Yeniden İnşa İnsan Kornea gibi Epitelyal (RHCE) Doku Modeli kullanılarak Göz tahriş Kimyasalların Tehlike Tanımlaması Göz tahrişi Testi (EIT)

Özet

Biz üç boyutlu yeniden insan kornea gibi epitel (RHCE) doku modelini kullanan bir göz tahrişi testi geliştirdi. Test göz irritan ve korozif malzemeler (GHS kategorileri 1 ve kombine 2) ve etiketleme (GHS yok Kategori) gerekmez olanlar arasında ayrım yapabiliyor.

Özet

AB Kozmetik Direktifi ve AB REACH mevzuatına Yedinci Değişiklik uymak için, insanda göz toksisite güvenilir ve doğru değerlendirilmesi için geçerli olmayan hayvan alternatif yöntemlere ihtiyaç vardır. Bu ihtiyacı karşılamak için, biz bir göz tahrişi testi normal insan hücrelerine dayanan üç boyutlu yeniden insan kornea gibi epitel (RHCE) doku modelini kullanır (EIT) geliştirdik. EIT göz tahriş edici ve korozif (GHS Kategori 1 ve 2 kombine) ve etiketleme (GHS yok Kategori) gerekmez o ayrı yapabiliyor. Test, iki ayrı protokolleri, sıvı kimyasal ve katı deney ürünleri için, bir ikinci benzer protokol için tasarlanmış bir kullanır. EIT tahmin modeli, tek bir maruziyet süresi (sıvılar için 30 dakika, katı maddeler için 6 saat) ve tek bir doku canlılığı kesme (MTT testi ile tespit edildiği üzere% 60.0) kullanır. EIT 95.5 / 68.2 / ve% 81.8 sens elde (44 sıvılar ve 39 katı) 83 kimyasallar için sonuçlara dayanarakiTivity / özgüllük ve doğruluk (SS & A) sıvılar için, katılar için / 68.4 100.0 / ve% 84.6, SS & A, ve 97.6 / 68.3 / ve genel SS & A için% 83.1. EIT düzenleyici test gereksinimlerini karşılamak için hayvanların kullanmadan sıvı ve katı kimyasalların geniş bir yelpazede göz irritasyon potansiyelini sınıflandırmak önemli katkıda bulunacaktır. EpiOcular EIT yöntemi TG 492 olarak OECD Test Rehberi içine 2015 yılında hayata geçirildi.

Giriş

Bu tür kozmetik, deterjan ve ev temizlik gibi tüketici ürünleri onlar gözlerle temas halinde ciddi hasar neden olabilir kimyasalların çeşitli içerir. Bu nedenle, göz tahrişi için bu ajanların test tüketici güvenliğini ¹ sağlamak için ABD ve AB düzenleyici kurumlar tarafından talep edilir. Karışımlar ve formülasyonlar göz tahrişi potansiyelinin değerlendirilmesi, aynı zamanda kimyasalların taşınması için AB Kozmetik Direktifi altında kozmetik maddelerin etiketlenmesi için REACH (Kayıt, Değerlendirme, Yetkilendirme ve Kimyasalların Kısıtlanması) ile mevzuat uyum için bir gereklilik olduğunu ve için pestisit ve ev ürünleri ² etiketlenmesi. Şu anda, düzenleyici kurumlar Kimyasalların Sınıflandırılması ve Etiketlenmesi (GHS) ³ Küresel Uyumlaştırılmış Sistemi kullanılarak göz tehlike değerlendirmesini gerektirir. GHS ağırlıklı Draize göz tahrişi testinde dayalı, en yaygın olarak kullanılan göz tahrişi deneyi hangi yabancı maddeler ve mildemirbaşlar Tavşan gözünde ⁴ katılgan zar kesesi içine, doğrudan eklenir. GHS sınıflamasına göre, GHS Kategori 1 (göz aşındırıcılar) göz dokularında veya maruz kalma ^3,5 izleyen 21 gün içinde tam olarak geri dönüşlü olmayan göz ve görme ciddi hasar şiddetli başlangıç ​​yaralanmasına neden kimyasallar test eder. GHS Kategori 2 maruziyet 21 gün içinde tam olarak geri dönüşlü olan gözün önemli değişiklikler meydana kimyasallar test eder. Koroziflerin veya tahriş edici olmayan test kimyasalları GHS yok Kategori olarak adlandırılır.

40 yılı aşkın için, Draize tavşan gözü testi kendi tekrarlanabilirlik eksikliği, insani tepkilerin abartılması ve canlı hayvanların ^5-8 kullanımı için eleştiriliyor. Bu kaygılar arıtma, indirgeme ve in vivo testte ⁹ değiştirilmesi için birçok önerilerde teşvik etmiştir. Valide hayvansal olmayan alternatifleri ihtiyacı daha da güçlendirildi(2009) Kozmetik (2005) kozmetik ürünlerinin güvenlik değerlendirmesinde hayvanların kullanılmasını yasakladı Direktifi ve malzemeyi Yedinci Değişiklik kabulü ^2.

1996 yılından bu yana, yeniden kornea gibi doku modeli yaygın hammadde, yüzey aktif madde bazlı formülasyonların tahrişi potansiyelini değerlendirmek için, kozmetik endüstrisinde kullanılan ve kullanım için tasarlanmış karışımları birleşik veya gözün yakın olan ^10-13. RHCE doku modelinin kullanılması doğal, sulandırılmamış formda doku yüzeyine test malzemesinin doğrudan topikal uygulama sağlar. Bu şekilde, suda çözünür olmayan formülasyonlar çözücüler ile inceltilmeden test edilebilir. Yaygın, uygulanabilir basit ve ekonomik yöntem için istek (Alternatif Yöntemler Doğrulama Avrupa Birliği Referans Laboratuarı Avrupa Merkezi) EURL ECVAM en cevaben Göz tahrişi Testi (EIT) bir singl kullanan hangie maruz kalma süresi ve etiketleme gerekmez malzemelerden göz tahriş edici ve korozif ayırmak mümkün (Şekil 1) ¹⁴ geliştirilmiştir. 83 kimyasalların (44 sıvılar ve 39 katı) için sonuçlara dayanarak, EIT 95.5 / 68.2 / ve% 81.8 duyarlılık / özgüllük ve doğruluk (SS & A) sıvılar için, katılar için 100.0 / 68.4 / ve% 84.6 SS & A ve 97,6 / elde 68.3 / ve genel SS & A için% 83.1.

