Fare İlköğretim Hepatositlerde Yağ Asidi Oksidasyon ve lipogenez Belirlenmesi

Özet

De novo lipogenez ve β-yağ asidi oksidasyon hepatosit kilit metabolik, yağlı karaciğer hastalığı da dahil olmak üzere birçok metabolik bozukluklar, içinde tedirgin olan yollar oluşturmaktadır. Burada fare primer hepatositlerin izolasyonu göstermek ve β-yağ asidi oksidasyon ve lipogenez ölçümü açıklar.

Özet

Karaciğerde lipid metabolizması karmaşıktır. Lipitin lipoproteinler yoluyla içe ve dışa aktarılmasına ek olarak, hepatositler lipidi yağ asidi oksidasyonu yoluyla oksitleyebilir veya alternatif olarak de novo lipogenez yoluyla yeni lipid sentezleyebilir. Bu yolların net toplamı, bazı hastalık durumlarında yağlı karaciğer hastalığına yol açan bir dizi faktör tarafından belirlenir. Aşırı karaciğer lipid birikimi tüm vücut insülin direnci ve koroner kalp hastalığı ile ilişkilidir. Hepatositlerde lipid metabolizmasını incelemek için kullanılan araçlar, bazı metabolik bozukluklarda hepatik lipid metabolizmasının rolünü anlamak için yararlıdır.

Karaciğerde hepatositler, sırasıyla β yağ oksidasyonu ve de novo lipogenez yoluyla yağ asitlerinin parçalanmasını ve sentezini düzenler. Bu yollardaki metabolizmanın ölçülmesi, hepatik lipid kullanımı hakkında bilgi sağlar. Primer hepatositlerin kullanıldığı in vitro kantifikasyondan farklı olarak, in vivo ölçümler yapmak teknik olarak zor ve kaynak yoğundur. Bu nedenle, kültürlenmiş fare hepatositlerinde β-yağ asidi oksidasyonu ve de novo lipogenezin ölçülmesi, hepatosit lipid kullanımını değerlendirmek için basit bir yöntem sağlar.

Burada birincil fare hepatositlerinin izolasyonu için bir yöntem açıklıyoruz ve radyoaktif işaretli substratlar kullanarak β-yağ asidi oksidasyonu ve de novo lipogenezin miktar tayinini gösteriyoruz.

Giriş

Alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı, Batılılaşmış kültürlerde karaciğer hastalığının önde gelen nedenlerinden biridir^1,2. Karaciğer içinde lipid birikimi, henüz bilinmeyen mekanizmalar yoluyla hücre ölümü, fibroz ve karaciğer yetmezliği ile ilişkilidir^3-6. Yağlı karaciğer hastalığında, hepatosit aracılı β-yağ asidi oksidasyonu ve de novo lipogenez, net lipid birikiminin önemli belirleyicileridir^7,8. Bu nedenle, bu makale hepatosit izolasyonuna odaklanacak, ardından β-yağ asidi oksidasyonu ve de novo lipogenezin miktar tayini yapılacaktır.

Hepatosit lipid metabolizmasını sorgulamak için çok sayıda metodoloji geliştirilmiştir. Kararlı izotoplar^9,10 kullanarak in vivo yağ metabolizmasını ölçmek mümkün olsa da, bu yöntemler maliyetlidir ve çok sayıda hayvan gerektirir. Ek olarak, eksojen kimyasalların etkisini araştırma yeteneği, in vivo deneylerin doğası gereği sınırlıdır. Buna karşılık, primer hepatositlerin fare karaciğerinden izolasyonu,^11'i takip etmek için uygun bir yol sağlar. Ayrıca, kültürde hepatositlerin incelenmesi, araştırmacıların in vivo deneylerin zorluklarını aşarken, çeşitli kimyasalların lipit işleme üzerindeki etkilerini incelemelerine olanak tanır. Son olarak, izole edilmiş hepatositler, tek bir hayvanın karaciğerinden türetildikleri için değişen genetikten kaynaklanan herhangi bir karışıklığı önler.

Burada hepatositleri izole ve kültürlüyoruz ve radyoaktif işaretli palmitat kullanarak β-yağ asidi oksidasyonunu ve de novo lipogenezi ölçüyoruz. Aşağıda ayrıntıları verilen protokol basit, etkili ve tekrarlanabilirdir.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri yerel ve federal düzenlemelere uygun ve kurumsal IACUC ve radyasyon güvenliği yönetiminin onayı ile yapılmalıdır.

