamadan önce 72 saat süre ile kültüre edildi. Bir kez 100,000 CD3 + hücreleri sitometresi NK, NKT ve γδ hücrelerin (ilgi hücreleri) yeterince büyük popülasyonları elde etmek akışında elde edildi, boyandı. 5600 NKT hücrelerinin en az her bir grafik üzerinde gösterilir. TNF üretimi aynı şekilde elde edildi (veriler gösterilmemiş.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bizim protokol en gerçekçi in vitro HIV sıtma ko-enfeksiyon incelemek üzere optimize edilmiştir. İlk olarak, taze insan eritrositler ve serum sıtma paraziti kültürü için gereklidir. Bu sıtma parazitlerinin sağlıklı bir nüfus elde etmek için hayati önem taşımaktadır. Canlı P kullanırken sitokin üretimi daha hızlı ve yoğun olarak parazit lizatları canlı parazitler için ikame edilemez falciparum RBC (PfRBC) 17,18 enfekte. Buna ek olarak, NK hücreleri gibi hücre tipleri aktivasyonu, tüm.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Teşekkürler
C.A.M.F. ve L.S. protokol tasarımına, verilerin toplanmasına ve analizine ve makalenin taslağının hazırlanmasına katıldı.
Yazarlar katkılarından dolayı Dr. Kain, Dr. Loutfy, Dr. Wasmuth ve Dr. Ayi'ye teşekkür etmek isterler.
C.F., CTN/Ontario HIV Tedavi Ağı (OHTN) doktora sonrası bursu tarafından desteklenmiştir. L.S., OHTN Genç Araştırmacı Geliştirme Ödülü ile desteklenmektedir. Bu çalışma, Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri (CIHR) işletme hibesi (MOP-13721 ve 115160) ve CIHR Yeni Araştırmacı Katalizörü hibesi ile desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| alanin | Sigma | A7377 | |
| antikorları (diğer tabloya bakınız) | |||
| BD GolgiPlug BD 555028 ile BD Cytofix / Cytoperm | , brefeldin A, cytofix / cytoperm tamponu ve perma / yıkama tamponu içerir | ||
| BD Vacutainer ACD Çözeltisi A | BD | 364506 | |
| BD Vacutainer Sodyum Heparin | BD | 17-1440-02 | |
| DPBS (kalsiyum yok, magnezyum yok) | Corning | 21-031-CV | |
| Fetal Sığır Serumu | Sigma | F1051 | kullanmadan önce ısıyı inaktive edin |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| gentamisin (10 mg / ml) | Gibco | 15710-064 | |
| Hema3 Boyama Seti | Fisher | 122-911 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| hipoksantin | Sigma | H9636 | |
| İyonomisin | Sigma | I3909 | |
| MEM esansiyel olmayan amino asitler (10 mM) | Gibco | 11140 | |
| PMA | Sigma | P8139 | |
| RPMI-1640 toz | Yaşam Teknolojileri | 31800-022 | |
| RPMI-1640, L-glutamin ve HEPES | Thermo ile Bilimsel | SH30255.01 | |
| sodyum bikarbonat (toz, hücre kültürü) | Sigma | S5761 | |
| Sodyum Piruvat (100 mM) | Gibco | 11360 | |
| Tris (Trizma tabanı) | Sigma | T6066 | |
| Trizol | Ambion | 15596018 | |
| Tripan Mavisi (%0,4) | Gibco | 15250-061 | |
| BD CompBead | BD | 552843, 552845 | kullanılan antikorlara bağlıdır |
| Parazit Gaz Karışımı | Özel siparişle | 3 CO2, %1 O2, denge N2 | |
| >Equipment | |||
| 0.2 μ m filtre ünitesi | |||
| Cam slaytlar | |||
| T25 şişeler | |||
| T75 şişeler | |||
| 50 ml tüpler | |||
| 24 kuyulu kültür plakaları | |||
| fişe takılı olmayan Pasteur pipetleri | |||
| tıkalı Pasteur pipetleri | |||
| Steril Transfer Pipetleri | |||
| Hemositometre | |||
| Akış Sitometresi (3 Lazer) | |||
| Akış sitometrisi için kullanılan antikorlar | |||
| Anti-TNF | eBiosciences | 551487 | FITC (florofor) 2 μ l |
| Anti-IFNγ | Biolegend | 506507 | PE (florofor) 20 μ l |
| Anti-CD8 | Biolegend | 300914 | PE-Cy7 (florofor) 1 & # 956; l |
| Anti-CD14 | Biyoefsane; BD Biosciences | 325624; 551487 | Biotin (florofor) 0,5 μ l Streptavin PE-TR (florofor) 0,1 ve #956; l |
| Anti-CD56 | Biolegend | 318322 | PerCP / Cy5.5 (florofor) 5 μ l |
| Anti-γ δ | Biolegend | 331212 | APC (florofor) 5 μ l |
| Anti-CD3 | Biolegend | 300426 | APC-Cy7 (florofor) 5 μ l |
| Anti-CD4 | Biolegend | 317424 | Pasifik Mavisi (florofor) 1 & # 956; l |
Kaynaklar
- Graham, A. L., Cattadori, I. M., Lloyd-Smith, J. O., Ferrari, M. J., Bjørnstad, O. N. Transmission consequences of coinfection: cytokines writ large. Trends in parasitology. 23 (6), 284-291 (2007).
- French, N., et al. I....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