2007 yılında, EURL ECVAM himayesinde Kozmetik Avrupa'da (eski Colipa) tarafından desteklenen bir multi-laboratuar öncesi doğrulama çalışması resmi doğrulama ¹⁵ o getirme hedefi ile EIT alaka ve güvenilirliğini değerlendirdi. Bu çalışmada, 298 bağımsız denemeler, yedi bağımsız laboratuvarda yapılmıştır. Çalışma sonuçları katılan tüm laboratuvarlar ¹⁵ arasında varyasyon düşük katsayılı tahmininde% 99.7 anlaşmasını gösterdi. Sonuç olarak, 2010 yılında EIT protokol resmi EURL ECVAM girdidoğrulama programı. Doğrulama çalışma, in vivo referans verileri (Draize tahrişi verileri) kullanılabilir hangi bireysel madde ve kimyasal karışımların da dahil olmak üzere 104 kodlu deney kimyasallar, kullandı. Bu çalışmanın başarısına dayanarak, OECD Taslak testi kılavuz It EIT UN GHS sınıflandırma ve etiketleme sistemine göre geniş bir malzeme yelpazesi göz irritasyon potansiyelinin sınıflandırılmasına önemli katkıda olacağı tahmin edilmektedir 2014 yılında sunuldu.

Protokol

Tedavi için RHCE Dokuların 1. Hazırlık - Day 0

1. Ticari insan kornea gibi epitel (RHCE) kiti aldıktan sonra, üzerinde. EIT tahlil (Tablo 2) gerçekleştirmek için gerekli olan tüm kit bütünlüğü için (kit ayrıntılar için bileşenleri görmek Standart Assay Kit Bileşenleri (Tablo 1) ve Gereçleri ve Malzemeleri kontrol alındığı gün 15 dakika süre ile oda sıcaklığına (, 24 oyuklu bir nakliye konteynerine) dokuları dengeye getirin.

Miktar	Ayıraç	Koşullar	Kaynak	Tanım	Son kullanma tarihi
1	EpiOcular dokuların contalı 24-çukurlu plaka (OCL-200)	2-8 ° C	Mattek	24 Tiss içerirHücre kültürü ues agaroz üzerinde, paketi ekler	72 saat
1 şişe, 200 mi	EpiOcular Analiz Ortamı (OCL-200-ASY)	2-8 ° C	Mattek	DMEM bazlı ortam	21 gün
1 şişe, 100 mi	Mg ++ -Alerjik Dulbecco's-PBS (DPBS) Ca ++	RT	Sigma-Aldrich, D5652 veya eşdeğer.	Ekler durulama için kullanılır	1 yıl
4	6-delikli plakalardaki	RT	Şahin	Tahlil protokol sırasında dokuları korumak için kullanılır	NA
2	12-yuvalı plakalar	RT	Şahin	Deney protokolü sırasında kullanılmış	NA
2	24-yuvalı plakalar	RT	Şahin	MTT gerçekleştirmek için kullanılan	NA
1 flakon, 0.5 mi	Metil asetat (CAS # 79-20-9)	RT	Sigma-Aldrich, Cat # 186325	Tahlilde PC olarak kullanılır	1 ay

Tablo 1: Standart Assay Kit Bileşenleri.

Ekipman / Malzeme	Için gerekli:
Nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% CO2, 90 ±% 10 nem)	Önce ve sırasında enkübe dokular tahliller
Laminar akış kaputu	Steril koşullarda güvenli çalışma
Vakum pompası (opsiyonel)	Orta ve çözüm çekiş
Plaka okuyucu fotometresi (96 oyuklu plakalar için)	Okuma OD
Plaka çalkalayıcı	Özütformazanların iyon
Steril, künt kenarlı forseps	Doku ekler Taşıma
-Saatler durdurun	Protokolde test materyalleri ve diğer zamanlı adımda uygulanması zamanlaması
Su banyosu (37 ± 1 ° C)	Isıtma medya ve MTT çözeltisi
Havan ve dibek	Taneli katılar Taşlama
Pozitif deplasmanlı pipet (50 ul)	Viskoz yarı katı maddelerin ve süspansiyon uygulanması
Ayarlanabilir pipetler (200 ul-2 mi)	Sıvı malzemelerin, deney ortamı ve MTT Uygulama
Önceden sterilize edilmiş ipuçları (200 ul ve 20 ul), Rainin Cat # HR-200F ve HR-20F (veya eşdeğeri)	Sıvı malzemelerin, deney ortamı ve MTT Uygulama
Geniş menfezli, önceden sterilize edilmiş uçları (250 ul), Rainin Kat # HR-250WS (ya da eşdeğeraynı yağı)	Viskoz yarı katı maddelerin ve süspansiyon uygulanması
8 oz / 220 ml kapları numune, Falcon Cat # 3540200 (veya eşdeğeri)	Dokuların Durulama
Steril tek kullanımlık şırıngalar (örneğin şırınga Omnifix-F, B. Braun Melsungen AG kedi Tüberkülin 1 ml. No 9161406V)	~ 50 mg katı malzemelerin teslim edilmesi (opsiyonel)
Ted Pella mikro spatula / kaşık, Ted Pella Inc., Cat # 13504 (veya eşdeğeri, keskin kaşık veya kemik küret, örneğin Aesculap, No: FK 623)	~ 50 mg katı malzemelerin teslim
Ca ++ ve Mg ++ serbest Dulbecco fosfat tamponlu tuzlu su (Ca ++, Mg ++ Serbest DPBS): Sigma-Aldrich, Katalog # D5652 (veya eşdeğeri)	Tahlil sırasında durulama dokular
Steril deiyonize su, doku kültürü notu (kalite, biyolojik veya eşdeğeri)	nc olarak kullan
96-gözlü düz tabanlı plakalar, Falcon (veya eşdeğeri)	OD okuma
Pamuk ucu swapları (steril)	Doku yüzeyini kurutma (opsiyonel)
Yapışkan bant veya Parafilm	Formazan ekstraksiyon sırasında plakaları kapsayan
MTT-100 deney kiti	MTT-Tiazolil mavi tetrazolyum bromürde belirteci (Sigma # M-5655) ve izopropanol özü içerir.

