Method Article

Nanoparçacık Toksisite Testi için Kupffer hücre izolasyonu

DOI:

10.3791/52989

⸱

August 18th, 2015

 ,  , 
1Institute of Pharmaceutical Science, King's College London

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kupffer hücreleri olarak adlandırılan karaciğer makrofajları, dolaşımdaki nanopartiküllerin yakalanmasından sorumludur. Burada Kupffer hücre izolasyonu için yüksek hücre saflığı ve verimine sahip bir yöntemi açıklıyoruz. Modifiye LDH testi, Kupffer hücrelerinde karbon nanotüplerin neden olduğu toksisiteyi ölçmek için burada kullanılır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In vitro çalışmalar nanotoxicological büyük çoğunluğu onların pratiklik için ölümsüzleştirdi hücre hatları kullandık. Bununla birlikte, ölümsüzleştirilmiş hücre çizgileri veya primer hücrelerde nanopartikül toksisite testi sonuçları in vitro deneyler için birincil hücrelerin kullanımını genişletmek için ihtiyaç ortaya farklılıklar göstermiştir. Bu protokol, fare karaciğer makrofaj izolasyonu, adı Kupffer hücreleri ve nanoparçacık toksisitesini incelemek için kullanımlarını tarif eder. Kupffer hücrelerinin vücuttaki en bol bulunan makrofaj popülasyonu ve nanopartiküller dolaşımdaki yakalama sorumlu retiküloendotelyal sistem (RES) bir parçasını oluşturmaktadır. Burada bildirilen, Kupffer hücre izolasyon yöntemi yoğunluk gradyanı üzerinde saflaştırma, ardından 2-aşamalı bir perfüzyon metoduna dayanır. kolajenaz sindirimi ve yoğunluk santrifüj göre yöntem olup, Smedsrød ve arkadaşları tarafından geliştirilen bir protokolden uyarlanmıştır. sıçan karaciğer hücre, izolasyon için tasarlanmışn ve yüksek bir verim sağlar ve Kupffer hücreleri, yüksek saflıkta (>% 95) (14 x 10 6 fare başına hücre kadar). Bu izolasyon yöntemi sofistike ya da pahalı ekipman gerektirmez ve bu nedenle karmaşıklığı ve hücre verimi arasında ideal bir uzlaşma temsil etmez. ağır farelerde (35-45 gr) kullanılması izolasyon yönteminin verimini artırır ama aynı zamanda son derece portal ven kanülasyonu prosedürü kolaylaştırır. CNT f işlevselleştirilmiş Karbon nanotüplerin toksisite modifiye LDH testi ile bu modelde ölçülmüştür. Bu yöntem, ön-CNT ile inkübasyondan sonra, Kupffer hücre zarı yapısal bütünlüğünün eksikliği ölçülerek hücre canlılığı değerlendirir. F CNT neden olduğu toksisite izole Kupffer hücreleri nanoparçacık toksisite testleri için faydalı olduğu öne bu tahlili kullanılarak sürekli olarak ölçülebilir. Nanotoksikoloji genel anlayış klinik çeviri daha verimli için nanoparçacık seçim yaparak, bu tür modellerden yarar olabilirkatsayısıdır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nanotoksikoloji araştırması alanı, nanopartiküller biyolojik etkisini belirlemeyi amaçlamaktadır. In vivo araştırmalara dayalı Toksikolojik çalışmalar en doğru yöntemleri kalır. Ancak, bunların kullanımı maliyet, emek ve zaman gereksinimleri 1 ile sınırlıdır. Alternatifler, in vitro tahliller için basitlik ve vitro test platformları 2 yüksek verim yakalanma olasılığı kullanılmıştır gibi - yani test edilen koşullar sayısını uzanır. En nanotoxicological çalışmalar, ölümsüz hücre çizgileri ile in vitro deneyler kullanılarak gerçekleştirilir. Ancak, in vivo toksikolojik etkileri 3 bu deneysel bulguların ekstrapolasyonuna konusunda endişeler vardır. Gerçekten de, ölümsüzleştirilmiş hücre çizgileri özellikleri de elde edilmiştir dokular, örneğin, genetik dönüştürme 4, temel morfolojik özelliklerini bozulması önemli ölçüde farklı olabilir5, hücresel polarite 6 ve inflamatuar mediatörlerin 7 düzenlenmesi gibi fonksiyonel değişikliklerin kaybı.

Kupffer hücrelerinin vücuttaki en bol bulunan makrofaj popülasyonu ve karaciğer sinüsoidlerinden duvarını kaplayan kan ile doğrudan temas halinde bulunmaktadır. Retiküloendotelyal sistem (RES) bir parçası olarak, bu makrofajlar nanopartiküller dolaşım ve bu nedenle yakalanması için sorumlu olan, nanopartikül toksisitesini incelemek için son derece uygun bir model teşkil etmektedir. In vivo 8 ve in vitro nanopartiküller maruz Kupffer hücreleri ile ilişkili inflamatuar tepkilerin 9 çalışmaları başka yayınlanmıştır. Kupffer hücreleri aynı zamanda alkolik karaciğer hastalığı 10, karaciğer fibrozis 11 veya viral hepatit 12 olarak karaciğer hastalıklarının patogenezinde yer almış. Bu izole Kupffer hücreleri, hücresel mekanizmalar inv açıklamak için yararlı bilgi sağlar olduğu bildirilmiştirKaraciğer bozulması 13,14 olved.

