Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Beyindeki granü hücre kültürlerinden mikroglia zayıflatılması, L-lösin metil ester

8.3K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/52983

⸱

7 Temmuz 2015

 ,  , 
1Department of Neurology, University of Washington, 2Therapeutic Innovation Group, School of Life and Medical Sciences, University College London, 3Department of Neuroinflammation, University College London

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Microglia, çeşitli hücre dışı otonom mekanizmalarla kültürdeki nöronları ve diğer gliaları etkileyebilir. Burada, primer nöronal kültürlerden mikroglia'yı seçici olarak tüketmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, mikroglial-nöronal etkileşimlerin rolünü aydınlatma potansiyeline sahiptir ve nöroinflamasyonun ayırt edici bir özellik olduğu nörodejeneratif durumlar için çıkarımlar vardır.

Özet

MSS'nin yerleşik immünokompetan hücreleri olan mikroglia, nöronal fonksiyonu modüle etmede ve kontrol etmede ve ayrıca doğuştan gelen bağışıklığa aracılık etmede çok yönlü roller oynar. Birincil kemirgen hücre kültürü modelleri, nöronal-glial etkileşimler hakkındaki anlayışımızı büyük ölçüde geliştirmiştir, ancak son zamanlarda karışık kültürlerden mikroglia'yı spesifik olarak ortadan kaldırmak için yöntemler kullanılmıştır. Burada açıklanan böyle bir teknik, makrofajlar ve mikroglia tarafından içselleştirilen ve burada lizozomal bozulmaya ve ardından apoptoza neden olan bir lizomotropik ajan olan L-lösin metil esterin kullanılmasıdır13,14. L-lösin metil ester kullanılarak yapılan deneyler, mikroglia'nın çeşitli kültür koşulları altında çevredeki hücresel ortama katkısını belirleme gücüne sahiptir. Laboratuvarımızda optimize edilmiş bir protokol kullanarak, P5 kemirgen serebellar granül hücre kültüründen mikroglia'nın nasıl ortadan kaldırılacağını açıklıyoruz. Bu yaklaşım, mikroglia'nın deneysel veriler üzerindeki göreceli etkisinin değerlendirilmesine ve ayrıca mikroglia'nın inme, Alzheimer veya Parkinson hastalığı gibi nörolojik durumların kültür modellerinde nöroprotektif veya nörotoksik bir rol oynayıp oynamadığını belirlemeye olanak tanır.

Giriş

İnsan beyni tahmini 85000000000 nöron ve glial 1 de dahil olmak üzere 85000000000 bir başka nöronal-olmayan hücreleri ihtiva eder. Olarak İngilizce'ye tercüme 'glia' dolayısıyla Yunan etimolojisi - sinirbilimciler nöronal hücre popülasyonu üzerinde ağırlıklı olarak odaklanmıştır son 100 yıl daha fazla parçası için, glial hücreler inanan nöronlar için yapısal destek sağladı pasif destek hücreleri biraz daha fazla olması 'tutkal'. Son zamanlarda, ancak nöronal-glial etkileşimleri nörobiyoloji, nörofizyoloji ve birçok nörodejeneratif hastalıkların oluşumu ve ilerlemesinde temel yönlerine çok daha temel olabileceğini giderek daha belirgin hale gelmiştir. Serebellar granül hücreleri (CGCs), insan beyninde en bol homojen nöronal nüfus, beyincik hakim ve hücresel bileşenlerin% 90'ından fazlasını oluşturuyor. Sonuç olarak, bu hücreler, t için bir model sistem olarak in vitro kapsamlı olarak kullanılmaktadırO nöronal gelişim, işlev ve patoloji 2-6 çalışma.

Bununla birlikte, CGC kültürleri halen en önemli oranlarda mikroglia ve glia içerir. Sonuç olarak, varsayım olarak farklı hücre tedavilere doğrudan nöronal yanıt veren CGC veriler, aslında ortaya çıkabilecek - kısmen veya toplam - kültürde glia komşu dolaylı, ikincil karşılık gelen. Bu değerlendirme için, seçici olarak, L-lösin metil ester (LME) yardımı ile CGC nöronal kültürlerde mikrogliyal ortadan kaldırmıştır. LME orijinal seçici makrofajlar 7 yok etmek için kullanılan bir lysomotropic madde olduğu için ve aynı zamanda seçici olarak nöral, astrosit ve karışık glial kültürler 8,9,10 gelen mikroglia tüketmek için kullanılmıştır. LME o lizozomal bozulması ve sonraki apoptoz 13,14 sebep olup, makrofajlar ve mikroglia tarafından içselleştirilir. Makrofajlar ve mikroglia onları particula olmaya neden lizozomlarda karakteristik zenginLME tedavisine maruz kalma üzerine rly hassas. Bu protokol GCG'ye ve diğer nöronal / glial kültür sistemleri kullanılarak deneylerde mikroglia katkısını araştırmak için güçlü, henüz basit ve kolay bir yol sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Burada tarif Bütün deneyler Birleşik Krallık Hayvanlar (Bilimsel Prosedürler) 1986 Yasası uyarınca yapıldı.

