Yöntem makalesi

Polarize Sinir Doku Engineered 3D İpek-kolajen bazlı Modeli

12.9K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/52970

⸱

23 Ekim 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Tufts University, 2Department of Pediatrics, University of Connecticut Health Center & Connecticut Children's Medical Center

Bu makalede

Özet

Beynin karmaşık eylemlerine ilişkin içgörü, gelişmiş araştırma araçları gerektirir. Burada, beyin benzeri mimariye benzeyen yeni bir ipek kollajen bazlı 3D mühendislik nöral doku modelini gösteriyoruz. Model, nöronal ağ montajı, aksonal rehberlik, hücre-hücre etkileşimleri ve elektriksel aktiviteyi incelemek için kullanılabilir.

Özet

Beynin anatomisini, bileşimini ve işlevini deşifre etmek için gösterilen büyük çabalara rağmen, insan vücudunun en az anlaşılan organı olmaya devam ediyor. Sinir sistemini daha iyi anlamak için bilim adamları, doku mühendisliği yaklaşımını kullanarak dokuyu temel yapı taşlarından in vitro olarak bir araya getirerek basit bir şekilde yeniden yapılandırmayı amaçlamaktadır. Grubumuz, korteksin beyaz ve gri maddesine benzeyen, doku mühendisliği yapılmış ipek ve kollajen bazlı 3D beyin benzeri bir model geliştirdi. Model, yumuşak kollajen matrisine batırılmış, sıçan beyninden türetilmiş nöronlarla önceden tohumlanmış ipek gözenekli süngerden oluşur. Ayrı aksonal ve hücre gövdesi lokalizasyonu ile polarize nöronal büyüme ve ağ oluşumu gözlenir. Bu bölmeli mimari, doğal nöral dokuyu taklit eden nişlerin benzersiz bir şekilde geliştirilmesine izin verir, böylece nöronal ağ montajı, aksonal rehberlik, hücre-hücre ve hücre-matris etkileşimleri ve elektriksel fonksiyonlar üzerine araştırmalara olanak tanır.

Giriş

Merkezi sinir sistemi (CNS), yapısal, işlevsel, bulaşıcı veya dejeneratif damar, ilgili muhtelif rahatsızlıkların etkilenebilir. Tahminen 6,8 milyon kişinin 1 dünya çapında büyüyen bir sosyoekonomik yük temsil nörolojik bozukluklar sonucu olarak her yıl ölmektedir. Ancak, hastalıkların sadece birkaç kullanılabilir tedaviler var. Bu nedenle, nörolojik bozukluklar muzdarip hastalar için yeni terapötik stratejiler için ciddi bir ihtiyaç vardır. Ne yazık ki, pek çok CNS hedefli terapötik nedeniyle fizyolojik ilgili işlevsel okumalarla akut ve kronik etkilerinin değerlendirilmesine izin vermez yetersiz klinik öncesi araştırma modelleri, kullanımına kısmen klinik denemeler sırasında başarısız.

Geçmiş yıllarda önemli araştırma çabalarına rağmen, CNS yapısı ve fonksiyonu hakkında bilinmeyen büyük bir miktardır. Daha fazla bilgi edinmek için, hayvan modelleri sık sık bize olaned özellikle pre-klinik çalışmalarda, bu tür travmatik beyin hasarı (TBI) veya demans gibi patolojik durumları, model. Bununla birlikte, hayvanlar insan hem de merkezi sinir sisteminin anatomisinde, hem de fonksiyonu, gen ekspresyonu ve metabolizma 2-4'te önemli ölçüde farklıdır. Öte yandan, 2 boyutlu, in vitro kültürler, hücre biyolojisi araştırmak için yaygın yöntem ve rutin olarak ilaç keşfi için kullanılmıştır. Bununla birlikte, 2B hücre kültürleri karmaşıklığı ve insan beyin 5-7 ile karşılaştırıldığında fizyolojik önemi yoksundur. Düşük maliyet ve basitlik 2D hücre kültürü çalışmaları ya da hayvan modellerinde tarafından sağlanan karmaşıklığı için yerini hiçbir şey tutamaz iken, 3D doku mühendisliği vitro ve in vivo yaklaşımları 2D arasında mevcut boşluğu kapatmak için geliştirilmiş araştırma modellerini oluşturabilir. 3D doku mühendisliği 3D hücre-hücre etkileşimleri ve biyomalzeme iskelelerde tarafından sağlanan dışı ipuçları elde daha fizyolojik ilgili deneysel koşullar sağlar. Desp3D kültürlerin değeri arkasında önemli deliller ite, orada bu tür kök hücre türevli organoid kültürler 8-10 gibi birkaç 3D CNS doku modelleri, 11 neurospheroids anda ve hidrojel kültürleri 12,13 dağılmış. Çok katmanlı litografi 14, ve 3 boyutlu baskı 15 dahil olmak üzere gelişmiş teknik yöntemler akciğer, karaciğer ve böbrek dokusunu incelemek için kullanılmaktadır. Ancak, bu tür kortikal mimarisi ve biyoloji taklit olarak bölümlere nöronal büyüme için izin 3D CNS modellerin eksikliği vardır. Nöronal hücre gövdeleri nevritlerin Ayrılmış büyüme önceden akson yolu izleme, kalsiyum akını, ağ mimarisi ve faaliyetlerin çalışma izin mikroüretim 16,17 ile 2D kültürlerde ortaya konmuştur. Bu fikir hücre gövdeleri ve aksonal yolları beynin 18 katmanlı mimarisi taklit farklı bölümlerinde bulunan 3D polarize sinir dokusu geliştirmek için bize ilham . Yaklaşımımız kapalı bir hacim içindeki hücreleri göz yüksek yoğunluk uygundur ve kolajen jele yoğun aksonal ağ aşırı büyümesini sağlayan benzersiz ipek skafold tasarım kullanımına dayanmaktadır. Burada iskele imalat ve nöronal kültürü gibi beyin gibi doku tam montaj işlemini göstermektedir.