Çeşitli yöntemler, izole edilmesi ve Kupffer hücrelerinin saflaştırılması için rapor edilmiştir. Hücre izolasyonu, mekanik ya da enzimatik ayrılma 15 kaynaklanabilir. Kollajenaz sindirimi yüksek Kupffer hücre verimi 16 giden ise, Kupffer hücreleri fonksiyonel bütünlüğü muhafaza avantajını gösterir. Karmaşıklığı ve maliyeti değişen pek çok deneysel yaklaşım, diğer karaciğer hücre popülasyonlarından Kupffer hücreleri ayırmak için kullanılmıştır. Örneğin, Kupffer hücre saflık immünoafinite 17, akış elektroforez 18, yapışmayı 16 tarafından ya da bunların büyüklüğü ve yoğunluğuna göre hücreleri seçin santrifüj teknikleri 16, ile elde edilebilmektedir. Bu yöntemlerin bir kombinasyonu nüfusun 16 saflığını geliştirmek için seçilebilir. Çoğunlukla uygulama ve mevcut ekipman bağlı olduğu Kupffer hücre izolasyonu için ideal yöntem hakkında görüş birliği yokturt. Bununla birlikte, nanopartikül toksisite testi durumunda, basitliği ve Kupffer hücreleri fonksiyonlarının korunması ile bağlantılı teknik yüksek verimi, bu uygulama için en uygun olduğu ortaya çıktı.

Burada bildirilen, Kupffer hücre izolasyon yöntemi yoğunluk gradyanı üzerinde saflaştırma, ardından 2-aşamalı bir perfüzyon metoduna dayanır. yöntem Smedsrød ve arkadaşları tarafından geliştirilen özgün protokolden modifiye edildi. 16 sıçan karaciğer hücre izolasyonu için tasarlanmış. Çalışmaların çoğu rapor ve sıçan ciğeri Kupffer hücrelerinin izolasyonu nitelendirdi. Burada, yüksek verim ve saflıkta, fare karaciğerinden Kupffer hücreleri izole etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. farelerin kullanılması deney maliyetini düşürür ve çeşitli karaciğerinin işleme nanoparçacık toksisite testleri için Kupffer hücreleri büyük miktarlarda elde etmesini sağlar.

Aşağıdaki protokol, Kupffer hücreleri (f işlevselleştirilmiş C-nanotüpler ile inkübe edildi CNT). CNTs özel fiziko-kimyasal özelliklere - tedavisi ve teşhis amaçları için vektörler olarak CNTs ilgi çekici adaylardır yapmış, çap oranı ve geniş yüzey alanı yüksek uzunluğa yani. Ancak, endişeleri CNTs 19 toksisitesi, ve in vitro testlerde yeni gelişme CNT biyolojik etkisinin anlaşılmasını artırmayı hedefliyor ilgili gündeme gelmiş. Kupffer hücre içinde toksisite, hücre zarının yapısal bütünlüğünün eksikliği ile bağlantılıdır. Bu yüzey maddesine hücreden sitoplazmik enzimin LDH kaybı ile ölçülür. Bu yöntemin prensibi, bu nedenle, herhangi bir serbest LDH çıkarın ve hücreleri 20 kalanları ölçmektir. Üstte kalan sıvı kısımdaki CNTs varlığının tayinin 21 müdahale, bu süpernatan içinde salınan LDH ölçülmesi tercih yapılır.

Biz bu basit ve uygun maliyetli Kupffer hücre izolasyonu metho kullanımını öneriyoruzD fonksiyonel Kupffer hücreleri çok sayıda izole etmek. Bu, ilgili primer makrofaj modelinde, nanopartiküller bir dizi toksisite tarama sağlar.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvan deneyleri ilgili tüm kurallar, yönetmelikler ve düzenleyici kurumlar ile uyum içinde idam edildi. protokol UK Home ofis düzenleme rehberlik ve onayı altında gerçekleştirildi gösterdi ediliyor

1. Perfüzyon ve Hücre Toplama (Şekil 1)

figure-protocol-1
Şekil 1:. Karaciğer Perfüzyon fare anestezi sonrasında, sindirim kanalı yanal erişilebilir portal ven (PV) yapmak için karın sol taşınır. PV hemen karaciğer içinde herhangi bir aşırı basıncı önlemek için rüptüre EGTA / HBSS çözüm yavaş bir akış hızı (1-3 ml / dak) ve alt veina kava (IVC) 'dir kullanılarak kanüle edilmiştir. Perfüzyon ilk dakika içinde, akış hızı kademeli / min oranıyla, 7 ml artar. Tam sindirim elde edilene kadar kolagenaz çözelti daha sonra 10 ml / dakika ile perfüze edilmiştir.