Tablo 2: Ekipman ve EIT gerçekleştirmek için gerekli malzemeler.

2. Steril koşullar altında, RHCE dokularla 24 oyuklu plaka içeren plastik torba açık ve steril gazlı bezi. Agarozjeli arasındaki hava kabarcıkları tüm dokuları kontrol edin ve takın. Insert alanı, kusurlu dokular veya doku WHI>% 50 ekleme kaplaması altında hava kabarcıkları ile kültürleri kullanmayın ch tamamen sıvı ile kaplıdır.
3. Test maddesi veya kontrol kodları ve pozlama süreleri ile 6-kuyucuğu etiketleyin. (Takım ile birlikte verilme), Analiz Ortamı alikosu 1.0 mi, önceden etiketlenmiş 6 oyuklu plakalara ait kuyucuklar içerisine, yaklaşık olarak 37 ° C'ye kadar önceden ısıtılmış.
4. Etiketli 6-plaka insert RHCE doku içeren her parçayı çıkarmak ve yerleştirmek için steril forseps kullanın. Bu adım sırasında, steril filtre kağıdı üzerine hafifçe blotting ile ucun dış tarafına yapışır kalan nakliye agaroz kaldırmak. Ekler altında sıkışmış hava kabarcıkları serbest bırakın.
5. 1 saat boyunca (37 ± 1 ° C 'de 5 ± 1% _CO2 ile SCC, nemli bir atmosferde) standart kültür koşulları 6 oyuklu plakalar içinde RHCE dokuları önceden inkübe edin.
6. 1 saat sonra, 37 ° C'ye ön ısıtılmıştır yeni tahlil ortamı içinde 1.0 ml analiz ortamı yerine ve SCC koşullarında RHCE dokuları inkübe (gece boyunca = O / N) (16-24 saat).

. ove_title "> 2 Ön tedavisi - 1. Gün

1. O / N inkübasyondan sonra, uygun bir pipetleme cihazı (Resim DPBS) ^Ca 2 + ^Mg2 + içermeyen-Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin 20 ul geçerlidir. DPBS dokulara yayılmış değil, hafifçe DPBS tüm doku yüzeyi ıslatan sağlamak için plaka üzerinde insert dokunun.
2. 30 ± 2 dakika süreyle SCC at RHCE dokuları inkübe.
   Bu adım, doku hidrasyonu için gerekli olan ve in vivo koşullarında taklit etmek için: edin.

3. Test Malzeme Pozlama İşlemleri

1. RHCE dokuları çoğaltmak için her test makale ve kontrolleri uygulayın (n = 2). Test maddesi dozajlama işlemi sıvı ve katılar için farklıdır. Topikal olarak uygulanan, bir pipet kullanılarak, sıvı test maddesi 50 ul uygulanır. Sıvılar için maruz kalma süresi 30 dakikadır. (Sodyum klorür 50 mg tutmak için kalibre) bir tesviye kaşık kullanılarak katı deney makalelerin 50 mg uygulayın. Eskikatılar için maruz kalması süresi 6 saattir.
   Not: Sıvılar, bir pipetleme cihazı kullanılarak uygulanabilir sıvı maddeler (örneğin, sıvılar, jeller, kremler) gibi tanımlanmıştır. Katılar, bir pipet kullanılarak tatbik edilemez sıvı olmayan maddeler (örneğin, tozlar, reçineli veya mumlu malzemeler) olarak tanımlanır.
   1. Test ürünlerinin fiziksel durumu belirlemek için kolay değilse, 15 dakika boyunca (37 ° C) bir su banyosu içinde test maddesi ile şişeleri yerleştirin. 37 ° C 'de sıvı hale bu deney ürünleri için, sıvılar için EIT protokol takip edin.
   2. Özellikle viskoziteli maddeler için bir pozitif yer değiştirme pipeti kullanarak.
2. İlk negatif kontrol ve pozitif kontroller Doz ve daha sonra test makaleleri doz.
   1. Negatif kontrol (NC) ve standart bir pipet kullanarak RHCE dokulara pozitif kontrol için (PC), 50 ul uygulayın. Kuzey Carolina, steril deiyonize sudur; PC metil asetat (CAS # 79-20-9) 'dir. Zaman testi, 30 dakika boyunca NC ve PC UygulaSıvı testi makaleler ing ve 6 saat boyunca katı testi makaleleri test ederken.