Protokol

Beyin dokusu izolasyon protokolü Tufts Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmış ve Bakımı ve Kullanımı Laboratuvar Hayvanları (Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi B2011-45) Sağlık Rehberi National Institutes ile uyumludur edildi.

1. İpek İskele Hazırlık

  1. Ipek böceği kozası ipek solüsyonunun hazırlanması, daha önce 19,20 açıklandığı gibi.
    1. Makas kullanılarak 8 eşit parçaya her koza kesin. Parçalanmış koza 5 g için yaklaşık 11 koza kullanın. (15 dakika)
    2. 0.02 M Na 2 CO 3 çözeltisi 2 L hazırlayın ve sıcak bir plaka kullanılarak kaynatın getirmek. (15 dakika)
    3. Parçalanmış kozaların 5 g tartın ve 30 dakika süre ile, Na 2 CO 3 çözelti içinde kaynatın. Bir spatula ile kaynama ipek dakika her çift karıştırın. Ayrıca de-Gumming adlandırılan bu adım, hidrofil proteinler, sericins ipek fibroin arındırır. (30 dakika)
    4. elle fibroin sıkın ve kalan sericin ve kimyasallar dışarı yıkamak için distile su ile en az üç kez durulayın. (5 dakika)
    5. Petri ıslak fibroin yerleştirin ve akış kaput O / N fibroin kurutun.
    6. Bir sonraki gün kuru fibroin kütle ağırlığında ve bir cam beher içinde fibroin yerleştirin. (15 dakika)
    7. 4. kuru fibroin kütlesini çarpılarak LiBr 9.3 M LiBr solüsyonu (ml) Gerekli hacmi hesaplamak içinde fibroin eritmek için yavaşça ipek fibroin üzerinde LiBr çözüm dökün ve spatula ile tüm fibroin lifleri batırmayın. Buharlaşmasını önlemek ve fiber çözünmesi için 4 saat süre ile 60 ° C 'de yerleştirmek için beher örtün. (15 dakika)
    8. Şırınga kullanarak, kaptan fibroin çözümü toplamak ve MWCO 3500 diyaliz kasetleri içine yerleştirin. 48 saat süre ile destillenmiş suya karşı diyaliz gerçekleştirin. Suya her iki saatte değiştirin.
    9. Şırınga kullanılarak, gelen Fibroin çözümü toplamak20 dakika boyunca 4 ° C'de 9000 rpm'de (12700 x g ~), iki kez 50 ml konik tüp ve santrifüj içine kasetleri. Her santrifüj aşamasından sonra yeni bir tüp içine süpernatant dökün ve pelet atın. (40 dakika)
    10. Kuru ağırlığı tahminine göre fibroin konsantrasyonunu ölçün. Bir tartmak tekne içine ipek solüsyonu 1 ml dökün. 2 saat süre ile 60 ° C 'de fırında örnek kurutun. Kuru ipek fibroin tartılır ve 100 ile ipek çözeltisi beklenen konsantrasyon elde edilen ağırlık çarpılarak ipek fibroin çözeltisi konsantrasyonunu hesaplamak 6-9% (a / h).
    11. Damıtılmış su içinde seyreltilmesi ile (ağırlık / hacim)% 6 ipek konsantrasyonu ayarlayın.
      Durdurma noktası: Sıvı ipek fibroin kapalı bir kapta en fazla bir ay süreyle 4 ° C'de muhafaza edilebilir.
  2. Ipek çözeltisinden gözenekli iskelelerinin hazırlanması.
    1. Granüller daha sonra aşamalarda kullanılacak 500-600 um büyüklüğünde ayrı zerre NaCI Elek. Granül atıns 500 mikron altında ve 600 mikron üzerinde büyüklükte. (15 dakika)
    2. Politetrafloroetilen (PTFE) kalıp (Şekil 1) içine 6% ipek çözeltisi 30 ml dökün. Yavaşça ipek üzerine elekten NaCl 60 gr dağılım. Tuz biçimli bir tabakasını elde etmek kabı dokunun. Ipek polimerize etmek için oda sıcaklığında 48 saat inkübe edilir.
    3. Polimerizasyonu sonlandırmak ve kalan herhangi bir sıvı buharlaştırılması için 1 saat boyunca 60 ° C'de bir fırında iskelesi ihtiva eden PTFE kalıp yerleştirin.
    4. Tuz süzülecektir 48 st için damıtılmış su 2 L ihtiva eden bir beher içinde PTFE kalıp içerik yerleştirin. Suya günde 2-3 kez değiştirin. . Tuz tamamen noktası durdurma dışarı süzülen zaman kalıplardan sünger iskeleleri kaldırın: süngerler dehidratasyon gelen iskeleleri önlemek için kapalı bir kapta 4 ° C'de suya saklanabilir.
    5. Hazır olduğunuzda, 5 mm çapında biyopsi yumruk iskeleleri kesip. Yüksekliği yaklaşık 2 mm ulaşmak için iskeleleri Önceden kesilmiş. Pu2 mm çapındaki bir biopsi darbe ucu (Şekil 2A) ile birlikte, skafoldun merkezini NCH. (1 saat)
    6. . Noktası durdurma (ıslak döngüsü 121 ° C, 20 dakika) ile sterilize edilmeleri için su içine batırılır iskelesi Otoklav: süngerler dehidratasyon iskeleleri önlemek için kapalı bir kapta, 4 ° C sıcaklıkta su içinde daldırılır saklanabilir.
    7. Planlanan hücre ekim öncesi steril 0.1 mg / ml poli-D-lisin (PDL) çözelti içinde iskeleleri bırakın. 37 ° C 'de 1 saat süreyle inkübe edin.
    8. Iskeleleri bağlı olmayan PDL çıkarılması için fosfat tamponlu salin (PBS) ile 3 kez yıkanır. (30 dakika)