Araçların, Kültür Medya ve Yemekleri 1. Hazırlık

  1. İki paslanmaz çelik laboratuar kesme makasları ve iki paslanmaz çelik laboratuar forseps hazırlayın. Bir kültür kukuleta O tüm aletleri ve yer Otoklav / N sterilizasyon ultraviyole ışık (UV) ışık altında.
  2. Minimum temel ortam (MEM), kültür ortamı (500 ml yapmak% 10 Fetal Sığır Serumu [FBS], 20 mM KCI, 25 mM NaHCO 3, 30 mM D-glukoz, 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin ve 6 ug / ml ampisilin) ​​ve filtre sterilize edin. Ay için 4 ° C'de depolayın.
  3. 14 mm, 1 numaralı kalınlık lamelleri içeren 24 kuyu kültür tabak hazırlayın. Daha önce tarif edildiği gibi 3, 100 mg / L, poli-D-lisin (PDL) lamelleri ve kat otoklava. UV ışığı O / N sterilize edin.

CGC Kültür Çözümleri 2. Hazırlık

  1. Tedavi otoklavlanmış, UV ışığı, steril dH 'Çözelti A' (100 mi) Hazırlama glikoz, 250 mg, sığır serumu albümin [BSA], 300 mg, fosfat tamponlu salin [PBS] (Ca + 2 ve 955 mg 2 O Mg) + ücretsiz ve% 3.8 1 ml MgSO 4 · 7H- 2 O.
  2. Çözelti A 9 ml seyreltilmiş / ml tripsin 5 mg 1 ml içeren "çözelti, B '(10 mi) Hazırlama
  3. 'Çözelti C' 1000 birim DNAaz, soya fasulyesi tripsin inhibitörü, 0.5 mg, çözelti A ile 10 ml olacak şekilde seyreltildi% 3.8 MgSO 4 · 7H 2 O 100 ul, ihtiva eden (10 mi) Hazırlama
  4. Çözelti A ile 20 ml olacak şekilde seyreltildi çözelti C 3.2 ml, içeren "çözelti, D '(20 mi) Hazırlama
  5. · 7H 2 O EBSS, 25 mM NaHCO 3, 3 mM MgSO 4 BSA / Earle Dengeli Tuz Çözeltisi (EBSS) çözeltisi hazırlayın ve% 4 BSA, pH 7.4, daha önce tarif edilen 3.
  6. , 150 mM LME bir son konsantrasyon elde etmek için MEM kültür ortamı 5 ml saf LME ekleyerek LME Hazırlama bir tezgah üstü pH metre kullanılarak pH 7.4'e çözelti döner ve filtre, bir 28 mm, polieter sülfon (PES) 0.2 mikron bir şırınga kullanılarak sterilize Filtre.

3. CGCs Kültürleme

  1. Daha önce 3 açıklandığı gibi 4-7 gün eski sıçan yavrularından cerebella toplayın. Buz üzerinde 5 ml solüsyon A içeren Petri kabındaki hemen yerleştirin.
  2. Petri kabı kapağı cerebella ve yer dokusundan fazla çözüm kapalı dökün.
  3. En az üç farklı yönlerde iyi Alevli jilet ile ince doku doğranır.
  4. 5 dakika boyunca 37 ° C'de su banyosu içerisinde çözeltisi (kaybolur, sınırlı doku sağlamak için solüsyonu ile Petri kabı durulama) B ve yere doğranmış doku ekleyin. Min yavaşça her çift sallayın.
  5. Tripsin, sarsıntısından yüzde nötralize etmek için tüp D çözeltisi (20 mi) ilave5 dakika boyunca 65 xg'de rifuge.
  6. Süpernatantı dökün.
  7. Süspansiyon mümkün olduğu kadar homojen hale gelinceye kadar, çapı azaldıkça üç alevli bir cam pipet ile iyice Çözelti C trituratının 4 ml (yaklaşık 10 kat her) içinde süspanse edin.
  8. Yavaş yavaş ve hafifçe BSA / EBSS'ye üstünde Bu homojenat birkaç damla ekleyin. O BSA / EBSS'ye aracılığıyla batmaya başlarsa, daha çiğnemek ve / veya homojenat BSA / EBSS'ye üstünde bir tabaka halinde oturmak gerekir biraz daha çözüm C. ekleyin. Sallamayın. 5 dakika boyunca 100 xg'de Spin.
  9. Süpernatantı ve MEM orta 1 ml tekrar süspansiyon pelet (yumuşak) sökün.
  10. MEM ortamı içinde 500 ul 800,000 hücre / Lamel bir hemositometre ve plaka kullanarak hücreleri sayın. % 6 CO2 ile 37 ° C 'de, bir kuluçka makinesi içinde yer.
  11. Ortamı aşağıdaki gün (hazırlık sonrası 24-36 saat) değiştirin. Hücre döngüsü önleyicisi arabinofuranozil sitidin (AraC) 10 uM içeren MEM ortam maddesi içeren bir çözelti yapmak.
    1. Her biri içinLamel, sırt hücreleri ve kontör eski orta 250 ul ekleyin, taze 24 plaka eski orta 250 ul korumak kalanını aspire normal MEM orta 250 ul ekleyin ve sonra, hücreler yıkamak için bu aspire Araç-içeren ortama, 250 ul.
      Not: Hücreler, in vitro (DIV), 6 gün arasında kullanılabilir.