4. Test Madde Pozlama - 1. Gün

1. Sıvı testi makalelerin tedavisi için. Tablo 3'te verilen zamanlama programı izleyin bütün dokularda eşit pozlama sağlamak için her test maddesinin uygulamalar arasında 1 dakika aralıklarla bırakın.
   1. 30 ± 2 dakika ön işleme tabi DPBS sonra topik olarak topik uygun bir pipetleme cihazı kullanılarak RHCE dokusu üzerine 50 NC ve PC ul, ve her bir sıvı test ürününü uygular.
   2. Üst yüzeyi kapak doğrudan doku üzerine sıvı test maddesi 50 ul uygulanır. Viskoz malzemeler için ağzını genişletmek için pipet dar noktasını kes. Çok yapışkan malzemeler için, bir dozlama aygıtına test ürününü (doku ekleme veya plastik raptiye iç çapından biraz daha küçük bir çapa sahip bir düz başlı bir silindir) uygulanır, dozaj d terscıhazla ve doku üzerine yerleştirin test maddesi eşit temas doku yüzeyine böylece.
   3. Test makale dokusu yayılmış etmezse, hafifçe tüm doku yüzeyinde yayılır emin olmak için ekleme dokunun. Mekanik (bir pipet ile, örneğin) testi makalelerin yayılması bu dokulara zarar verebilir çünkü tavsiye edilmez.
   4. 30 ± 2 dakika süreyle SCC de dokuları inkübe.
2. Katı deney makalelerin tedavisi için -. Gün 1, Tablo 4'te verilen zamanlama programı izleyin bütün dokularda eşit pozlama sağlamak için her test maddesinin uygulamalar arasında 2 dk aralıklarla bırakın.
   1. 30 ± 2 dk öncesi tedavi DPBS sonra topikal uygun bir pipet cihazı kullanarak RHCE dokular üzerindeki 50 NC ul ve PC uygulayın.
   2. Katı test maddesi uygulaması için, insert çıkarın (n = 2) oyuk ve (steril bir yüzey üzerine yerleştirmek ör am kapağıultiwell plaka) ortama dökülüp bir test makale önlemek için.
   3. Düzletilmiş bir kaşık kullanılarak, topik olarak, doku yüzeyine test ürününün yaklaşık 50 mg uygulanır; doku yüzeyi tamamen test maddesi kapsamında olduğundan emin olun. Test makale dokusu yayılmış yoksa, doku tamamen test maddesi kapsamında olduğundan emin olmak için yan yana gelen hafifçe insert sallayın. Mekanik (bir pipet ile, örneğin) testi makalelerin yayılması bu dokulara zarar verebilir çünkü tavsiye edilmez.
      1. Gerekirse, test maddesi ile doku arasında daha iyi bir temas sağlamak için, bir havan ve havan tokmağı ile kristalin toz öğütün.
      2. Alternatif olarak, kafası olan bir 1 ml şırınga ile geçme kabı içinde doku kültürü doğrudan yer tozlar kesti. Şırıngaya Stuff tozları piston geri çekilir ve sonra aşağı pistonu basarak başvuruda zaman.
      3. Insertin dış duvar c iseontaminated örneğin, tozlar ile, bir steril gazlı bez ile parçacıkları silin.
   4. Dozlama sonrasında, kültür aracı maddesi içeren 6 oyuklu plakalara dokuların geri ve 15 dakika ± 6 saat boyunca SCC inkübe edilir.

5. Durulama

1. Test maddesi başına üç temiz bardak (150 ml kapasiteli) bir dizi hazırlamak ve DPBS 100 ml her biri doldurun. Her test yazıda, üç bardak farklı bir dizi kullanmaktadır.
2. 30 ± 2 dakika, sıvı malzemeler için maruz kalma ya da katı maddeler için 15 dakika maruz kalma ± 6 saat sonunda, kaldırma ve kullanılması durumunda dozaj cihazı atın.
3. Ince forseps ile plastik 'yaka' üst kenarını tutarak orta üzerinden RHCE doku içeren ekler kaldırın. Kullanım ve şişeden kolaylaştırmak için kavisli bir forseps kullanın. Forseps kullanarak yaka bir araya yinelenen ekler tutarak bir anda dokuları iki durulayın. Dikkatli olun nforseps ile dokulara zarar ot.
4. Temiz emici malzeme üzerine doku yüzeyine test makaleleri veya kontrolleri (kağıt havlu, gazlı bez, vb) Durusu
5. DPBS, yaklaşık 2 saniye DPBS dairesel hareketlerle girdap birinci çanak içine ekler Dip çoğunlukla DPBS ile doldurulur ve böylece ekler kaldırın ve tekrar beher içine sıvı süzün. Birinci cam kaba, bu işlem, üç kez tekrarlayın.
6. Aynı şekilde üç kez DPBS, her ikinci ve üçüncü kap içinde uçlar durulayın.
7. Emici malzeme üzerine ekleme kalan herhangi bir sıvı süzün. Yaklaşık 45 ° açı (açık uca aşağı) elemanını döndürün ve emici malzeme üst dudak dokunun.
   Not: Görünür test malzemesinin kaldırmak mümkün değilse, daha fazla durulama aşırı kullanım doku hasarı önlemek için yapılmalıdır.

6. Post-emmek

1. Durulamadan sonra,Hemen önce, önceden etiketlenmiş 12-oyuklu bir plaka içerisinde, oda sıcaklığına kadar ılıtıldı Analiz Ortamı içinde 5 ml dokuları bırakın.
2. Sıvı malzemeler için 12 ± 2 dakika ya da herhangi bir artık test ürününün uzaklaştırılmasını kolaylaştırmak için oda sıcaklığında bir katı malzeme için daldırılmış 25 ± 2 dakika boyunca doku inkübe edin.

7. Post-inkübasyon

1. Sonunda, daldırma süresi Post-Soak dokulardan analiz ortamında süzün ve bir emici malzeme üzerine ekler leke.
2. Sıcak Analiz Ortamı içinde 1 ml ihtiva eden, önceden etiketlenmiş 6 oyuklu bir plakaya ekler aktarın.
   1. Sıvı test materyalleri için SCC 120 ± 15 dakika boyunca dokuları inkübe.
   2. Katı test materyalleri için SCC 18 ± 0.25 saat dokuları inkübe.