  1. Prepataze malzeme tabloda açıklanan tüm reaktifleri yeniden.
  2. EGTA (etilen glikol tetra-asetik asit) / HBSS (Hank Dengeli Tuz Çözeltisi) solüsyonu (fare başına 50 mi) ve 40 ° C'de 30 dakika boyunca kolagenaz çözelti (fare başına 100 mi) ısıtın.
  3. İlk% 70 etanol ile pompa esnek boruyu durulayın. Su banyosuna daldırılmış bir santrifüj tüpüne EGTA / HBSS Çözüm 40 ml dökün ve önceden ısıtılmış EGTA / HBSS Çözümü ile pompa esnek boruyu durulayın.
  4. Güvenilir solunum depresyonu ve ölmeden önce bilinç oluşturmak için bir barbitürat kullanarak Terminal anestezi uygulayın. Bir dişi ya da erkek CD 1 fare (35-45 g) içine 1 mg / kg, ip de fenobarbiton enjekte edilir. Ayak kısma anestezi onaylayın.
  5. Karın tüyleri tıraş edin ve% 70 etanol çözeltisi kullanılarak karın yüzeyi sterilize edin.
  6. Karın boşluğunda kesti ve karın sol yanal bağırsak hareket ettirerek portal ven ve inferior vena kava maruz kalmaktadır.
  7. Start EGTA / HBSS Çözüm ile 1-3 ml / dk'lık bir hızda pompası ve 23 gr bir kelebek iğne kullanılarak portal ven kanüle (kanatlar kesilmiş). 23 G iğne ile kanüle portal ven bölümünü Kelepçe ve daha sonra açılan fare karın yüzeyinde serrefine forseps çevirin. Karaciğer hızla EGTA / HBSS Çözüm perfüzyon ilk 30 sn içinde soluk gerekir.
  8. Hızla karaciğerde aşırı basınç bina önlemek için inferior vena kava alt kısmını insizyon ve sonra perfüzyon ilk dakika içinde, 7 ml / dk kademeli akış oranını artırmak. Hayvan nedeniyle kaval Damara vena ikincil kanama ölür.
  9. EGTA / HBSS Çözüm az 5 ml santrifüj tüpüne kalan zaman, kollajenaz Çözüm (40-50 ml) ile doldurmak. 30 saniye içinde, 10 ml / dk akış hızıyla kademeli olarak artırır.
  10. 5-10 sn aralıklarla, cımbız kullanarak, inferior vena kava basınç uygulayarak karaciğer kabarma olun. This (sindirim sırasında 5-10 kez) periyodik olarak yapılabilir. Bu adım, karaciğer hücre ayrışmasını geliştirmek ve kollajenaz ile perfüzyon süresini azaltacaktır.
  11. Kollajenaz çözelti en az 10 ml'lik bir santrifüj tüpü içinde kalmaya devam ederse, bir santrifüj tüpü içine önceden ısıtılmış kollajenaz çözelti 40-50 mi dökün.
  12. Perfüzyon 10-15 dakika ve perfüze kolagenaz çözelti, yaklaşık 70-80 ml sonra, forseps ile karaciğer yüzeyinde küçük bir basınç uygulamak. Basınç Bir baskı karaciğer hücreleri ayrışmış olduğunu gösterir.
  13. Tek parça olarak karın boşluğunda karaciğer çıkarın ve Kupffer hücreleri izolasyon ortamında 20-30 ml ihtiva eden bir santrifüj tüpüne koyun. Karaciğer hücre canlılığını etkileyen bilmek 3 saatlik bir süre için buz üzerinde ya da 4 ° C 'de, karaciğer hücreleri tutun.
  14. Buz üzerinde perfüze karaciğer tutarken, gerekirse birkaç hayvanlar üzerinde perfüzyon işlemi tekrarlayın. Havuz arıtma için üç karaciğerler bir ve evre 3 ile devam edin.

Santrifüj için Yoğunluk Gradyan 2. Hazırlama (Şekil 2)

figure-protocol-2
Şekil 2:. Yoğunluk gradyanı hazırlanması Bütün prosedürler steril koşullar altında gerçekleştirilir. SIP, 10 1.7 ml x PBS ile kaplanmış silika partikül solüsyonunun 15.3 ml karıştırılmasıyla hazırlanır. SIP 5 ml 20 ml% 25 SIP çözelti yapmak için PBS, 15 ml ile karıştırılır. SIP 10 mi, 20 ml 50% SIP solüsyon yapmak için, 10 ml PBS ile karıştırılır. 50% SIP çözeltisi (20 mi) hareket ettirildiğinde, 25% SIP çözeltisi (20 mi) ihtiva eden bir santrifüj tüpü yavaşça serolojik 25 mi pipet kullanarak eklenir.

