Bir Salınım basınçlı perfüzyon Aygıt Sıçan karaciğerinin decellularization Prosedürü

Özet

Tescilli cihazımızı kullanarak karaciğer toplama, kanülasyon ve perfüzyon için sunulan teknikler, sıçan karaciğerlerinde hücre giderme ve yeniden hücreselleştirme deneylerini iyileştirmek için karmaşık perfüzyon kurulumlarını mümkün kılar.

Özet

Parankimal organların hücreden arındırılması ve yeniden hücreselleştirilmesi, in vitro fonksiyonel organların oluşturulmasını sağlayabilir ve kemirgen karaciğer hücresizleştirmesi için çeşitli protokoller zaten yayınlanmıştır. Portal ven ve/veya hepatik arter yoluyla selektif perfüzyonu mümkün kılan tescilli bir perfüzyon cihazı inşa ederek decellularizasyon sürecini iyileştirmeyi amaçladık. Ayrıca, hücreden arındırmanın homojenliğini artırmak için salınımlı çevre basıncı koşulları altında perfüzyon gerçekleştirmeye çalıştık. Perfüzyon decellularizasyonunun homojenliği bugüne kadar hafife alınan bir faktör olmuştur. Decellularizasyon sırasında, organ içinde zayıf perfüze edilmiş alanlar hala hücre içerebilirken, iyi perfüze edilmiş alanlardaki hücre dışı matris (ECM) alkali deterjanlardan zaten etkilenmiş olabilir. Salınımlı basınç değişiklikleri, karaciğer içindeki mikroperfüzyonu optimize etmek için solunum sırasında meydana gelen karın içi basınç değişikliklerini taklit edebilir. Burada sunulan çalışmada, hücreden arındırılmış sıçan karaciğer matrisleri histolojik boyama, DNA içerik analizi ve korozyon dökümü ile analiz edildi. Hepatik arter yoluyla perfüzyon, portal venöz perfüzyondan daha homojen sonuçlar gösterdi. Salınımlı basınç koşullarının uygulanması, perfüzyon hücre gidermenin etkinliğini artırdı. Hepatik arter yoluyla ve salınımlı basınç koşulları altında perfüze edilen karaciğerler en iyi sonuçları gösterdi. Tescilli cihazımızı kullanarak karaciğer toplama, kanülasyon ve perfüzyon için sunulan teknikler, sıçan karaciğerlerinde hücre giderme ve yeniden hücrelendirme deneylerini iyileştirmek için karmaşık perfüzyon kurulumlarını mümkün kılar.

Giriş

Decellularization ve Recellularization vitro ^1'de işlevsel ve çoklu organ üretilmesini sağlayabilir. Kaldırma hücreleri ile antijenik madde ile (ör., DNA, a-Gal epitopları), bir organdan, olmayan ya da daha az immünojenik hücre dışı matris (ECM) elde edilebilir. Bu matris, bir organ, üç boyutlu mikroanatomisinin korur ve farklı, muhtemelen ksenogeneik kökenli ² hücreleri ile yeniden popüle için ideal bir biyolojik matris olarak görev yapabilir. Bu durumda, bir hücresizleştirilmiş sıçan karaciğer matrisi insan karaciğer hücreleri ile yeniden doldurulur edilebilir. Bu insanlaştırılmış mikro-karaciğer hastalıkları (örn., Doğumsal metabolik hastalıklar, viral hastalıklar veya maligniteler) veya preklinik ilaç testi ³ araştırma için bir ex vivo modeli olarak hizmet verebilir.

Sıçan karaciğer perfüzyon decellularization için çeşitli protokoller zaten ^4-13 yayınlanmıştır. Tüm protokollerde, decellularleştirilmesi kanüllü portal ven aracılığıyla alkali iyonik veya non-iyonik deterjanlar perfüzyon ile elde edilmiştir. Bizim bilgimize göre, biz portal ven ve / veya sıçan hepatik arter ¹⁴ üzerinden seçici perfüzyon ile sıçan karaciğer decellularization bildiren ilk gruptu. Karaciğer farklı vasküler sistemlerinin seçici perfüzyon etkinleştirilmesi hücre yeniden popüle önemli bir rol oynayabilir, bundan başka, daha decellularization sonuçlar etkinleştirmek olabilir.