8. MTT Canlılık Testi - 1. Gün (Sıvılar için Protokolü) ve 2. Gün (Katılar için Protokolü)

1. 120 Sonrası İnkübasyon sonrasında MTT gerçekleştirme77; Sıvılar için 15 dakika ve sırasıyla katılar için 18 ± 0.25 saat.
2. Bir ön-etiketli 24-kuyulu plakanın her oyuğuna 1.0 mg / ml MTT solüsyonu ve çözeltinin kısım 0.3 ml hazırlayın.
   1. Ticari MTT kiti (Tablo 5) kullanın:
   2. Kullanmadan önce 2 saat, oda sıcaklığında MTT konsantresi Çözülme. 2 MTT konsantresi ml ve 1.0 mg / ml MTT solüsyonu elde etmek için MTT seyreltici 8 ml birleştirin.
   3. Kullanılana kadar karanlıkta 4 ° C'de MTT çözeltisi saklayın. 1 günden fazla için MTT solüsyonu tutmayın.
3. Mesaj İnkübasyon sonunda, 6-çukurlu plaka her ekleme çıkarıp hafifçe bir emici madde üzerinde kurutunuz.
4. MTT çözeltisi 0,3 ml içeren 24 oyuklu bir plakaya ekler yerleştirin. Ekler altında sıkışmış hava kabarcıkları serbest bırakın. SCC 180 ± 10 dakika boyunca plaka inkübe edin.
5. MTT çıkarma
   1. MTT çözeltisi içinde 180 ± 10 dakika süreyle inkübe edildikten sonra, her bir ekleme kaldırma24 oyuklu plaka arasında bir emici malzemenin üzerine ucun alt bekletin.
   2. Olmayan renklendirici, sıvı test maddeleri (su altına batırılma ekstraksiyon) için: bu ekleme submerges böylece bir ekstraktan çözelti (izopropanol) 2.0 ml ihtiva eden bir ön-etiketli 24-çukurlu plaka içine ekler aktarın.
   3. Katı ve sıvı renklendirici için (non-dalgıç, özü çıkarılan çözeltinin kirlenmesini önlemek için ekstraksiyon): Bu ekleme daldırın etmez, böylece, özü çıkarılan çözeltinin 1,0 ml (izopropanol) ihtiva eden bir ön-etiketli 6-çukurlu plaka içine ekler aktarın.
      Not: İlgili negatif ve pozitif kontroller için aynı olmayan batık çıkarma gerçekleştirin.
6. (Plaka kapağı ve kuyu üst kenarı arasındaki veya standart bir plaka kapatıcı ile parafilm, gibi) plakalar kapatın. Orbital plaka karıştırıcısı üzerinde tabak yerleştirin ve MTT ayıklamak için 2 saat oda sıcaklığında 3 için sallayın.
   1. Alternatif olarak, 2-8 ekstraksiyon O / N gerçekleştirmek76; sallayarak olmadan karanlıkta C.
7. Olmayan renklendirici sıvı testi makaleleri (batık çıkarma) için: çıkarma süresinin sonunda, her sıvı geri kuyuya yerleştirin ve RHCE dokular ile ekler atmak süzün.
   1. Ekstre çözeltisi karıştırın ve plaka konfigürasyonu (Şekil 2) 'ye göre bir ön-etiketli 96-çukurlu plaka ihtiva eden uygun oyuklara İki 200 ul alikotları aktarın.
8. Katı ve sıvı renklendiriciler (non-batık çıkarma) için: çıkarma süresinin sonunda, dokular (dokuları delmek için emin olun) atın.
   1. Dokulardan ekstre çözeltisi ihtiva eden 24 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna, özü çıkarılan çözeltinin 1,0 ml ilave edilir. Özütleyici çözelti karıştırılır ve plaka konfigürasyonu (Şekil 2) 'ye göre bir ön-etiketli 96-çukurlu plaka ihtiva eden uygun oyuklara İki 200 ul alikotları aktarın.
9. T belirlemeO 550 590 nm arasında, tek bir dalga boyunda ekstre örneklerin optik yoğunluk (OD), bir plaka okuyucu ya da bir spektrofotometre ile (bir laboratuar içinde tutarlı olmalıdır).
   1. Çözünmeyen katılar nedeniyle bulanık ekstre çözeltilerinin santrifüj OD (buharlaşmayı önlemek için 4 ° C'ye kadar santrifüj soğumaya) ölçüm öncesinde çözüm durumunda. Olgu durulama, test makale (TA) kaldırmaz ve TA MTT azaltma müdahale, ek kontroller kullanılmalıdır. MTT azaltma ¹⁶ düzeltmek için detaylı bir SOP bakınız.
   2. Durumda, bir TA olması veya MTT ölçümü ile etkileşim renk elde etmek için gösterilmiştir, ilave deneysel bağlı renk miktarını belirlemek için yapıldı ve daha sonra dokulardan ekstre edilmelidir. Renkli deney ^Kanunun 16 düzeltmek için detaylı bir SOP bakınız.

Doku Canlılık Testi (Tablo 6 ve Şekil 3) & # 9. Hesaplamalar160;

1. Genel hesaplamalar
   1. Her bir deney için boş kontrol kuyuları (OD Blk) ortalama OD değerini hesaplayın.
   2. Aynı deney (Blk veriler düzeltilmiş) her OD değeri OD Blk çıkarın.
   3. Her doku (= düzeltilmiş OD) için iki eşit ortalama değerini hesaplayın.
2. Ortalama negatif kontrol (% 100 kontrol) her bir kontrol ve test maddesi göreceli olarak, iki kopya dokuların her biri yüzde canlılığı hesaplayın.
   Kalabilirlik (%) = [düzeltilmiş OD işlenmiş dokular / düzeltilmiş OD negatif kontrol] x% 100
3. Canlılığı (iki suret dokular arasındaki canlılığı fark) farkını hesaplayın.
4. Ortalama Test makale canlılığını (TA canlılığı) hesaplayın ve tahmin modeline göre deney makale sınıflandırır.

10. Tahmin Modeli (Şekil 3)

1. TA ile tedavi edilen doku canlılığı NC-muamele edilmiş ince v> 60,0 göreliyseiability, tahriş edici (NI) olarak deney makale (GHS No Kategori) etiket.
2. TA-işlenmiş doku canlılığı NC-muamele doku canlılığı 60.0 akrabası ≤ ise, tahriş edici (I) olarak deney makale etiket (GHS Kategoriler 1 ve 2).
   Not: EIT test sonuçları ise nitelikli olarak kabul edilir:
   • EIT NC OD> 0.8 ve <2.5;
   • (NC göre%) EIT PC doku canlılığı ≤50.0% olduğu;
   • İki çoğaltmak dokularda (NC, PC ve test maddesi) arasındaki fark% 20.0

Sonuçlar

10 Test makaleleri (TA) ve negatif ve pozitif kontroller ile yapılan Temsilcisi EIT sonuçları Tablo 6 ve Şekil 3'te sunulmuştur. NC% 100 doku canlılığı karşılık OD = 1.31 için, bu nedenle bilgisayar (OD ortalama = 0.41) ortalama vardı % 31,2 göreli doku canlılığı. EIT protokol katı pozlama protokolünü kullanarak, 4 laboratuvarda sıvı poz protokolü ve 8 bağımsız geçerli deneylerde kullanılarak 7 laboratuvarda 15 geçerli bağımsız deneylerde yapıldığında, sıvı protokolünü kullanarak PC için ortalama doku canlılığı 36.4 ± 4.0 idi ve% katı protokol için 32.3 ± 6.4%. Her durumda, pozitif kontrol sonuçları 60,0% ¹⁵ arasında kesme değerinin altında idi.