Rat Kortikal nöronlar 2. izolasyonu

  1. Onaylı hayvan protokolü elde edildikten sonra daha önce Pacifici ve Peruzzi 27 tarafından açıklandığı gibi embriyonik günden itibaren 18 (E18) Sprague-Dawley sıçanları korteks parçalara ayır. (2 saat)
  2. 3, 20 dakika boyunca (sığır pankreasından)% 0.3 DNase I ile% 0.25 tripsin 5 ml 10 korteksleri inkübe7 ° C.
  3. 1 mg / ml soya fasulyesi proteinin eşit bir hacminin eklenmesiyle tripsin inaktive.
  4. Tek bir hücre süspansiyonu oluşturulur kadar pipetleme 10 ml pipet kullanarak Pasteur korteks ve aşağı 20 kez Karışım. Nazik olun ve hava kabarcığı oluşumunu önlemek. (10 dakika)
  5. 5 dakika boyunca 127 x g'de hücre süspansiyonu santrifüjleyin.
  6. Yeniden askıya kültür ortamında 10 ml hücre pelletini (Neuro temelli vasat, 1 x B27 takviyesi, 1x Glutamax,% 1 penisilin / streptomisin). Hücreleri saymak. Beklenen hücre konsantrasyonu yaklaşık 2x10 7 / ml'dir. (20 dakika)

3. Meclis ve Kültür Construct

  1. Hücrelerle İskele tohumlama.
    1. Bir hücre kültürü kaput içinde steril iskeleleri ve gerekli tüm eşyaları taşıyın. Kullanma steril forseps bir 96-yuvalı hücre kültürü plakasında iskeleleri de başına bir iskele tahsis yerleştirin. (10 dakika)
    2. Bunları önce, tohum hücre dengelenmeye hücre kültür ortamı içinde iskelesi bırakıning. 37 ° C 'de 1 saat süreyle inkübe edin. (10 dakika)
    3. Iskeleler ortamın aşırı aspire.
    4. Hücre süspansiyonu / iskele 100 ul uygulayın. (10 dakika)
    5. Iskele hücre bağlanmasına olanak sağlamak için 37 ° de CO / N hücreleri inkübe edin.
    6. Ertesi sabah olmayan bağlanmış hücreler aspire 200 ul / oyuk taze kültür ortamı uygulanır. (10 dakika)
  2. Kollajen matrisi ile gömme Temel Yapı. (2 saat)
    1. Ben buz üzerinde kollajen 10x PBS, su, 1 N NaOH ve sıçan kuyruğu yerleştirin. Üreticinin talimatlarına göre kollajen çalışma çözeltisi hazırlayın. Hücre-numaralı seribaşı yapıları (1 saat kadar) hazır olana kadar buz üzerinde koruyun.
    2. Inkübatör hücre numaralı seribaşı ipek yapıları çıkarın ve ortamın aşırı aspire.
    3. Kullanma steril forseps oyuklu bir plaka üzerinde boş oyuklara iskeleleri transferi ve 3 mg / ml kolajen çözeltisi 100 ul her bir iskele bırakın. Geri doku kültürü plakasınıinkübatörde 30 dakika kollajen polimerizasyonunun izin vermek için.
    4. De / önceden ısıtılmış hücre kültür ortamında 100 ul uygulanır. Kültür bir hafta orta sadece yarısı hacmini değiştirerek her gün orta değiştirmek için yapıları.