4. Seçici mikrogliada İncelten (6 DIV de yapılır)

  1. 150 mM LME bir son konsantrasyon elde etmek için MEM ortamı ayrı bir kısım, 5 ml saf LME ekleyin.
  2. PH 7.4 çözüm dönün ve filtre 28 mm polieter sülfon (PES) 0.2 mikron şırınga filtresi kullanılarak sterilize edin.
  3. Kontrol kültürleri için normal bir MEM ortam maddesi ile birlikte 10 dakika boyunca 37 C 'de bir su banyosunda MEM ortamı ve yerine 50 mM (2 x LME) bir konsantrasyona kadar seyreltilir.
  4. Yarısını (250 ul), CGC kültürleri MEM Ortamı çıkarın ve 37 ° C'de saklayın.
  5. Sağlıgı hücrelerya da kontrol kültürleri için LME olmayan, önceden ısıtılmış MEM ortam maddesi (250 ul) ile 25 mM arasında iyi olarak konsantrasyonu veren 1: örneğin, 2 x LME (250 ul) ihtiva eden MEM ortam maddesi, 1 seyreltilmiştir.
  6. 1 saat boyunca% 6 CO2 ile nemli bir atmosferde 37 ° C'de inkübe hücreleri.
  7. Iki kez, taze, önceden ısıtılmış MEM ortamı içinde yıkayın hücreleri LME içeren medya kaldırmak ve daha sonra kalan kültür ortamı ve ilgili çukurlara taze, önceden ısıtılmış MEM ortamının eşit bir hacmini değiştirmek için kullanılır.
  8. (37 ° C'de% 6 CO2 ile nemlendirilmiş) inkübatör kültürler dönün ve başka tedavi öncesi 24 saat dinlenmeye bırakın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

seçici CGC ve / veya karışık kültürlerden mikroglia ortadan kaldırmak için bu tekniğin yeteneği doğru tespit etmek ve bunların çevredeki hücrelerden mikroglia ayırt etmek araştırmacının sonraki yeteneğine dayanır. Şekil 1 'de gösterildiği gibi, bu, örneğin isolectin-B4 gibi bir mikroglial spesifik hücre makinesi kullanılarak elde edilebilir. Şekil 2'de de gösterildiği gibi, astrosit ve nöronal yoğunluk ve morfolojisi gözlenebilir bir değişiklik, her ana tedavi grubu ile ilgili o...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

En önemli adımlar CGC gelen mikroglia başarılı bir şekilde seçici olarak ortadan kaldırılmasını sağlamak için ve / veya karışık kültürler: 1) steril ve sağlıklı CGC kültür muhafaza edilmesini; 2) Filtre LME içeren ortamı sterilize ve pH 7.4 çözüm dönen; 3) muhafaza CGC medyayı tutmak ve 37 ° C'de medya LME içeren Isı çarpmasını önlemek için C °; ve 4) hücreler inkübatör dışında tutulur süresini azaltmak için hızlı çalışıyor.