Şekil 3'te, TA1, TA2, TA4, TA7 gösterilen ve TA8 doku canlılıkları> 60.0% vardı ve bu nedenle "NI" olarak sınıflandırıldı kadar. TA3, TA5, TA6, TA9 ve TA10 dokusu Yaşama kabiliyetleri X vardı04;% 60.0 ve bu nedenle "ben" olarak sınıflandırıldı. Yinelenen dokular arasındaki doku canlılığının fark TA2 bir istisna ile tüm TA için <% 20.0 idi. Hepsi EIT kabul kriterlerini (Bölüm 10.2) tanıştığımızdan beri nedenle, TA2 bir istisna ile tüm test makaleleri, sonuçları, "nitelikli" olarak kabul edildi. Çünkü İlk deneyde, TA2 yinelenen dokular arasındaki yüksek değişkenlikten dolayı, ikinci bir deney kalifiye EIT sonuçları elde etmek için gerekli idi.

Burada RHCE doku modeli kullanılarak açıklandığı gibi EIT test yöntemi EURL ECVAM / Kozmetik Europe ^15,17-19 tarafından resmi doğrulama dahil olmak üzere birçok Multilaboratory geçerlilik çalışmalarında, oküler irritasyon değerlendirilmesi için kullanıldı. Çalışmaların tümünde, EIT tekrarlanabilir olduğu gösterilmiştir ve doğru kimyasallar (madde ve karışımlar her ikisi) göz tahrişi veya ciddi göz hasarı ac ​​için sınıflandırma ve etiketleme gerektirmeyen tespit başardıBM GHS ^15,17-19 kadar Cording. EIT test yöntemi duyarlılık, özgüllük ve genel doğruluk için göz tahrişi için Doğrulama Yönetim Grubu (VMG) kabul kriterlerini yerine getirmiş ve şu anda in vivo tavşan Draize testi ¹⁹ için kısmi yerine resmi uygulanmasını bekliyor.

Şekil 1: Sıvı ve katı deney ürünler için EIT protokol Anahat Kullanılan kısaltmalar: AM, tahlil ortamı;. SCC, standart kültür koşulları; PBS, Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin, RT, oda sıcaklığı.

Şekil 2:. MTT dokusu canlılık testinde, standart 96 oyuklu plaka konfigürasyonu iki 200 ul tam bölünen miktarları, trabir ön-etiketli 96-kuyucuklu bir plakanın uygun oyuklarına nsferred. Kullanılan kısaltmalar: NC, negatif kontrol; PC, pozitif kontrol; TA1-TA20 test makaleleri 1-20; Blank, ekstraksiyon maddesi. 96- MTT plaka konfigürasyonu RHCE doku canlılığını ve EIT sonuçları hesaplamak için tasarlanmış Excel ile kullanılır.

Şekil 3: EIT sonuçlar 10 deney makale, NC ve RHCE doku modeli kullanılarak PC kontrolleri için elde edilen grafik EIT sonuçlarını sunmak için tasarlanmış bir Excel elektronik oluşturulur.. NC 60.0 oranla% ≤ doku canlılığını azaltılmış test kimyasalları "tahriş edici (" I ", TA3, TA5, TA6, TA9 ve TA10) ve doku canlılığı> 60.0% non-Tahriş olarak sınıflandırılır vardı test kimyasalları (olarak sınıflandırılır NI ", TA1, TA2, TA4, TA7 ve TA8).

EIT protokol iş adımları için zaman (bir operatör için bir günlük iş) başlatın
Her bir satır dokuların bir çift tekabül
Adımların sırası:	1	2	3	4	5	6	7
Sıvılar:	PBS	TA Pozlama	Sonrası Islatmak	Sonrası	MTT Reaksiyon	MTT Ekstraksiyon	Tedbir
	30 dakika	30 dakika	12 dk	120 dakika	180 dakika	120 dakika	OD
NC	09:00	09:30	10:00	10:12	00:12	15:12	sonra
PC	09:01	09:31	10:01	10:13	00:13	15:13	17:30
TA-1	09:02	09:32	10:02	10:14	00:14	15:14
TA-2 </ strong>	09:03	09:33	10:03	10:15	00:15	15:15
TA-3	09:04	09:34	10:04	10:16	00:16	15:16
TA-4	09:05	09:35	10:05	10:17	00:17	15:17
TA-5	09:06	09:36	10:06	10:18	00:18	15:18
TA-6	09:07	09:37	10:07	10:19	00:19	15:19
TA-7	09:08	09:38	10:08	10:20	00:20	15:20
ng> TA-8	09:09	09:39	10:09	10:21	00:21	15:21
TA-9	09:10	09:40	10:10	10:22	00:22	15:22
TA-10	09:11	09:41	10:11	10:23	00:23	15:23

Tablo 3:. Sıvı test maddelerinin test için örnek zaman çizelgesi de dahil olmak üzere Protokol adımları ön ıslatma DPBS Test Makaleler Uygulama (TA), durulama ve dokuları ile Post-ıslatın, Post-kuluçka dönemi, MTT deneyi, MTT çıkarması, ve MTT OD ölçümü sütunlarında sunulmuştur. Yinelenen dokular için Vakitleri sıralar halinde düzenlenmiştir. Tüm tahlil test 10 TA ve kontroller bir günde bitmiş olabilir.