4. Mikroskopi Analizi

  1. Canlı / ölü boyama (1 saat)
    1. Propidium iyodür (PI) damıtılmış su içinde 1 mg / ml (1,5 mM) stok çözelti hazırlayın.
    2. Aseton floresandiasetat (FDA) 2 mg / ml stok çözelti hazırlayın.
    3. PBS içinde seyreltilmiş 10 uM PI ve 0.15 uM FDA içeren çalışma çözeltisi hazırlayın. Bir su banyosu içinde 37 ° C'ye kadar çözüm önceden ısıtın.
    4. Serum esterazlar kaldırmak için önceden ısıtılmış hücrelerin PBS ile yıkayın. PBS aspire.
    5. 2 dakika için hücreler ile ilgili önceden ısıtılmış çalışma çözeltisi uygulanır ve PBS ile yıkayın.
    6. FDA eski λ = 490 n; görüntüye epifluorescent mikroskop kullanın hücreleri (PI ex λ = 490 nm, em λ = 570 nmm, em λ) 514 nm =. Leke 40 dakika boyunca sabit kalır. Uzun süreli boyama PI hücreleri tarafından alınması ve hücrelerinde PI / FDA eş-lokalizasyonu kaynaklanan spesifik olmayan boyama ile sonuçlanabilir.
  2. Immün
    1. Kültür Arzu edilen zaman noktasında oda sıcaklığında 30 dakika süreyle% 4 paraformaldehid (PFA) ile hücrelerin tespit. Nedeniyle PFA toksisitesine sabitleme adımının kimyasal çeker ocak içinde yapılmalıdır dumanı.
    2. . 3x PBS durdurma noktasına sahip iskeleleri yıkayın: PFA sabit yapılar daha başka aşamalar ile devam etmeden önce, birkaç gün 4 ° C'de PBS içinde saklanabilir.
    3. 4 ° C 'de primer antikor O / N içeren PBS içinde% 0.2 Triton,% 0.25 sığır serum albümini (BSA) iskeleleri inkübe edin.
    4. Ertesi gün, boyama çözeltisi atılır ve bağlanmamış birinci antikorları ayıklamak için PBS ile iskeleler 3 x 30 dakika yıkama.
    5. 2 PBS içinde% 0.2 Triton içinde seyreltilmiş sekonder antikor,% 0.25 BSA ile inkübe edinoda sıcaklığında sa.
    6. Boyama çözeltisini çıkarın ve Bağlanmamış ikinci antikorları ayıklamak için PBS ile iskeleler 3 x 30 dakika yıkama.
    7. Görüntü 1 mikron adım numune 100 mikron z-bölümleri alarak 20X amacı ile bir konfokal mikroskop kullanılarak iskeleler. Görüntü çözünürlüğü en az 1024 x 1024 piksel olmalıdır ince nevritlerle görselleştirmek için.
  3. RNA, DNA ve protein izolasyonu
    Not: RNA, DNA ve protein izolasyonu üretici talimatlarına uygun olarak bir ticari AllPrep DNA / RNA / Protein Mini Kit kullanılarak gerçekleştirilir.
    1. Kullanımı steril forseps 2 ml steril tüpe kültür plaka dışına iskeleleri aktarın. Tüp başına tek bir iskele yerleştirin.
    2. Her tüpe RLT tamponu 200 ul ekle.
    3. Steril microscissors ile parçalamadan tarafından yapı bozar.
    4. Kesintiye doku homojenize, spin kolona tüpün içeriğini aktarmak. Bir mikrosantrifüj tam hızda 2 dakika süreyle Spin.Bu spin kolon boyunca geçerken lizat homojenize edilir.
    5. Aracılığıyla akışını toplamak ve RNA, imalatçı protokolü aşağıdaki DNA ve protein izole etmek için hemen kullanabilirsiniz.
    6. Nükleik asitlerin verim uyumlu herhangi bir yöntem (örneğin, NanoDrop) ölçmek.
    7. Üreticinin talimatlarına uygun olarak BCA protein deneyi kullanılarak protein verimi ölçmek. Dalga boyu 562 nm mikroplaka okuyucu kullanarak tahlil sonuçlarını ölçün.
      Not: nükleik asit ve hücre yoğunluğuna göre bir yapı için protein beklenen verim Şekil 4 'de gösterilmiştir.