Daha önce laboratuarımızda optimize bir konsantras...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu araştırma, Aims2Cure, Birleşik Krallık ve UCL Etki Ödülü Doktora öğrencisi JMP'ye ve MRC Kapasite Geliştirme Doktora öğrencisi tarafından desteklenmiştir. JMP'ye Demans alanında öğrenci.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Forseps Sigma-AldrichF4142Kavisli uç, beyinciğin çıkarılmasını kolaylaştırır 
Mikro diseksiyon makasıSigma-AldrichS3146Düz, keskin nokta kemirgen P4-7 diseksiyonunu kolaylaştırır 
L-lösin metil ester hidroklorürSigma-Aldrich7517-19-3
EBSS çözeltisi Sigma-AldrichE7510-500 ml
Poli-D-lizinSigma-Aldrich27964-99-4Kullanımdan 1 gün önce ceket lameller 
Sığır serum albümini (BSA)Sigma-AldrichA9418
Fosfat tamponlu salin (PBS)Sigma-AldrichP4417
DNaseSigma-AldrichD5025
Soya fasulyesi tripsin inhibitörü ve nbsp;Sigma-AldrichT6414
Fare anti-ED1 antikoru Abcamab31630

Kaynaklar

  1. Herculano-Houzel, S. The remarkable, yet not extraordinary, human brain as a scaled-up primate brain and its associated cost. PNAS. 26 (109), 10661-10668 (2012).
  2. Evans, G. J., &Pocock, J. M. Modulation of neurotransmitter release by dihydropyridine-sensitive calcium channels involves tyrosine phosphorylation. Eur J Neuro. 11 (1), 279-292 (1999).
  3. Kingham, P. J., Cuzner, M. L., Pocock, J. M. Apoptotic pathways mobilized in microglia and neurones as a consequence of chromogranin A-induced microglial activation. J Neurochem. 73 (2), 538-547 (1999).
  4. Contestabile, A. Cerebellar granule cells as a model to study mechanisms of neuronal apoptosis or survival in vivo and in vitro. Cerebellum. 1 (1), 41-55 (2002).
  5. Kramer, D., Minichiello, L. Cell culture of primary cerebellar granule cells. Methods Mol Biol. 633, 233-239 (2010).
  6. Facci, L., Skaper, S. D. Culture of rat cerebellar granule neurons and application to identify neuroprotective agents. Methods Mol Biol. 846, 23-37 (2012).
  7. Thiele, D. L., Kurosaka, M., Lipsky, P. E. Phenotype of the accessory cell necessary for mitogen-stimulated T and B cell responses in human peripheral blood: delineation by its sensitivity to the lysosomotropic agent, L-leucine methyl ester. J Immunology. 131 (5), 2282-2290 (1983).
  8. Giulian, D., Vaca, K., Corpuz, M. Brain glia release factors with opposing actions upon neuronal survival. J Neurosci. 13 (1), 29-37 (1993).
  9. Guillemin, G., et al. Obtention and characterization of primary astrocyte and microglial cultures from adult monkey brains. J Neurosci Res. 49 (5), 576-591 (1997).
  10. Hewett, J. A., Hewett SJ,, Winkler, S., Pfeiffer SE, Inducible nitric oxide synthase expression in cultures enriched for mature oligodendrocytes is due to microglia. J Neurosci Res. 56 (2), 189-198 (1999).
  11. Jebelli, J., Hooper, C., &Pocock, J. M. Microglial p53 activation is detrimental to neuronal sysnapses during activaton-induced inflammation: implications for neurodegeneration. Neurosci Lett. 7 (583), 92-97 (2014).
  12. Frade, J., et al. Glutamate induces release of glutathione from cultured rats astrocytes – a possible neuroprotective mechanism. J Neurochem. 105 (4), 1144-1152 (2008).
  13. Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J Neurosci Methods. 150 (1), 128-137 (2006).
  14. Morgan, S. C., Taylor, D. L., Pocock, J. M. Microglia release activators of neuronal proliferation mediated by activation of mitogen-activated protein kinase, phosphatidylinositol-3-kinase/Akt and delta-Notch signalling cascades. J Neurochem. 90 (1), 89-101 (2004).
  15. Crocker, S. J., Frausto, R. F., Whitton, J. L., Milner, R. A novel method to establish microglia-free astrocyte cultures: comparison of matrix metalloproteinase expression profiles in pure cultures of astrocytes and microglia. Glia. 56 (11), 1187-1198 (2008).
  16. Kumamaru, H., et al. Liposomal clodronate selectively eliminates microglia from primary astrocyte cultures. J Neuroinflamm. 9, 116(2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Mikroglia Azalt lmasSerebellar Gran l H cre K lt rPrimer Kemirgen K lt rmm nokimyasal Floresan MikroskopiHemositometre ile H cre Say mDoku Sindirim ProtokolSantrif j Y kama BasamaklarN rodejeneratif Hastal k ModelleriApoptoz Kantifikasyonu
Beyindeki granü hücre kültürlerinden mikroglia zayıflatılması, L-lösin metil ester
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.