Burada bir protokol, önceden enfekte edilmiş dendritik hücreler (DC) transinfection ile antijen sunumu sırasında ortaya çıkan, CD4 + T hücreleri tarafından bakteriyel yakalama ölçmek için sunulmuştur. Birincil hücreler, DC, DC / T hücre konjuge oluşumu enfeksiyon ve bakteri T hücre transfeksiyon ölçüm izolasyon: Biz gerekli adımları gerçekleştirmek için nasıl gösterir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
T hücreleri dendritik hücreler gelen Transinfection tarafından Bakteriler Yakalama
Bu makalede
Özet
Özet
Son zamanlarda, tarif edilenin aksine, adaptif bağışıklık hücrelerinin paradigması olan CD4+ T hücrelerinin, enfekte dendritik hücrelerden (DC'ler) bakterileri transenfeksiyon adı verilen bir süreçle yakaladığını gösterdik. Burada, antijen sunumu sırasında meydana gelen transenfeksiyon sürecinin analizini açıklıyoruz. Bu işlem, bir ovoalbümin peptidi (OVAp) için spesifik bir T hücresi reseptörü (TCR) taşıyan transgenik OTII farelerinden alınan CD4+ T hücreleri kullanılarak ortaya çıkarıldı, bu nedenle bu spesifik OVAp ile yüklenmiş enfekte dendritik hücrelerle stabil bağışıklık kompleksleri oluşturabilir. DC-T hücre iletimi sırasında yeşil floresan protein (GFP) eksprese eden bakterilerin dinamikleri, canlı hücre görüntüleme ile izlenebilir ve bakteriyel transenfeksiyonun nicelleştirilmesi akış sitometrisi ile gerçekleştirilebilir. Ek olarak, transenfeksiyon, hücre içi bakterileri öldüren, ancak hücre içi bakterileri öldüren, geçirgen olmayan bir aminoglikozit antibiyotik olan gentamisin kullanımına dayanan daha hassas bir yöntemle ölçülebilir. Bu klasik yöntem daha önce mikrobiyolojide bakteriyel enfeksiyonların etkinliğini incelemek için kullanılmıştır. Burada, birincil hücrelerin izolasyonundan transenfeksiyonun nicelleştirilmesine kadar tüm sürecin protokolünü açıklıyoruz.
Giriş
Bir patojen konukçu bulaştığında, genellikle bakteriyel temizlenmesi için gerekli olan doğal ve kazanılmış bağışıklık tepkilerinin, bir aktivasyon vardır. Doğuştan gelen bağışıklık çoğu enfeksiyonları önler ilk savunma hattıdır. Doğuştan gelen bağışıklık mikroorganizma ana gruba arasında korunan bir hassas bir şekilde elemanları (patojenle ilişkili molekül örnekleri, PAMPS) 1 ayırt. Doğuştan gelen bağışıklık mekanizmaları fagositler (makrofajlar, nötrofiller ve dendritik hücreler), mast hücreleri, eozinofiller, bazofiller ve doğal öldürücü hücreleri içerir, fiziksel deri gibi engelleri, kimyasal bariyerler (antimikrobiyal peptitler, lizozim) ile doğuştan g....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Not: Deneysel işlemler Universidad Autonoma de Madrid Araştırma Etik Komitesi tarafından onaylanan ve İspanyol ve Avrupa kurallarına uygun olarak Hayvan Refahı ve Sağlık Universidad Autonoma de Madrid Başkanı'nın gözetiminde yapılmıştır. Fareler spesifik patojen free (SPF) konut yetiştirilen ve onlar karbon dioksiti kullanarak eğitimli ve kalifiye personel (CO 2) inhalasyon yöntemi ile ötenazi uygulandı.