  1. Steril koşullar altında, aşağıdaki adımları (bölüm 2., 3. ve 5.) ile devam edin ve C buz üzerinde veya 4 ° hücreleri tutun. 10 1.7 ml x PBS ile kaplanmış silika parçacık çözeltisi 15.3 ml karıştırarak SIP (İzotonik kaplı silika Partiküllerinin Çözüm) hazırlayın.
    2. , 25% SIP çözeltisi 20 ml yapmak PBS, 15 ml ile SIP 5 ml karıştırın. 10 ml PBS ile SIP 10 ml karışımı, 50% SIP çözeltisi 20 ml yapmak için.
  2. 50% SIP çözeltisi 20 ml bir santrifüj tüpüne doldurun. 90 ° ye yakın bir açı ile santrifüj tüpü yatırın ve 50% SIP katmanı yüzeyine dokunmadan, 25 ml'lik bir pipet kullanılarak serolojik borunun yan duvara yavaş 25% SIP çözeltisi (20 mi) ilave edin. % 25 SIP çözümü eklerken, giderek tüpün açısını azaltır. Buz üzerinde kullanıma kadar yoğunluk gradiyenti tutun.

3. Kupffer hücre Arıtma (Şekil 3)

figure-protocol-3
Şekil 3:. Yoğunluk gradyanı ile santrifüjleme ve hücre yapışması Kupffer hücreleri 'nin Saflaştırılması Tüm işlemler, steril koşullar altında gerçekleştirilir. (A) Glisson en kapsülün delinmesinden sonra karaciğer hücreleri, bir 1 süzülür00 mikron süzgeç. Süspansiyon hepatositler (pelet) iptal ve non-parenkimal hücreli fraksiyonu (süpernatant) toplamak için x 50 g'de santrifüje tabi tutulur. Bu aşama 3 kez tekrar edilir. Sigara parankimal hücreler, kesintili bir izotonik gradyanın üzerine ilave edildi ve 15 dakika boyunca 800 x g'de santrifüje tabi tutulur. 25% SIP yastığı toplanan Kupffer hücreleri hücre yapışma seçimi ile daha da saflaştırılır. (B) Hücreler, 24 oyuklu plakada kaplanmıştır ve 30 dakika boyunca CO2 37 ° C'de inkübe edildi ve% 5 vardır. Yapışkan olmayan hücreler HBSS 500 ul ile bir kez yıkanır. Kupffer hücreleri f CNT hücrelere ilave edilebilir kaplama, sonra yapışmayan morfolojisi 4 saat gösterir. Ölçek çubuğu 25 mikron temsil eder. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

  1. Kupffer hücre izolasyon ortamında 15 ml ile bir Petri kabı içinde tek bir perfüze karaciğer koyun. (Glisson en kapsülü yırtılabilirKaraciğerin zarı) makas kullanarak ve Kupffer hücre izolasyonu ortama tüm karaciğer hücreleri bırakın. 100 mikron hücre süzgeç bir santrifüj tüpüne toplanacak olsa çözüm Filtre. Ek perfüze karaciğerleri üzerinde perfüzyon işlemi tekrarlayın ve (üç fareden 45 ml kadar, bir fareden 15 ml), aynı santrifüj tüpüne hücreleri havuz.
  2. 4 ° C'de 2 dakika boyunca 50 xg'de hücre süspansiyonu santrifüjleyin. Pelet ve (Kupffer hücreleri dahil) olmayan parankimal hücreler süpernatanda olacak parankimal hücreler (hepatositler) olacaktır.
  3. 2 dakika her biri için 50 xg'de temiz bir santrifüj tüpüne ve santrifüj süpernatant toplayın. Bu adımı üç kez daha tekrarlayın.
  4. 15 dakika 1.350 xg'de Santrifüj olmayan parankimal pelet hücreleri. Süpernatantı atın ve Kupffer hücre izolasyonu Orta 10 ml pelletini.
  5. 2.3 açıklandığı gibi süreksiz izotonik degrade 25/50% dışı parankimal hücre çözüm ekleyin. Senthızlanma veya ara vermeden 15 dakika 850 xg'de rifuge.
  6. 25/50% SIP arayüzüne yakın% 25 SIP fraksiyonu (Şekil 3) içinde bulanık görünen zenginleştirilmiş Kupffer hücre fraksiyonu yerelleştirilmesine. 10 ml serolojik pipet, aspirat zenginleştirilmiş Kupffer hücre fraksiyonunun yaklaşık 12 ml kullanma. Kupffer hücre izolasyon ortamında 35-40 ml ihtiva eden bir santrifüj tüpüne hücreleri aktarın. Pelet hücreleri 4 ° C'de 15 dakika boyunca 1350 x g'de yumuşak ve santrifüj karıştırın.
  7. Önceden ısıtılmış Kupffer hücre kültür aracı maddesi, 5-10 ml supernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri atın. Hücreler (hemositometre) Sayım ve tripan mavisi boyama kullanarak canlılığı ölçün.
  8. / Oyuk 5 x 10 5 hücre yoğunluğunda 24 oyuklu plakalarda saflaştırılmış olmayan parankimal hücreler plaka. 37 ° C'de ve% 5 CO2 (Şekil 3) hücreleri inkübe edin. 30 dakika sonra, yavaşça yıkanır, orta kaldırmak Hank Dengeli Tuz Solüsyonu (HBSS), daha sonra bir kez yerine önceden ısıtılmıştaze ve önceden ısıtılmış Kupffer hücre kültür ortamında 500 ul bu (oyuk başına).
  9. Onlara yapışık morfolojisi elde etmek için izin vermek için, nanopartiküller ile tedaviden önce, 37 ° C'de en az 4 saat% 5 CO2 için Kupffer hücreleri bırakın.