1. Hazırlık

1. Birkaç gün önce tahlil için, Karaciğer Digest Medium (LDM) 500 ml şişe çözülme ve 50 ml konik tüpler içinde ~ 35 ml alikotları dondurursam. Kadar gerekli -20 ° C'de saklayın.
2. Bir gün önce tahlil için, otoklav ile temiz diseksiyon araçları önceden sterilize edin.
3. Analiz gününde, kollajen ile 24 oyuklu kültür plakaları gerekli miktarda muamele.
   1. PBS ile 50 kısım, 3 mg / ml fare kuyruk kolajeni 1 kısım karıştırın. Bir 24-yuvalı plakanın her oyuğuna yaklaşık 500 ul ilave edin ve oda sıcaklığında 3-5 dakika boyunca (RT) enkübe edilir. Kollajen çıkarın ve plaka kaput kuru hava için izin verir. En az bir ek tekrarlayın.
      Not: Kollajen kaplama reklamda bir haftaya kadar yapılabilirvance ve plakalar plastik sargı mühürlü 4 ° C'de saklandı.
4. 37 ° C'ye kadar çözülme LDM ve sıcak ve 1 N KOH kullanılarak 7.4'e pH ayarlamak: deney için LDM hazırlayın. Bir çevrimli 42 ° C su banyosunda 0.2 mikron şırınga filtresi ve yer kullanarak Filtre.
5. Su banyosu çevrimli 42 ° C'ye kadar Karaciğer Perfüzyon Orta Sıcak 25 mi.
6. Polivinilpirolidon çözeltisi ile kaplanmış% 90 kolloidal silika hazırlayın: polivinilpirrolidon ile kaplanmış koloidal silika 9 ml 10x DPBS 1 ml ilave edilir. 0.1 N HCI kullanılarak pH 7.4'e ayarlayın. Steril 0.2 um şırınga filtresi ile filtre. Oda sıcaklığında saklayın.
7. 37 ° C sıcak bir orta kaplama.

İlköğretim Fare Hepatositlerin 2. izolasyonu

1. Peristaltik pompa, boru ve diseksiyon tablo ayarlama: steril su, 10 ml, ardından damıtılmış su içinde 5 mi,% 70 etanol ile yıkama ile boru sterilize edin. Doldurmak için Karaciğer Perfüzyon Ortamında boru ve koşmak pompayı yerleştirinborunun tüm uzunluğu.
2. Kurumsal onaylı yöntem ile fare Kurban.
3. Karın boşluğuna açık parçalara ayır:% 70 etanol ile liberal fare karın püskürtün. Künt uç makas kullanarak, dermis yoluyla karın uzunluğunu orta hat kesi yapmak ve yanal yansıtır. Iç organları maruz periton benzer bir kesi yapmak.
   1. Yavaşça bağırsak yerinden, künt aleti kullanarak karın damarlanma karın inferior vena kava (IVC) bulun ve renal ven distal damar altına bir dikiş, koyun ortaya çıkarmak için
4. Distal sütür için, dikiş düzeyde ötesine ilerleyen, IVC içine bir iğne ve kateter yerleştirin. Hala yerinde iğne ile yerde tutmak için kateter etrafında dikiş kravat. Dikkatlice iğneyi çıkartın. Eğer kateter yoluyla akışı ile, doğru bir şekilde kan yapılır.
5. Bir pipet kullanarak, sağlanması, perfüzyon ortamına kateter kalan alanı doldurmakBu hava mevcut. Büyük bir özenle, kateter tüp takmak.
6. Akciğer boşluğuna açık parçalara ayır: hafifçe diyaframa maruz üstün karaciğer lobları yansıtmaktadır. Dikkatle sonra keskin uçlu makas ile diyafram delinme safra kesesi ve plevra damarsal önlemek için özen, plevra boşluğu maruz yanal kesi yapmak. Hepatik ven sadece proksimal torasik inferior vena kava etrafında bir bulldog kelepçe yerleştirin.
7. Portal ven kesin ve 3 pompa açmak - / dk 4 ml. Perfüzyon ortamı, yaklaşık 20 ml ile 5 dakika boyunca karaciğer Perfüzyon Ortamı ile karaciğer serpmek.
   Not: Karaciğer hemen tan / gri kırmızı değişmelidir. Karaciğer bölümleri kırmızı kalırsa, bu büyük olasılıkla kötü perfüzyon gösterir ve başarılı izolasyon olasılığı büyük ölçüde azalır. Perfüzyon sırasında dışarı çalışmaz ortamı sağlamak için dikkatli olun ve hiçbir kabarcıklar tüp girmek söyledi.
8. 5 dakika inkübasyondan sonra, stopPompa ve Karaciğer Digest Orta boru aktarın. (Orta tükenene kadar) 15 dakika - pompayı yeniden başlatın ve başka bir 10 için karaciğer serpmek.
9. Perfüzyon sonunda pompayı durdurun. Karaciğer pembemsi renge sahip ve biraz genişlemiş görünmelidir. Dikkatli diseksiyon ile karaciğer tüketim. Safra kesesi çıkarın ve 10 cm doku kültürü çanak karaciğer aktarmak.
10. Bir biyogüvenlik kabini, karaciğere Kaplama Orta 10 ml (Tablo 1) ekleyin. Yavaşça hepatositler kaldırmak ya forseps veya neşter kullanılarak karaciğer kazıyın. 50 ml'lik konik tüp 100 mikron hücre süzgeç ve transfer kullanarak süspansiyon Filtre. 50 ml konik tüp ek bir 10 Kaplama Orta ml ve havuzlu plaka yıkayın.
11. 350 xg, 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüj hücreleri Pelet.
12. % 90 koloidal silika, 10 mi po ile kaplanmış Kültür ortamı basınçla Kaplama Orta 10 ml tekrar süspansiyon pelet ekleyinlyvinylpyrrolidone. Adım 2.11 gibi yavaşça ve santrifüj karıştırın. Canlı hücreler, alt pelet ise santrifüjlemeden sonra, ölü hücreleri bir tabakası, karışımın üzerinde yüzen olacaktır.
13. Aspire ölü hücreler ve orta. Kaplama Medium, 2.11 gibi santrifüj 20 ml 2 kez yıkayın.
14. Kaplama Orta 10 ml süspanse hücreleri. Bir hemasitometre ile hücre sayımı ve kollajen ile tedavi edilmiş 24 oyuklu kültür tabaklarında 9 x 10 ⁴ hücre / çukur yerleştirin. 2 saat boyunca 37 ° C'lik bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde inkübe edin. Her plaka, yağ asidi oksidasyon deneyi TD lipogenesis tahlilinde biri için kullanılabilir.
15. İsteğe bağlı olarak, 37 ° C 'de, muhafaza edici ortam (Tablo 1) ve kültür kuyularının değiştirin. Deney sonuçları etkilemeden 3 gün - Hücreler 2 kültürlenebilir.