1. Fare Kemik DH'ler Farklılaşma ve Enfeksiyon İliği-türevli
Not: Şekil 1, bu ilk adımı özetlemektedir. Tüm prosedürler, sadece steril ortam, alet, pipet uçları ve kültür yeme....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Akış sitometri ve gentamisin yaşam tahlil Şekil 1 hücreleri elde etmek prosedürü özetler:. Bu yazıda enfekte kemik iliği kaynaklı-DH'ler ve nasıl iki farklı yaklaşım yoluyla bakteri transinfection ölçmek için fare T hücre bakteriyel transinfection nasıl gerçekleştirileceği açıklanan. DCler, 9 gün boyunca GM-CSF ile kemik iliği hücrelerinin inkübe etmek suretiyle oluşturulur. Daha sonra DCler, OVA (OVAp) belirli bir peptid ile daha sonra bunları yüklemek için kendi za.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
T hücreleri veya T lenfositleri adaptif bağışıklık yanıtı 26 hücre-aracılı bağışıklığın bir rol oynayabilir ve ait lökosit türüdür. T hücreleri in vitro enfekte olma dirençli ama bazı raporlar, in vivo 14,15 enfekte olabilir göstermektedir. Bağışıklık sinaps sırasında APC ve T hücrelerinin samimi kişiler HIV gibi bazı virüsler 11 de dahil olmak üzere biyolojik madde 13, alışverişi için platformlar olarak hizmet vermektedir. Son zamanlarda dogma, T hü.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma, İspanya Bilim ve Yenilik Bakanlığı'ndan BFU2011-29450, BFU2008-04342/BMC hibeleri ve Consejo Superior de Investigaciones Cientìficas'tan (CSIC) PIES201020I046 desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| RPMI | Fisher Scientific | SH3025501 | |
| r-GMCSF | Peprotech | 315-03 | |
| LPS | SIGMA | L2630-10mg | |
| Na Piruvat | Termo Bilimsel | SH3023901 | |
| 2-ME | Gibco | 31350-010 | |
| OVAp OTII (323– 339) | GenScript | ||
| Hücre Süzgeci 70uM | BD | 352350 | |
| 30 uM Şırınga Filcons Steril | BD | 340598 | |
| AutoMacs Classic | Miltenyi Biotec | 130-088-887 | |
| Gentamicin | Normon | 624601.6 | |
| Transwell | Costar | 3415 | |
| LB | Pronadisa | 1231 | |
| Agar | Pronadisa | 1800 | |
| Paraformaldehit% 16 | Elektron Mikroskobu Bilimleri | 15710 | |
| Triton X-100 | |||
| CD8 biot | BD Biosciences | 553029 | |
| IgM Biot | ImmunoStep | Klonu RMM-1 | |
| B220 Biot | BD Biosciences | 553086 | |
| CD19 biot | BD Biosciences | 553784 | |
| MHC-II Biot (I-A/IE)BD | Biyolojik bilimler | 553622 | |
| CD11b biot | Immunostep | 11BB-01mg | |
| CD11c biot | Immunostep | 11CB3-01mg | |
| DX5 biot | BD Biosciences | 553856 | |
| Gr-1 biot | BD Biosciences | 553125 | |
| CD16 / CD32 | ImmunoStep | M16PU-05MG | |
| anti Salmonella | ABD Serotec | 8209-4006 | |
| CD11cPE | BD Biyolojik | Bilimler 553802 | |
| CD4-APC | Tonbo Biyolojik Bilimler | 20-0041-U100 | |
| Gr-1 APC | BD Biyolojik Bilimler | 553129 | |
| MHC-II (I-A / IE) FITC | BD Biosciences | 553623 | |
| Alexa-Fluor 647 Keçi Anti-Tavşan IgG (H + L) Antikor, yüksek oranda çapraz adsorbe edilmiş | Invitrogen | A-21245 | |
| CMAC (7-amino-4-klorometilkumarin) | Yaşam teknolojileri | C2110 | |
| BSA | SIGMA | A7030-100G | |
| Streptavidin Mikro Boncuklar | Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
| BD FACSCanto II | BD Biosciences |
Kaynaklar
- Medzhitov, R. Recognition of microorganisms and activation of the immune response. Nature. 449 (7164), 819-826 (2007).
- Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. Molecular biology of the cell. , Garland Science. New York. (1989).
- Pancer, Z., Cooper, M. D.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