4. Karakterizasyonu

  1. Kupffer hücreleri Saflık
    1. Kupffer hücre canlılığını korumak için kullanılan taze PBS / BSA çözeltisi hazırlayın. PBS / BSA çözeltisi 500 ul ile bir kez hücreler yıkanır. PBS / BSA çözeltisi çıkarın ve yumuşak bir kazıma ile taze PBS / BSA çözeltisi 500 ul Kupffer hücreleri ayırmak. Hücreler 24-yuvalı plakalar içinde plakalanmıştır zaman devam etmek için ayrılma kolaylaştırmak için makas ile sıyırıcı bıçak uçlarını kısaltır. Tüpler flow sitometri içine hücreleri aktarın.
    2. Bir hemositometre ve santrifüj 1,350 x g 1 x 10 5 hücre kullanarak Kupffer hücreleri saymak. (Saf) F4 / 80 antikorunun 30 ul içinde süspanse Kupffer hücreleri. İyice karıştırın ve 3 için oda sıcaklığında inkübe0 dak. Buz üzerinde lekesiz hücreleri (antikor ile kuluçkaya değil) tutun.
    3. 5 dakika boyunca 1,350 g'de, lekeli hücrelerde santrifüj PBS / BSA çözeltisi 2 ml ilave edilir ve elde edilen süpernatant atılır. PBS / BSA, 200 ul, boyanan hücreleri yeniden süspanse edin.
    4. Flow sitometri analizi için kapı 10,000 boylarına (ileri dağılım) ve parçalı (yan dağılım) göre Kupffer hücreleri boyanmamış. FL-1 kanalında kapılanmış hücrelerin floresans analiz edin.
    5. Lekesiz Kupffer hücrelerinin flow sitometri analizi için kullanılan aynı ayarları tutmak lekeli Kupffer hücreleri için prosedürü tekrarlayın. Seçip Kupffer hücre saflığını değerlendirmek için boyalı hücrelerin floresans ölçmek.
  2. Kupffer hücre Fagositik Etkinliği
    1. % 0.5 ile değiştirin (h / h) Kupffer hücre kültür ortamı içinde flüoresan boncuklar ve 37 ° C'de 4 saat inkübe edilir ve% 5 CO2.
    2. 1.350 xg, di non-içselleştirilmiş boncuk, santrifüj Kupffer hücreleri ortadan kaldırmak için500 ul PBS / BSA Çözüm supernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri scard. Bu adımı 2 kez daha tekrarlayın.
    3. Tüp sitometri akışı içine PBS / BSA çözeltisi ve transfer hücrelerinin 500 ul Pençe Kupffer hücreleri.
    4. Santrifüj Kupffer hücreleri 1,350 xg'de, PBS / BSA çözeltisi 200 ul supernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri atın.
    5. Flow sitometri analizi için kapı 10,000 boylarına (ileri dağılım) ve parçalı (yan dağılım) göre Kupffer hücreleri boyanmamış. FL-2 kanal kapılı hücrelerin floresan analiz edin.

(CNT f) Kimyasal Fonksiyonlu Karbon Nanotüpler 5. Kuluçka

  1. Kullanımdan önce, 15 dakika süreyle sese tabi tutularak su içinde ön-CNT (1 mg / ml) 'in bir dağılımı hazırlanır. F-CNT içi 22 hazırlanır.
  2. 2x konsantre edildi f- CNT hazırlanması Kupffer hücre kültür aracı maddesi içinde dispersiyon. Için ortam içinde dağılmış sonikasyon f CNT2 dk) aşama 5.3 geçmeden önce.
  3. Her kuyu için, 2x f-CNT dağılım 250 ul eski medya 250 ul değiştirin. Tedavi edilmeyen kuyu (tatlı Kupffer hücre kültür ortamının koşullandırılmış ortamı + 250 ul 250 ul) ve% 10 DMSO ile muamele edilmiş kuyu sırasıyla negatif ve pozitif kontrol olarak kullanılır.
  4. 24 veya 72 saat boyunca CO2 37 ° C'de, Kupffer hücreleri inkübe ve% 5.