3. Yağ Asidi Oksidasyonu Deneyi

Uyarı: radyoaktivite kullanılması tehlikeli olabilir. Tüm satın alma, depolama, elleçleme, ve diRadyoaktif maddenin sposal kurumsal, eyalet ve federal düzenlemeler ve kurallara uygun olarak yapılmalıdır.

1. 16 - 20 saat önce tahlil için, ılık PBS ile hücreler 2 kez yıkayın. 20 nM glukagon ile serumsuz serum açlık Ortamı (Tablo 1) hücreleri değiştirme ve gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
   Not: fetal sığır serumu metabolik hormonların bilinmeyen bir konsantrasyon (örneğin insülin, glukagon) içerdiğinden, serum bu tahlilde üzerinde sahip olabileceği herhangi karıştırıcı etkileri ortadan kaldırmak için hücreleri açlıktan. Hücreler> 24 saat serum Açlık Ortamda yaşayabilir. Glukagon işleme hepatositlerde yağlı asit oksidasyonunu teşvik etmek için kullanılır.
2. Tahlilinde sabahı, ön inkübasyon ortamı, hazırlanması: 10 dakika boyunca 70 ° C'ye kadar, bir 100 mM çözelti ve ısı yapmak için, aşırı saf su içinde sodyum-palmitat, uygun bir miktarda yeniden süspanse edin. Bu arada, gerekli miktarda (24-iyi levha başına 0.5 mi) hazırlanması25 mM HEPES,% 1 BSA fraksiyonu V, ve 20 nM glukagon ile DMEM. 37 ° C'ye ısıtın.
   1. Çözündürülmüş sonra, ortama 250 uM nihai konsantrasyona kadar palmitat ekleyin. Orta-Kuluçka öncesi ve 2 saat 37 ° C'de inkübe hepatositlerin değiştirin. Daha sonra kullanılmak üzere 37 ° C 'de, bazı ön inkübasyon ortamı, ayırın.
3. İnkübasyon sırasında, nitrojen gazı altında buharlaştırma ile ¹⁴ C-palmitat, uygun bir miktarda (0,5 uCi / oyuk) kurutun.
   1. Örneğin, bir 24-çukurlu plaka içinde 24 örnekleri ölçmek için 1,5 ml'lik bir tüpe 0.1 uCi / ml ¹⁴ C-palmitat 120 ul transfer. Yavaş yavaş bir duman başlığı içinde 3-5 cm uzaklıktan çözelti üzerinden bir nitrojen gazı püskürtülerek solvent etanol buharlaştırılır. Tüpün alt kuru ^14C-Palmitat bırakarak, 40 dakika - çözücü içinde yaklaşık 30 buharlaşır gerekir.
4. Yaklaşık 15 dakika süreyle inkübe edildikten sona ermeden önce, ¹⁴ tekrar süspansiyon0,1 N NaOH içerisinde C = Palmitat (12.5 ul / uCi). 10 dakika boyunca 70 ° C'de inkübe edin. Sıcak ön inkübasyon ortamı, üç hacim ekleyin ve aşağı yukarı pipetleme karıştırılır.
5. Seyreltilmiş ¹⁴ C-palmitat 25 ul her bir başak. Hafifçe plaka sallanmasıyla karıştırın ve 90 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Bu deney, bir plakadır.
6. İnkübasyon sırasında, Filtre Kağıdı Plate (Şekil 1) hazırlar.
   1. Steril 24 plaka kapağı çıkarın. Kuyucuğun alt filtre kağıdı, bir 2 cm x 2 cm parçası yerleştirin. 4 "x 7" parafilm bir parça ile plaka Yerleşimi.
   2. Böyle bir mikropipet ucu kutusu gibi, büyük dikdörtgen bir nesne kullanarak, iyi açılışlarında parafilm perfore ve plaka geri kalanı üzerinde bir mühür oluşturmak için kuyular üzerinde parafilm ovalayın. Şimdi kuyuları kapsayan parafilm delikli çevreleri çıkarın. Plaka şimdi sıkı sıra o hariç tüm alanlarda parafilm ile kaplanmış olmalıdırpenings.