Sonuçlar

Çörek şekli Katı ipek süngerler hazır kesilmiş sinir dokusu (Şekil 2A) benzeyen bir mimarisi bölümlere ulaşmak için benzersiz ve basit bir fikri temsil etmektedir. Küçük bir hacim içinde tohumlama ve yüksek hücre yoğunluğuna büyümesini sağlayan son derece yüksek bir yüzey alanı içinde yaklaşık 500 um sonuç gözenek boyutlu iskele oldukça gözenekli bir yapı (2x10 7 / ml) (Şekil 2B). Ayrıca, iskelenin yüksek gözeneklilik genişletilmiş zaman dilimlerinde üzerinde yoğun hücre kültürlerinin üstün canlılığı ile sonuçlanan besin ve atıkların sınırsız yayılması için izin verir. Nöronlar tohumlama sonra hızlı bir şekilde ve homojen bir skafold gözenek yüzeyine bağlanır.

Hücre bağlanma tamamlandığında ve hücreler, ipek alt-tabaka üzerinde dengelenir sonra, sünger skafold aksonal ağı oluşumu (Şekil 3 için 3 boyutlu bir ortam sağlamak amacıyla yumuşak kolajen matriks ile doldurulur ). Nöronların sadece 2B yüzeyler (Şekil 3B) ile bulunduğu gibi karışık ağlarda elde edilen gözenek yüzeyi üzerinde uzantılar büyüdükçe kollajen matris yokluğunda akson ve hücre gövdeleri bölmelere mümkün değildir. Bunun aksine, kollajen jel nöronal hücre gövdeleri ipek iskele (Şekil 3C) bağlı kalır ise, 3D geniş aksonal dış gelişimini destekleyen bir ağ örgüsü içerir. Bu büyüme paterni hücre gövdeleri ve saf aksonal ağlarda beyinde korteks gri ve beyaz madde benzer (Şekil 3D), compartmentalization yol açar.

Ayrı mikroskopisi, konstruktlar deney arkasındaki soruya bağlı olarak, diğer yöntemlerle 18 çeşitli değerlendirilebilir. Örneğin, konstruktların DNA, RNA ve protein izolasyonu kolayca ticari kitler (Şekil 4) kullanılarak gerçekleştirilmiştir olabilir. Nükleik asitler ve protein pe verimir yapı başlangıçta ipek iskelelerinin numaralı seribaşı hücrelerin sayısına bağlıdır. Daha fazla Hücreler DNA, RNA ve protein verimi artar.

figure-results-1
Ipek sünger iskele hazırlanmasında kullanılan Şekil 1. PTFE kalıp ölçüleri:.. 10 cm çapında, 2 cm yüksekliğinde bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-2
Şekil 2. 3B beyin gibi doku modeli. (A) Gözenekli ipek sünger iskele. Daha önce kolajen (yeşil-canlı hücreler, kırmızı ölü hücreleri) gömme ipek iskele üzerinde tohumlama üzerine günde 1 nöronların (B) Canlı / ölü boyama. Sağ tarafta Panelleri ma göstermekKırmızı çerçeveli yakalanan alanın gnification. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-3
Şekil 3. nöronal 3D beyin gibi doku modelinde bölümlere akıbet (A) İskele bölmeleri:. Kırmızı hücre gövdesi bölmesi, Mavi-aksonal bölmesi. (B) kollajen katıştırma önce tohumlama üzerine 1 gün de Nöronal büyüme paterni. (C). Hücre gövdesi bölmesinde tohumlama üzerine günde 7 nöronal akıbet. (D) akson bölmeye tohumlama üzerine 7. günde Nöronal sonucudur. Yeşil -. ΒIIITubulin bu büyük halini görmek için tıklayınızrakam.

figure-results-4
(A) RNA ve DNA ve iskele başına seribaşı hücrelerin miktarına bağlı olarak yapı başına (B) protein Şekil 4. Beklenen verim (± SD, n = 5). Bu rakamın büyük halini görmek için tıklayınız .