Modifiye Laktat Dehidrojenaz (LDH) Testi ile Kupffer hücrelerinde f-CNT 6. Toksisite Değerlendirmesi

  1. Süpernatantı atın.
  2. Lizis Tamponu (24 oyuklu plakanın her bir kuyucuğu için) 200 ul ilave edin ve 30 dakika-1 saat süre ile 37 ° C'de inkübe edin.
  3. 10 dakika Hücreler ve hücre artığı tarafından alınan f CNT pelet süreyle kuvvetli bir şekilde pipetleme yaptıktan sonra, 40,000 x g'de mikrosantrifüj tüpleri ve santrifüj içine Kupffer hücreleri lize toplamak.
  4. Süpernatantlar (ƒ-CNT ücretsiz) içine toplayınmikrosantrifüj tüpleri ve -20 ° C'de mağaza ya) 6.5 adıma geçin.
  5. 96 oyuklu bir plaka başına 50 ul ve her bir alt-tabaka karışımı çözeltisi (LDH kit) eşit hacmi ekleyin. Plaka örtün ve durdurma solüsyonu (LDH kiti) 50 ul ilave edilmeden önce 15 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Liziz tamponu 50 ul substrat karışımı çözeltisi 50 ul ve durdurma çözeltisi 50 ul ihtiva eden boş bir kuyu triplicates ekleyin.
  6. Mikroplaka okuyucu içinde 490 nm'deki absorbansı okumak ve (%) hücre sağ kalabilirliğinin hesaplanması için aşağıdaki formül kullanılır.

figure-protocol-4

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

saflaştırılmamış parankimal hücrelerin sayısı, tutarlı ve (17 izolasyon yapıldı) fare başına 6 ila 10 8 ila 14 x hücreler arasında değişmektedir. Her fare izolasyon 16-28 kuyu plaka için yeterli oldu. Tripan mavi boyama Hücre canlılığı hücre canlılığını ~% 95 gösterdi. Kupffer hücreleri eksik yapışkan morfoloji (Şekil 4A) ilgili, 37 ° C'de inkübe edildikten sonra 30 dakika içinde yuvarlak bir şekli göstermektedir. 4 saat inkübasyon ve daha sonra, hücreler yayılmış ve hücre kümeleri meydana ba...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aşağıdaki adımlar, yüksek verim ve Kupffer hücreleri yüksek canlılığı elde etmek için kritiktir. Aseptik koşullar bakteriyel ve fungal kirlenme riskini sınırlamak için kullanılır. Tüm araçlar kullanılmadan önce sterilize edilmesi gerekir. Reaktifler taze izolasyon prosedürü gerçekleştirmeden önce hazırlanmalıdır.