7. 10 dakika süreyle inkübe edildikten sona ermeden önce, bir filtre kağıdı tüm sıvı absorbe emin olarak, filtre kağıdı bir levhanın her çukuruna 3 N NaOH 200 ul ilave edin.
   1. Donmaya karşı isteğe bağlı olarak önceden bir taze 24-yuvalı plakaya orta aktarın. Bir kez PBS ile yıkandıktan sonra, 0.1 N HCI kalan hücreler lize edildi ve bir BCA aracıyla protein içeriğini hesaplar.
8. İnkübasyonun sonunda, sıvı nitrojen içinde Deney Plakası ek dondurularak. Tamamen geçmeden önce dondurulur her iyi sağlamak için dikkatli olun.
9. Deney plakası, her sıra için% 70 perklorik asit, 100 ul ekle. Hemen Filtre Kağıt Plate ile kaplayın. 2 st için oda sıcaklığında 80 rpm'de yörüngesel hızda bir orbital çalkalayıcı ve kaya plakaları yerleştirin.
10. İnkübasyondan sonra, örnekler işlem:
    1. Bir sintilasyon 4 ml sıvı sintilasyon sıvısına filtre kağıdı kareler transfer CO ₂ fraksiyonu ölçmek içinŞişe ve ölçü ¹⁴ C sinyali.
    2. Asit çözünebilir malzeme ölçen 1.5 ml mikrofüj tüpe orta 400 ul aktarma. 10 dakika süreyle maksimum hızda santrifüjleyin. Kısaca 1 kloroform-metanol (h / h) ve girdap: 2 500 ul Elde edilen üstte yüzere, 100 ul ekle.
       1. Yine karışımına su 250 ul ekleyin ve vorteks. 3,000 x g'de 10 dakika boyunca santrifüj örnekleri. Transfer sintilasyon şişesine 4 ml sıvı sintilasyon sıvısı üst fazın 200 ul ¹⁴ C sinyali ölçer.

4. lipogenez Deneyi

1. Akşam önce tahlil başlamadan, ılık PBS ile hücreler 2 kez yıkayın. 100 nM insülin Serum Açlık Orta hepatositler değiştirin. 37 ° C'de gece boyunca inkübe edin.
   Not: fetal sığır serumu bir metabolik hormonların bilinmeyen konsantrasyonu (örneğin insülin içerdiğinden, glukagon), Serum Bu testte üzerinde sahip olabileceği herhangi karıştırıcı etkileri ortadan kaldırmak için hücreleri açlıktan. Hücreler> 24 saat serum Açlık Ortamda yaşayabilir. İnsülin lipogenez uyarmak için bu deneyde kullanılır.
2. 100 nM insülin, 10 uM soğuk asetat ve 0.5 uCi ^3H-asetat başına iyi Serum Açlık Orta: lipogenezi Orta olun. Lipogenez Ortama hücreleri değiştirmek ve 2 saat süre ile 37 ° C'de inkübe edin. Çıkar bileşiklerin, test edilecek içerir.
3. İnkübasyon süresinden sonra, hücreler PBS ile 2 kez yıkayın. 0.1 N HCI içinde 120 ul kazınarak Hücreleri,. Rezerv 10 protein tayini için ul (BCA tahlili ile değerlendirilmesi), ve transfer 1,5 ml mikrofüj tüpüne 100 ul.
4. 2 500 ul ilave edilerek özü lipidler: 1 kloroform-metanol (h / h). Vorteks kısa ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. Su, girdap 250 ul ekleyin ve ek 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. Santrifüj örnekleri 3000 x g'de oda sıcaklığında 10 dakika. ÖzenleBir sintilasyon şişesine 4 ml sıvı sintilasyon sıvısına alt faz transferi ve ³ H aktivitesini ölçmek.