e_content ">

(2 gün, bir operatör için çalışmak) EIT protokol adımlar için başlangıç ​​zamanı
Her bir satır dokuların bir çift tekabül
1.gün					2. Gün (ertesi gün)
Adımların sırası:	1	2	3	4	5	6	7
Katılar:	PBS	TA Pozlama	Sonrası Islatmak	Sonrası Incubaction	MTT Reaksiyon	MTT Ekstraksiyon	Tedbir
	30 dakika	6 saat	26 dk	18 saat	180 dakika	120 dakika	OD
NC	09:00	09:30	15:30	15:56	09:56	00:56
PC	09:02	09:32	15:32	15:58	09:58	00:58	15:30
TA-1	09:04	09:34	15:34	16:00	10:00	13:00
TA-2	09:06	09:36	15:36	16:02	10:02	13:02
TA-3	09:08	09:38	15:38	16:04	10:04	13:04
TA-4	09:10	09:40	15:40	16:06	10:06	13:06
TA-5	09:12	09:42	15:42	16:08	10:08	13:08
TA-6	09:14	09:44	15:44	16:10	10:10	13:10
TA-7	09:16	09:46	15:46	16:12	10:12	13:12
TA-8	09:18	09:48	15:48	16:14	10:14	13:14
TA-9	09:20	09:50	15:50	16:16	10:16	13:16
TA-10	09:22	09:52	15:52	16:18	10:18	13:18

sonra

Tablo 4: Katı Test maddelerinin test için örnek zaman çizelgesi. Dahil Protokol adımlar ön ıslatma Durulama ve Post-ıslatın Post-kuluçka dönemi, MTT deneyi, MTT Ekstraksiyon ve MTT OD ölçümü sütunlarında sunulmuştur DPBS'de Test Makaleler Uygulaması ile dokuları. Yinelenen dokular için Vakitleri sıralar halinde düzenlenmiştir. 10 TA ve kumanda elemanlarının kontrol edilmesi Bütün tahlil, bir, iki günlük bir süre boyunca gerçekleştirilir.

Miktar	Ayıraç	Saklama Koşulları	Kaynak	Tanım	Son kullanma tarihi
1 flakon, 2 mi	MTT Konsantre (MTT-100-CON)	Işıktan koruyarak (-20ºC)	Mattek	Dondurulmuş MTT konsantre	2 ay
1 flakon, 8 mi	MTT seyreltici	2-8-# 186; C	Mattek	MTT konsantrasyonuna seyreltilmesi için, önceden MTT tahlilinde kullanma	2 ay
1 şişe, 60 mi	İsopropanol (CAS # 67-63-0)	RT	Sigma-Aldrich	Ekstraksiyon maddesi	NA

Tablo 5: MTT-100 Assay Kit Bileşenleri.

Kod N °	Doku	İşlenmemiş veri		Boş düzeltilmiş veri		OD demek	Canlılığının%
	n	Aliq. 1	Aliq. 2	Aliq. 1	Aliq. 2
NC	1	1,316	1,352	1,316	1,352	1,334	101.6
	2	1,277	1,309	1,277	1,309	1,293	98.4
PC	1	0,379	0.397	0,379	0.397	0.388	29.6
	2	0.419	0,442	0.419	0,442	0,431	32.8
TA1	1	1,213	1,244	1,213	1,244	1,229	93.5
	2	1,355	1,355	1,355	1,355	1,355	103.2
TA2	1	1,210	1,122	1,210	1,122	1,166	88.7
	2	0,828	0,837	0,828	0,837	0,833	63.4
TA3	1	0,167	0.168	0,167	0.168	0,167	12.7
	2	0.138	0.136	0.138	0.136	0.137	10.4
TA4	1	1,137	1,160	1,137	1,160	1,149	87.4
	2	1,262	1,191	1,262	1,191	1,227	93.4
TA5	1	0.610	0,621	0.610	0,621	0.616	46.9
	2	0.480	0.484	0.480	0.484	0.482	36.7
TA6	1	0,502	0,513	0,502	0,513	0.508	38.7
	2	0.396	0.407	0.396	0.407	0.402	30.6
TA7	1	1,048	1,050	1,048	1,050	1,049	79.9
	2	1,149	1.150	1,149	1.150	1.150	87.5
TA8	1	1,032	1,034	1,032	1,034	1,033	78.7
	2	0,941	0.935	0,941	0.935	0,938	71.4
TA9	0.022	0.022	0.022	0.022	0.022	1.7
	2	0.144	0.149	0.144	0.149	0,147	11.2
TA10	1	0.150	0.150	0.150	0.150	0.150	11.4
	2	0.254	0.255	0.254	0.255	0.255	19.4

1

	ortalama	Dif.	ortalama	Dif.	Dif. / 2	Sınıflama
	OD	OD	Yaşama kabiliyetleri [%]	canlılığında bir
NC	1,314	0.041	100.0	3.12	1.56	NI	nitelikli
PC	0.410	0.043	31.2	3.23	1.62	BEN	nitelikli
TA1	1,292	0.127	98.3	9.63	4.81	NI	nitelikli
TA2	0.999	0.333	76.1	25.36	12.68	NI	D> 20
TA3	0.152	0.030	11.6	2.32	1.16	BEN	nitelikli
TA4	1,188	0.078	90.4	5.94	2.97	NI	nitelikli
TA5	0,549	0.134	41.8	10.16	5.08	BEN	nitelikli
TA6	0,455	0.106	34.6	8.07	4.03	BEN	nitelikli
TA7	1.100	0.101	83.7	7.65	3.82	NI	nitelikli
TA8	0,986	0.095	75.0	7.23	3.62	NI	nitelikli
TA9	0.085	0.125	6.4	9.48	4.74	BEN	nitelikli
TA10	0.203	0.105	15.4	7.95	3.98	BEN	nitelikli

Tablo 6:. 10 deneme makale için elde edilen sonuçlar EIT, NC ve PC kontrolleri tabloları eşya vardırDoku canlılığı ve EIT sonuçları hesaplamak için tasarlanmış bir Excel elektronik tarafından uced. NC 60.0 oranla% ≤ doku canlılığını azaltılmış test kimyasalları "tahriş edici (" I ", TA3, TA5, TA6, TA9 ve TA10) ve doku canlılığı> 60.0% non-Tahriş olarak sınıflandırılır vardı test kimyasalları (olarak sınıflandırılır NI ", TA1, TA2, TA4, TA7 ve TA8).