kollajenaz IV seçimi, düşük triptik aktivite ile, çok önemlidir. Aynı ilgili farklı birçok farklı enzimatik aktiviteye sahip olan ve Kupffer hücre izolasyonu için en uygun toplu seç...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma AB FP7-ITN Marie-Curie Ağı programı RADDEL tarafından desteklenmiştir. MB ve KAJ, Kupffer hücre izolasyonunun optimizasyonu konusundaki yardım ve önerileri için Joe Varguese ve Rui Serra Maia'ya teşekkür eder.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Euthatal (pentobarbital sodyum)Merial
CD1 fareleriCharles River   -Fare ağırlığı 35 ila 45 g arasında değişmelidir. Ağırlıkları hızla arttığı için erkek CD1 farelerinin kullanılmasını tavsiye ederiz (örn. 7 haftalık bir erkek CD1 faresinin ağırlığı 35 g'ı aşıyor). Ayrıca, yaşlı hayvanların teslimatını ayarlamak için hayvan tedarikçisiyle önceden iletişime geçmeniz tavsiye edilir. Alternatif olarak, hayvanlar istenen ağırlığa ulaşmak için evde olabilir.
HBSS (Ca2+ ve Mg2+ ücretsiz, bikarbonatlı)   Yaşam Teknolojileri   14175-053HBSS olmalı  Ca2+ ücretsiz. 
Etilen Glikol Tetraasetik Asit (EGTA) tetrasodyum tuzu Sigma-Aldrich   E8145   EDTA da kullanılabilir, ancak EGTA'nın Ca2+ selekte şelatlama avantajı vardır.
HEPES (1 M) Yaşam Teknolojileri   15630-056 100 ml&nbk;
Kollajenaz tip IV Worthington CSL-4 Farklı kollajenaz partilerinin test edilmesi veya en azından tedarikçiye ürünün karaciğer hücresi izolasyonu için uygun olması gerektiğini belirtmeniz tavsiye edilir 
  Düşük glukoz DMEM Sigma-Aldrich   D5523 500 ml&nbk;
RPMI (sodyum piruvat ve Glutamax ile) Yaşam Teknolojileri   12633-012 500 ml
Penisilin / Steptomisin &Yaşam Teknolojileri   15140-122100 ml
Fetal Sığır Serumu İlk Bağlantı   60-00-850 500 ml&nbk;
Tripan mavisi çözeltisi Sigma-Aldrich T8154 100 ml&nbk;
Kaplamalı silika parçacık çözeltisi (Percoll)GE Healtcare   17-0891-02 Percoll® çok kararlıdır ve birkaç yıl saklanabilir 
1x Fosfat Tamponlu Tuzlu Sağan   Yaşam Teknolojileri   10010-023500 ml 
10x Fosfat Tamponlu Salin   Yaşam Teknolojileri   70011-036500 ml
Dimetil sülfoksit Balıkçı D/4120/PB08 500 ml&nbk;
LDH kiti (CytoTox 96) Promega G1781 Işıktan koruyun 
DMEM fenol içermeyenYaşam Teknolojileri   31053-028 500 ml&nbk;
F4/80 antikoru (Alexa 488)AbD SerotecMCA497A488Seyreltmeyin, akış sitometrisi için temiz kullanılır
Floresan boncuklarSigmaL2778Lateks boncuklar, amin modifiyeli polistiren, floresan kırmızısı. 1 ml
Malzeme Firmasının Adı Katalog numarası Yorumlar / Açıklama 
Kelebek kan alma seti (23 G/305 mm uzunluğunda boru)   BD 
Şırınga Filtreleri (0.22 & mu; m Mavi Jant) Minisart 16534-K 
Santrifüj Tüpleri (50 ml Mavi Kapak) BD Biyobilimleri, Falcon 35 2070 
Petri kabı (90 x 15 mm) Thermo Fisher Bilimsel   BSN 101VR20 
100 ve mu; M hücre süzgeci   BD   352360
Peristaltik pompa Watson Marlow SciQ 300   Her kullanımdan önce ve sonra hortumu steril PBS ve% 70 etanol ile durulayın.
24 oyuklu plakalarCorning   3526
96 oyuklu plakalar Corning   3595
Santrifüj Eppendorf5810R
Plaka okuyucuBMG LabtechFLUOstar Omega
Serrefine forsepsHammacher GmbH Ürün No. HSE 004-35 / Kat. Nr. 221-0051Serrefin forsepsler, perfüzyon işlemi sırasında forsepsleri tutmaya gerek kalmadan 23 G iğne ile kanüle edilen damarın klemplenmesine izin verir. Erişim Adresi: (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html) 
Akış sitometri tüpleriBD Biosciences, Falcon 
Mikrosantrifüj tüpleri (1.5 ml)Elkay  000-MICR-150
Hücre sıyırıcıBD Biosciences, Falcon35308624 oyuklu plakalardaki hücreleri kazımak için bıçak ekstremitelerini bir makasla kesin.
Reaktif Şirketinin Adı Katalog numarası Yorumlar / Açıklama 
  EGTA (Etilen Glikol Tetraasetik Asit)/HBSS (Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi) Çözeltisi 0.5 mM EGTA ve 25 mM HEPES içeren HBSS. PH'ı 7.4'e ayarlayın. Her karaciğerin perfüze olması için 50 ml hazırlayın.  
Kollajenaz Solüsyonu 100 UI/ml, 15 mM HEPES ve %1 Penisllin/Streptamisin'de (h/h) kollajenaz tip IV içeren DMEM düşük glikoz. PH'ı 7.4'e ayarlayın. Her karaciğerin perfüze olması için 100 ml hazırlayın. Kollajenaz eklendikten sonra, kullanmadan önce çözeltinin 30 dakika ısıtılması tavsiye edilir. Bu, kollajenaz aktivitesinin optimum olmasını sağlar.
Kupffer Hücre İzolasyon Ortamı RPMI içeren, %1 Esansiyel Olmayan Amino Asitler (h/h),%1 glutamax® (h/h) ve %1 Penislin / Streptomisin (h/h). 1-3 karaciğer için en az 100 ml hazırlayın.  
Kupffer Hücre Kültürü Besiyeri %10 Fetal Sığır Serumu, %1 Esansiyel Olmayan Amino Asitler (h/h),%1 Glutamax® içeren RPMI; (h/h) ve %1 Penislin / Streptamisin (h/h). 1-3 karaciğer için en az 100 ml hazırlayın.  
SIP (izotonik kaplı silika parçacıkları çözeltisi)17 mL SIP elde etmek için 1.7 ml 10x Fosfat Tamponlu Salin  ile 15.3 ml Percoll® karıştırın.
%25 SIP solüsyonu 5 ml SIP'yi 15 ml 1x Fosfat Tamponlu Salin ile karıştırın   
%50 SIP çözümü 10 ml SIP'yi 10 ml 1x Fosfat Tamponlu Salin ile karıştırın 
% 0.9 Triton X-100
% 1 Sığır Serum Albümini ile taze Fosfat Tamponlu Salin pH 7.4 hazırlayın.
367288352052PBS / BSA Çözeltisi ile Lizis Tamponu DMEM ortamı