Tartışma

Burada, bölümlere ayrılmış bir 3B beyin benzeri doku modelini bir araya getirmek için yönergeleri açıkladık. Model, morfolojik olarak farklı iki bölmenin gelişmesiyle sonuçlanan yoğun polarize nöron kültürü ile karakterize edilir: biri yoğun şekilde paketlenmiş hücre gövdeleri içerir, ikincisi saf aksonal ağlar içerir. Genel olarak, iskele mimarisi ve büyüme paterni, altı laminer katman ve beyaz cevher yolları21 dahil olmak üzere beyin kortikal dokusunu taklit eder.

Çörek şeklindeki ipek proteini bazlı doku modeli, mekanik özelliklerin, çok yönlü yapısal formların, hidrojel dolgu maddelerinin ve hücresel bileşenlerin değiştirilmesine ve ayarlanmasına olanak tanır. Böylece, bu doku modeli çok çeşitli çalışmalar için bir temel platform oluşturur. İpek, biyouyumluluğu, su bazlı işleme ve sağlam mekanik ve bozunma özellikleri nedeniyle biyomateryal platformları için uygun bir adaydır22. İpek matris ayrıca kültürde zamanla kolajen jel kasılmasını azaltmak için stabil bir çapa görevi görür. Bu modelde kullanılan iskelenin ipek konsantrasyonu ve gözenekliliği gibi özellikler, beyin benzeri doku elastikiyeti18,23,24 ile sonuçlanan optimal hücre büyümesi ve mekanik özellikler elde etmek için önceden ayarlanmıştır. Deneylerin başarılı sonucunu ve tekrarlanabilirliğini sağlamak için bu parametrelerin sabit tutulmasını öneriyoruz.

3D nöronal ağ oluşumu, farklı mekanik özelliklere sahip iki tip biyomateryalin birleştirilmesiyle elde edildi: nöronal ankraj sağlamak için sert bir iskele ve 3D'de akson penetrasyonuna ve bağlantıya izin vermek için daha yumuşak bir jel matrisi. İpek iskele ve yumuşak hidrojelin seçici malzeme tercihleri, nöronları aksonal bağlantılardan bölümlere ayırmak için temel prensibi sağlar. İpek iskelenin inert doğası nedeniyle, nöronal bağlanma için poli-D-lizin ile işlevselleştirme gereklidir. Bununla birlikte, RGD25 veya fibronektin26 gibi diğer hücre yapışmasını teşvik edici faktörler uygulanabilir. 3 boyutlu ağ oluşumunu sağlamak için ipek iskelenin, nöronlar iskeleye bağlanır bağlanmaz zamanında hidrojel ile doldurulması gerekir. Benzer şekilde, kollajen matris dolgu maddesi diğer hidrojellerle değiştirilebilir, böylece 3D hücre dışı ortamların aksonal ağ oluşumu üzerindeki etkisinin incelenmesine, yeni hidrojelleri nöronal uyumluluk açısından değerlendirmek için bir platform görevi görmesine izin verir. Ek olarak, sıçan kortikal nöronlarının yanı sıra, hipokampal nöronlar veya indüklenmiş pluripotent hücre (iPSc) türevli nöronlar gibi diğer nöronal kaynaklar da kullanılabilir. Ayrıca, doku modeli, nöronlarla birlikte glial hücreleri dahil ederek heteroselüler etkileşimleri incelemek ve daha karmaşık beyin benzeri doku oluşturmak için kullanılabilir.

Daha önce gösterildiği gibi, modelimiz, hücre canlılığı, gen ekspresyonu, LC-MS/MS ve elektrofizyoloji gibi çeşitli tahlillerle 3B mikro ortamda nöronal işlevselliği değerlendirmek için kullanılabilir, böylece model18'in fizyolojik uygunluğunu gösterir. İmmün boyama ve mikroskopi8,9,11 gibi 3D doku mühendisliği yapılarını değerlendirmek için sıklıkla kullanılan diğer yöntemler de hücre dağılımını ve aksonal ağ oluşumunun derecesini değerlendirmek için kullanılabilir. Bununla birlikte, kollajen matrisinin yüksek yoğunluğu nedeniyle, antikorların penetrasyonunun ve görüntüleme derinliğinin birkaç yüz mikrometre ile sınırlı olduğuna dikkat edilmelidir. Ayrıca, sinyal-gürültü oranı, spesifik olmayan arka plan floresansından etkilenebilir. Bu, lipofilik hücre izleyicileri ve immün boyama ihtiyacını azaltan genetik olarak eksprese edilmiş floresan proteinler kullanılarak aşılabilir11. Alternatif olarak, görüntüleme, sinyal kaybını, foto ağartmayı azaltabilen ve birkaç yüz mikrometre derinliğe kadar genişletilebilen normal tek foton tekniği yerine 2 foton mikroskobu ile gerçekleştirilebilir.