Sonuçlar

3 x 10 ⁷ toplam hücre - hepatosıt izolasyonlar genellikle 1 ile sonuçlanır. Gece boyunca inkübasyondan sonra, hücreler (Şekil 2), binükleer olacak birçoğu altıgen görünür. Sağlıklı hücreler, hücre ölümü göstergesidir granülasyon veya kabarcıkların, yoksun olmalıdır.

Genel olarak, yağ asidi oksidasyon deneyi, test bileşiği başına üç ila dört kez tekrarlanmış çalıştırılır. _CO2 numune için sayımlar asit çözünür malzeme elde edilenler yaklaşık beşte biri ol...

Tartışma

Perfüzyon kurban gelen zaman ideal bir perfüzyon ve karaciğer kollajenaz sindirimi için en az 3 dakika olmalıdır. Perfüzyon Orta ile perfüzyon başlatılır sonra, karaciğer hemen kırmızı soluk ila görünümünü değiştirmek gerekir. LDM inkübasyonu yaklaşık 10 dakika sonra, karaciğer, şişmiş ve pembe görünür. Perfüzyon yetersiz olması halinde, karaciğer, bu değişiklikler göstermezler olabilir ve bu, tipik olarak daha düşük bir hepatosit verimle sonuçlanır.

Yıkama adımlarının ardından, izole edilmi...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Karaciğer Perfüzyonu Orta Yaşam Teknolojileri		17701038
Karaciğer Sindirim Orta Yaşam Teknolojileri		17703034	Aliquot ve -20 ° C'de saklayın; C
	PBS Corning	21-040-CV
10X DPBS	Corning	46-013-CM
DMEM	Corning	10-017-CV
FBS	Yaşam Teknolojileri	26140079
Kolajen	Yaşam Teknolojileri	A1048301
Polivinilpirolidon GE	Yaşam Bilimleri	17-0891-01
Sodyum Pirüvat	Cellgro	25-000-CI
Penisilin / Streptomisin	Cellgro	30-001-CI
İnsülin	Sigma	I0516-5ML
Deksametazon	Sigma	D2915-100MG
Albümin (BSA) ile kaplanmış kolloidal silika, Fraksiyon V	MP Biyomedikaller	103703
24 Kuyulu Kültür Kabı	Corning Falcon	353047
Tygon S3 Boru	Cole Parmer	06460-34
Erkek Leur Kilidi - 200 Barb Konnektör	Cole Parmer	45518-00
24 G x 3/4" Kateter	SurFlo	SROX2419CA
Perma-El İpek	Sütür Ethicon	683G
Hücre Süzgeci	Corning Falcon	08-771-2
IsoTemp 3013HD Devridaim Su	Banyosu Fisher	13-874-3
MasterFlex C/L Peristaltik Pompa	MasterFlex	HV-77122-24
Mikrokelepçe	Roboz	RS-7438	Otoklavda ön sterilizasyon
5" Düz, Künt-Künt Ameliyat Makası	Roboz	RS-6810	Otoklavda ön sterilize
24 mm Bıçak Düz, Keskin Uçlu Mikrodiseksiyon Makası	Roboz	RS-5912	Otoklavda ön sterilizasyon
4" 0.8 mm Uç Mikrodiseksiyon Forseps	Roboz	RS-5130	Otoklavda ön sterilizasyon
4" 0.8 mm Uç Tam Eğri Mikrodiseksiyon Forseps	Roboz	RS-5137	Otoklavda ön sterilizasyon
60 ml Şırınga	Becton Dickinson	309653
50 ml konik tüpler	Corning Falcon	352070
BCA Protein Testi	Thermo Scientific	23225
Biyogüvenlik Kabini
CO2 İnkübatör
Serolojik pipetler
1.000, 200, 20 & mu; l Pipet ve uçlar