Burada ayrıntılı çalışmada, karaciğer titreşen basınç koşullarında perfüzyon sağlayan bir ısmarlama tescilli perfüzyon cihazında perfüze edildi. Bu basınç koşulları karaciğer fizyolojik solunum bağımlı perfüzyon taklit: in situ, karaciğer hareketi solunum sırasında karaciğer perfüzyon üzerinde doğrudan etkisi vardır diyaframın copula altında asılı. İlham, özellikle optimize diyaframın düşürülmesi ve karaciğerde sıkma yol açarhepato-venöz çıkış, oysa son karaciğer yükselmesi ve portal venöz girişi ¹⁵ optimize karın içi basıncının düşürülmesi yol açar.

Amacımız salınan basınç koşulları karın içi koşullar ex vivo taklit ederek sıçan karaciğer perfüzyon decellularization homojenliği üzerinde bir etkisi olup olmadığını araştırmaktır. decellularization sürecinin homojenliği perfüzyon decellularization bir hafife bir faktör olabilir. Bilinen tüm maddeler ECM karaciğer decellularization neden değişiklikler için kullanılır. Diğer alanlarda zaten tamamen decellularized oysa kötü perfüze alanlarda hücreler, ECM içinde kalır. Geri kalan hücrelerin çözmek için, perfüzyon süresi ya da basınç iyi perfüze alanlara daha fazla değişiklik neden yükselmiş olması gerekir. Bu nedenle, decellularization deterjanlar organ içindeki homojen dağıtılmalıdır.

Protokol

Hayvanlar Deneysel Tıp (FEM, Charité, Berlin, Almanya) için Tesisi'nde tutuldu ve tüm deneysel protokoller gözden geçirilecek ve Devlet Sağlık ve Yerel İşleri Ofisi (LAGeSo, Berlin, Almanya tarafından kabul edildi;. Reg No O 0365 / 11).