Özetlemek gerekirse, ipek ve kolajen bazlı beyin benzeri doku, nöronal ağları 3 boyutlu olarak incelemek için sağlam bir platform sunuyor ve gelecekte daha gelişmiş nörolojik bozukluk modellerinin geliştirilmesi için bir başlangıç noktası. Değerlendirme modundan bağımsız olarak, bu doku modelinin göreceli basitliği, kullanışlılığını, başarısını ve tekrarlanabilirliğini destekler.

Açıklamalar

Bu video-makale yayınlanması Corning tarafından desteklenmektedir.

Teşekkürler

Dr. Stephen Moss'un laboratuvarına embriyonik sıçan beyin dokuları sağladığı için teşekkür ederiz. MDT orijinal protokolü tasarladı. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri P41 Doku Mühendisliği Kaynak Merkezi Hibe EB002520 tarafından finanse edilmiştir. K.C., Alman Araştırma Vakfı (DFG) tarafından Doktora Sonrası Bursu ile desteklenmiştir (CH 1400/2-1).

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Na2CO3Sigma-Aldrich223530
LiBrSigma-Aldrich213225
MWCO 3500 diyaliz kasetleri Thermo Fisher66110
Isıtma plakasıFisher ScientificIsotemp
Santrifüj 5804 REppendorf
ElekFisher ScientificNo. 270, No. 35, No. 30
Evde yapılan PTFE kalıp(Şekil 1) 10 cm çap, 2 cm yükseklik
NaClSigma-Aldrich71382
Biyopsi Punch 5  mmDünya Hassas Alet501909
Biyopsi Punch 2 & # 160; mmDünya Hassas Alet501908
poli-D-lizinSigma-AldrichP6407-5MGnihai konsantrasyon 10 & # 160; μ g / ml, suda çözünmüş
PBSSigma-AldrichD1283-500ML
TripsinSigma-AldrichT4049-500ML
DNazRoche10104159001son konsantrasyon% 0.3
Soya fasulyesi proteiniSigma-AldrichT6522-100MGnihai konsantrasyon 1 &# 160; mg / ml
Nörobazal ortamGibco2110304937 'a kadar ısınır; ° Kullanmadan önce C
B27 takviyesi 50xGibco17504-044
GlutamaxGibco35050-061
Penisilin StreptomisinCorning30-002-CI
Kollajen I, sıçan kuyruğu, 100 & # 160; mgCorning354236nihai konsantrasyonu 3&# 160; mg / ml
NaOHSigma-AldrichS2770aşındırıcı
Propidyum İyodürSigma-AldrichP4170-10MGtoksik
Floresein DiasetatSigma-AldrichF7378-5G
Olympus MVX10Olympus
ParaformaldehitSigma-AldrichP6148toksik, son konsantrasyon %4
Sığır SerumAlbümin Sigma-AldrichA7906-10G
anti-β IIITubulin antikoru Sigma-AldrichT2200tavşan 1:500
anti-tavşan Alexa-546Moleküler ProblarA11010keçi 1:250
keçi serumuSigma-AldrichG9023-5ML
Leica SP2 konfokal mikroskopLeicaobjektif 20X
QIAshredderQiagen79654
AllPrep DNA/RNA/Protein Mini KitiQiagen80004
Etil alkol, SafSigma-AldrichE7023 
2-MerkaptoetanolSigma-Aldrich63689
NanoDrop 2000c/2000 UV-Vis SpektrofotometreThermo Scientific
BCA protein testiThermo Scientific23225
Plaka okuyucu Spectramax M2Moleküler Cihazlarabsorbans 562 nm
Mikro Makas, Ekonomi, Vannas tipiTedPella1346