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hoffmann, D., et al. Performance of novel kidney biomarkers in preclinical toxicity studies. Toxicol Sci. 116 (1), 8-22 (2010).
  2. Nel, A., et al. Nanomaterial Toxicity Testing in the 21st Century: Use of a Predictive Toxicological Approach and High-Throughput Screening. Accounts of Chemical Research. 46 (3), 607-621 (2013).
  3. Bregoli, L., et al. Toxicity of antimony trioxide nanoparticles on human hematopoietic progenitor cells and comparison to cell lines. Toxicology. 262 (2), 121-129 (2009).
  4. Yamasaki, K., et al. Genomic Aberrations and Cellular Heterogeneity in SV40-Immortalized Human Corneal Epithelial Cells. Investigative Ophthalmology, & Visual Science. 50 (2), 604-613 (2009).
  5. Motoyoshi, Y., et al. Megalin contributes to the early injury of proximal tubule cells during nonselective proteinuria. Kidney International. 74 (10), 1262-1269 (1038).
  6. Prozialeck, W. C., Edwards, J. R., Lamar, P. C., Smith, C. S. Epithelial barrier characteristics and expression of cell adhesion molecules in proximal tubule-derived cell lines commonly used for in vitro toxicity studies. Toxicology in Vitro. 20 (6), 942-953 (2006).
  7. Chamberlain, L. M., Godek, M. L., Gonzalez-Juarrero, M., Grainger, D. W. Phenotypic non-equivalence of murine (monocyte-) macrophage cells in biomaterial and inflammatory models. J Biomed Mater Res A. 88 (4), 858-871 (2009).
  8. Kermanizadeh, A., et al. The role of Kupffer cells in the hepatic response to silver nanoparticles. Nanotoxicology. , (2013).
  9. Fischer, H. C., Hauck, T. S., Gomez-Aristizabal, A., Chan, W. C. W. Exploring Primary Liver Macrophages for Studying Quantum Dot Interactions with Biological Systems. Advanced Materials. 22 (23), 2520-2524 (2010).
  10. Wan, J. H., et al. M2 Kupffer Cells Promote M1 Kupffer Cell Apoptosis: A Protective Mechanism Against Alcoholic and Nonalcoholic Fatty Liver Disease. Hepatology. 59 (1), 130-142 (2014).
  11. Matsuoka, M., Tsukamoto, H. Stimulation of hepatic lipocyte collagen production by Kupffer cell-derived transforming growth factor β: Implication for a pathogenetic role in alcoholic liver fibrogenesis. Hepatology. 11 (4), 599-605 (1990).
  12. Polakos, N. K., et al. Kupffer Cell-Dependent Hepatitis Occurs during Influenza Infection. The American Journal of Pathology. 168 (4), 1169-1178 (2006).
  13. Tanner, A., Keyhani, A., Reiner, R., Holdstock, G., Wright, R. Proteolytic enzymes released by liver macrophages may promote hepatic injury in a rat model of hepatic damage. Gastroenterology. 80 (4), 647-654 (1981).
  14. Knittel, T., et al. Expression patterns of matrix metalloproteinases and their inhibitors in parenchymal and non-parenchymal cells of rat liver: regulation by TNF-α and TGF-β1. Journal of Hepatology. 30 (1), 48-60 (1999).
  15. Branster, M. V., Morton, R. K. Isolation of Intact Liver Cells. Nature. 180 (4597), 1283-1284 (1038).
  16. Smedsrød, B., Pertoft, H. Preparation of pure hepatocytes and reticuloendothelial cells in high yield from a single rat liver by means of Percoll centrifugation and selective adherence. Journal of Leukocyte Biology. 38 (2), 213-230 (1985).
  17. Morin, O., Patry, P., Lafleur, L. Heterogeneity of endothelial cells of adult rat liver as resolved by sedimentation velocity and flow cytometry. J Cell Physiol. 119 (3), 327-334 (1984).
  18. Miller, S. B., et al. Purification of cells from livers of carcinogen-treated rats by free-flow electrophoresis. Cancer Res. 43 (9), 4176-4179 (1983).
  19. Firme, C. P., Bandaru, P. R. Toxicity issues in the application of carbon nanotubes to biological systems. Nanomedicine. 6 (2), 245-256 (2010).
  20. Ali-Boucetta, H., Al-Jamal, K. T., Kostarelos, K. Cytotoxic assessment of carbon nanotube interaction with cell cultures. Methods in Molecular Biology. 726, 299-312 (2011).
  21. Wang, G., et al. Understanding and correcting for carbon nanotube interferences with a commercial LDH cytotoxicity assay. Toxicology. 299 (2-3), 99-111 (2012).
  22. Wang, J. T. -W., et al. Magnetically Decorated Multiwalled Carbon Nanotubes as Dual MRI and SPECT Contrast Agents. Advanced Functional Materials. 24 (13), 1880-1894 (2014).
  23. Li, P. Z., Li, J. Z., Li, M., Gong, J. P., He, K. An efficient method to isolate and culture mouse Kupffer cells. Immunol Lett. 158 (1-2), 52-56 (2014).
  24. Froh, M., Konno, A., Thurman, R. G. Isolation of liver Kupffer cells. Curr Protoc Toxicol. Chapter 14, Unit14 14(2003).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Kupffer Cell IsolationNanoparticle Toxicity TestingMouse Liver MacrophagesCollagenase DigestionDensity Gradient CentrifugationFlow Cytometry AnalysisFunctionalized Carbon NanotubesModified LDH AssayNon Parenchymal CellsPortal Vein Cannulation

Related Articles