Tartışma

Biz EpiOcular doku modeli için geliştirilen Göz tahrişi Testi (Şekil 1) sunduk. GHS Kategori ayırt etmez, burada sunulan EIT duyarlılığı ve özgüllüğü ^17. EIT yüksek derecesi ile etiketleme (GHS yok Kategori) gerekmez malzemelerden göz tahriş edici ve korozif (GHS Kategori 1 ve 2 kombine) ayırmak mümkün 1 Kategori 2 kimyasallar. EIT sınıflandırma ve kozmetik ve farmasötik maddeler dahil olmak üzere kimyasal, geniş bir oküler tahriş potansiyelinin etiketlenmesi için doğrulanmıştır. In vitro testlerde diğer ile birlikte, EIT in vivo tavşan göz tahrişi testi için bir yedek olarak hizmet verecek.

EIT maruz kalma ve maruz kalma sonrası kuluçka süresi (Şekil 1) uzunluğu değişir sıvı ve katı maddelerin, iki benzer ama farklı protokoller kullanmaktadır. EIT kullanılan son noktadaha önceden belirlenmiş bir insan epitel doku modellerinde ^20,21 kullanılmıştır MTT testi ile tespit doku canlılığı vardır. Bu testte gerçekleştirmek için, standart hücre kültürü ekipmanları dışında hiçbir özel ekipman gerektirmez. Nedeniyle yüksek doku-doku tekrarlanabilirliği seviyesinde, n = 2 dokuların yerine, genellikle tavsiye n = 3 kullanılır. Yetenek n kullanmak = nedeniyle bireysel dokuların ¹⁴ farklı kullanım için, böylece ortaya çıkabilecek tahlil değişkenliği en aza deneyimli bir operatör aynı anda iki dokuları işlemek için izin verir çünkü 2 dokular, protokolün önemli bir yönüdür. Ayrıca, pozitif ve negatif kontroller ile birlikte, test maddesi başına n = 2 dokuları, aynı fiziksel durumuna (sıvı ya da katı madde), 10 test maddelerinin tahriş kullanarak, bir kit (24 dokular) kullanılarak değerlendirilebilir.

Malzemelerin güvenilir sınıflandırılmasını sağlamak Diğer önemli noktalar pozitif kontrol su için özellikleri vardırbstance (doku canlılığı ≤50.0%), yinelenen dokularda (fark <% 20.0) ve negatif kontrol OD okumaları (> 0,8 ile <2,5) arasındaki tekrarlanabilirlik.

EIT testi yaparken kuluçka dönemlerinde protokol veya değişikliklerden sapma değişmiş sonuca neden olabilir, çünkü o, valide protokol ve önerilen doz ve durulama programları (Tablo 3 ve 4) kalınması önemlidir. Aynı şekilde, MTT inkübasyon için 3 saat süre sapmalar farklı MTT okumalarına neden olur ve tahlil sonucunu etkileyebilir.

Bazen, bir test kimyasal MTT dokusu canlılığı deneyi veya MTT nedeni azaltılmasına engel olabilir, optik veya diğer özelliklere sahip olabilir. Örneğin, bir test bir kimyasal ile doğrudan mavi-mor reaksiyon ürünü olarak MTT azaltabilir veya MTT formazana (~ 570 nm) ile aynı aralıkta ışığı emen renkli bir madde olabilir. Ancak bu test kimyasalları pr olacakMTT tahlili esnasında, malzemenin yeterli miktarda de ince üzerinde mevcut olan (ya da tarafından emilen) ise, sadece bir sorun ESENT. Bu girişimi önlemek için, geniş durulama prosedürleri EIT protokole dahil edilmiştir. TA kaldırmaz durulama ve TA MTT azaltma karışıyorsa, ek kontroller tespit etmek için kullanılan ve bunun için doğru olmalıdır. Test kimyasal doğrudan MTT indirgemesi şüphesi varsa Kısaca, söz konusu kimyasal madde 50 ul (ya da katı maddeler için 50 mg), SCC (NC steril deiyonize su, 50 ul çalışma MTT çözeltisi ile 3 saat süre ile inkübe edilir, olmalıdır ) aynı anda çalışacak. MTT çözeltisi mavi-mor dönerse, test maddesi MTT azalttı tahmin edilmektedir. Bu durumda dondurularak öldürülmüş doku kontrolleri kullanarak işlevsel bir onay test malzemesi dokuya bağlanmasının ve bir sahte MTT indirgemesi bir sinyal verilmesine yol olup olmadığını değerlendirmek için gerçekleştirilmelidir. TA-maruz kalan, öldürülen doku kontrolünde kayda değer MTT azalma varsa(Tedavi edilmeyen canlı dokuda miktarına göre), test maddesi ortalama dokusu canlılığı öldürülmüş kontrolün ortalama canlılığını çıkarılarak düzeltilmelidir.

Yalancı negatif sınıflandırmalar ^14,15,18 azlığı gösterdiği gibi EIT, güvenlik tarafında ^errs. Önemlisi, göze aşındırıcı ve GHS Kategori 1 kimyasallar, hiçbiri, en ciddi oküler tehlike temsil Bu deneyde ^14,15,18,19 olarak tahriş edici olmayan olarak sınıflandırılmıştır. Son olarak, nitro test yönteminde RHCE önemli avantajlarından biri düzgün sıvı ve (iki boyutlu, su altı hücre kültürleri ile mümkün değildir) katı maddeleri test olasılığıdır.

EIT UN GHS sınıflandırma ve etiketleme sistemine göre geniş bir malzeme yelpazesi göz irritasyon potansiyelinin belirlenmesinde önemli ölçüde katkıda bulunacaktır. Hayvanların yerine o belirlenmesiküler toksisite yıllardır toksikolojik araştırma hedefi olmuştur. EIT test yöntemi 2014 yılında EURL ECVAM tarafından desteklenen bir resmi doğrulama çalışması yapmıştır ve EpiOcular EIT 2015 yılında OECD TG 492 olarak OECD test Rehberi içine uygulanmıştır.