Kaynaklar

  1. Dua, T., Janca, A., Kale, R., Montero, F., Muscetta, A., Peden, M. Chapter 1, Public health principles and neurological disorders. Neurological Disorders. , World Health Organization. Geneva. (2005).
  2. Ohtsuki, S., Hirayama, M., Ito, S., Uchida, Y., Tachikawa, M., Teresaki, T. Quantitative targeted proteomics for understanding the blood-brain barrier: towards pharmacoproteomics. Expert. Rev. Proteomic. 11 (3), 303-313 (2014).
  3. Hyder, F., Rothman, D. L., Bennett, M. R. Cortical energy demands of signaling and nonsignaling components in brain are conserved across mammalian species and activity levels. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (9), 3549-3554 (2013).
  4. Wesseling, H., et al. A combined metabonomic and proteomic approach identifies frontal cortex changes in a chronic phencyclidine rat model in relation to human schizophrenia brain pathology. Neuropsychopharmacology. 38 (12), 2532-2544 (2013).
  5. Fawcett, J. W., Housden, E., Smith-Thomas, L., Meyer, R. L. The growth of axons in three-dimensional astrocyte cultures. Dev Biol. 135 (2), 449-458 (1989).
  6. Cullen, D. K., Simon, C. M., LaPlaca, M. C. Strain rate-dependent induction of reactive astrogliosis and cell death in three-dimensional neuronal-astrocytic co-cultures. Brain Res. 1158, 103-115 (2007).
  7. East, E., de Oliveira, D. B., Golding, J. P., Phillips, J. B. Alignment of astrocytes increases neuronal growth in three-dimensional collagen gels and is maintained following plastic compression to form a spinal cord repair conduit. Tissue Eng. Part A. 16 (10), 3173-3184 (2010).
  8. Dubois-Dauphin, M. L., Toni, N., Julien, S. D., Charvet, I., Sundstrom, L. E., Stoppini, L. The long-term survival of in vitro engineered nervous tissue derived from the specific neural differentiation of mouse embryonic stem cells. Biomaterials. 31 (27), 7032-7042 (2010).
  9. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  10. Hogberg, H. T., et al. Toward a 3D model of human brain development for studying gene/environment interactions. Stem Cell Res Ther. 4, Suppl 1. S4(2013).
  11. Kato-Negishi, M., Morimoto, Y., Onoe, H., Takeuchi, S. Millimeter-sized neural building blocks for 3D heterogeneous neural network assembly. Adv Healthc Mater. 2 (12), 1564-1570 (2013).
  12. Watanabe, K., Nakamura, M., Okano, H., Toyama, Y. Establishment of three-dimensional culture of neural stem/progenitor cells in collagen type-1 gel. Restor Neurol Neurosci. 25 (2), 109-117 (2007).
  13. Aurand, E. R., Wagner, J. L., Shandas, R., Bjugstad, K. B. Hydrogel formulation determines cell fate of fetal and adult neural progenitor cells. Stem Cell Res. 12 (1), 11-23 (2014).
  14. Gurkan, U. A., et al. et al..Simple precision creation of digitally specified, spatially heterogeneous, engineered tissue architectures. Adv Mater. 25 (8), 1192-1198 (2013).
  15. Mironov, V., Boland, T., Trusk, T., Forgacs, G., Markwald, R. R. Organ printing: computer-aided jet-based 3D tissue engineering. Trends Biotechnol. 21 (4), 157-161 (2003).
  16. Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature. 2 (8), 599-605 (2005).
  17. Tang-Schomer, M. D., Davies, P., Graziano, D., Thurber, A. E., Kaplan, D. L. Neural circuits with long-distance axon tracts for determining functional connectivity. J Neurosci Methods. 222, 82-90 (2014).
  18. Tang-Schomer, M. D., et al. Bioengineered functional brain-like cortical tissue. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (38), 13811-13816 (2014).
  19. Rockwood, D. N., Preda, R. C., Yücel, T., Wang, X., Lovett, M. L., Kaplan, D. L. Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin. Nat Protoc. 6, 1612-1631 (2011).
  20. Lawrence, B. D., Pan, Z., Weber, M. D., Kaplan, D. L., Rosenblatt, M. I. Silk film culture system for in vitro analysis and biomaterial design. J. Vis. Exp. (62), e3646(2012).
  21. Maddah, M., Grimson, W. E., Warfield, S. K., Wells, W. M. A unified framework for clustering and quantitative analysis of white matter fiber tracts. Med Image Anal. 12 (2), 191-202 (2008).
  22. Vepari, C., Kaplan, D. L. Silk as a biomaterial. Prog Polym Sci. 32 (8-9), 8-9 (2007).
  23. Yao, D., et al. Salt-leached silk scaffolds with tunable mechanical properties. Biomacromolecules. 13 (11), 3723-3729 (2012).
  24. Kim, U. J., Park, J., Kim, H. J., Wada, M., Kaplan, D. L. Three-dimensional aqueous-derived biomaterial scaffolds from silk fibroin. Biomaterials. 26 (15), 2775-2785 (2005).
  25. Gil, E. S., Mandal, B. B., Park, S. H., Marchant, J. K., Omentetto, F. G., Kaplan, D. L. Helicoidal multi-lamellar features of RGD-functionalized silk biomaterials for corneal tissue engineering. Biomaterials. 31 (34), 8953-8963 (2010).
  26. Hopkins, A. M., et al. Silk hydrogels as soft substrates for neural tissue engineering. Adv Funct Mater. 23 (41), 5140-5149 (2013).
  27. Pacifici, M., Peruzzi, F. Isolation and culture of rat embryonic neural cells: A quick protocol. Vis. Exp. (63), e3965(2012).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

3B Beyin benzeri Dokupek Kolajen skeleN ronal H cre K lt rKonfokal Mikroskopimm nofloresan BoyamaS an Kortikal N ronlarAksonal B y meH cre G vdesi LokalizasyonuDoku M hendisli iSinir A Olu umu
Polarize Sinir Doku Engineered 3D İpek-kolajen bazlı Modeli
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.