1. Karaciğer Hasat

1. Ön Cerrahi hazırlık
   1. Sabitleme için bir mantar plaka kullanın. Plaka üzerinde tıbbi örtü koyun. Dört iğneler kullanılarak, intraoperatif inhalasyon narkoz için mantar plaka üzerinde bir inhalasyon maskesi düzeltmek.
2. Portal Venöz Kanül prearrangement
   1. Üç-yollu bir periferal venöz kateter (G 20) bağlanır. kateter yaklaşık bir uzunluğa sahip, eğik olarak kesilmelidir. 1,5 cm.
   2. De hava Ringer çözeltisi ile doldurulmuş bir 10 ml şırınga kullanarak sistem. Dikkatle de hava gaz embolisi olumsuz perfüzyon decellularization etkileyebilir çünkü çok önemlidir.
3. PrearrangementArter Kanül
   1. Kelebek kanül kullanıldığı ve 5 mm bir uzunluğa iğne kesti. 5 mm iğne ve superglue ile sabitleyin, 5 cm tüp (OD 0.96 mm ID 0.58 mm) takınız. Büyük tüp içine ve superglue ile sabitleyin, 2 cm uzunluğunda bir tüp (OD 0.61 mm ID 0.28 mm) yerleştirin.
   2. Bir dayanak olarak bu yapı üzerinde başka tüp kayma ve superglue ile sabitleyin. De hava Ringer çözeltisi ile dolu bir 5 ml şırıngaya arteryel kanül.
4. Anestezi ve Analjezi
   1. 1.5 L / dakikalık bir akış oranında% 3.5 oksijen izofluran anestezi indüksiyon odasında sıçan narkozu neden.
   2. Çalışma sırasında analjezi sağlamak için, karın içinden metamizol (100 mg / kg vücut kütlesi) ve düşük doz ketamin / medetomidini (kg vücut ağırlığı başına 10 mg / 0.1 mg) enjekte edilir.
   3. Cerrahi anestezi sonraki bakım için inhalasyon maskesi üzerinden 1 L / dk oksijen% 1.5 izofluran sağlayın.
5. Ameliyat öncesi Düzenlemeler
   1. Elektrikli kesme makinesi ile liberal karın Tıraş. Dezenfeksiyonu için% 70 etanol ile karın traş kesi sitesini nemlendirin.
   2. Hazırlanan plaka üzerinde yatar pozisyonda hayvan yerleştirin inhalasyon maskesi içine kafasını takın ve tıbbi bant ve iğneler ile bacaklarda düzeltmek. Bir gazlı bez kompres ile aşırı etanol ve kürk çıkarın.
6. Anestezi Değerlendirmesi
   1. Solunum hızı izleyerek anestezi derinliği değerlendirin. Anestezi (40-60 solunum / dk) yeterince derin görünüyor zaman analjezi her iki arka bacaklarda ayak parmakları arasında cilt çimdik cerrahi forseps kullanarak ayak tutam refleks tetiklemek için deneyerek yeterli olup olmadığını kontrol edin.
7. Karın Yaklaşım
   1. Mesane üstünde kaudal karın duvarı içine medyan kesi yapmak. V-şekilli bir biçimde her iki lateral kot kemerler için, bu noktadan itibaren kesilir. Diyaframın içine kesmek için özen gösterin. Göğüs üzerine kesilmiş karın duvarı çekin.
   Bir Overholt kelepçe ile kılıç şeklinde Fix cranially çekin ve bir lastik bant ile sabitleyin. Bağırsak tahliye ıslak pamuk bezlerden kullanın. Islak gazlı bez içinde bağırsak sarın. Ayrıca, ıslak bandaj ile tüm karın marjlarını kapsamaktadır.
8. Karaciğer Hazırlık
   1. Falciform ligament parçalara ayır. Cranially diyaframın kubbe altında medial ve sol karaciğer loblar tutmak için ıslak bir gazlı bez bandaj kullanın. Triadın ve üst omentum karaciğer lobu Açığa.
   2. Lob mobil kadar dikkatlice üst omentum lob bağlı ligament incelemek için iki microforceps ve yaylı makas kullanın. Yerinde medial ve sol lobu tutan, gazlı bez kompres altında ıslak pamuklu çubuklarla kullanarak lob hareket ettirin.
   3. Üst omentum karaciğer lobunun seferber sonra sola mide hareket ettirin. Bir kelepçe ile mide Fix ve microforceps ve yaylı makas ile küçük omentum teşrih.
   4. Alt omenta Seferberl karaciğer lobu mobil ve daha sonra onun boşluğuna geri lobun taşımak kadar. Duodenum korumak için bir Backhaus kelepçe kullanın. Streç ve triadın maruz sola duodenum taşıyın. Gergin hepatoduodenal ligaman koledok circumscribe.
   5. Adipoz ve pankreas dokusundan safra kanalını parçalara ayır. Safra kanalını safra kanalı bifurkasyondan 1,5 cm kesin. Çevreleyen yağ dokusundan portal ven parçalara ayır. Gastroduodenal ven Açığa.
   6. Ipek 6-0 ile iki kez gastroduodenal ven bağlanır ve 2 bitişik harfler arasındaki damar bölün. Tüm arteriyel rami ortaya kadar çevreleyen dokudan çölyak gövde ve ortak hepatik arter parçalara ayır.
   7. Çevreleyen dokudan gastroduodenal arter Özgürleştirin. Birbirinden uzak bağları, ipek 6-0 ile iki kez gastroduodenal arter kravat. 2 bitişik harfler arasındaki gastroduodenal arter parçalara ayır.
   8. Dalak arteri kurtarmakçevreleyen dokudan. Birbirinden uzak bağları, ipek 6-0 ile iki kez dalak arteri bağla. 2 bitişik harfler arasındaki dalak arteri parçalara ayır.
   9. Çevreleyen doku sol gastrik arter Özgürleştirin. Birbirinden uzak bağları, ipek 6-0 ile iki kez sol gastrik arter kravat. 2 bitişik harfler arasındaki arter parçalara ayır.
   10. Sağ böbrekte ve sağ yanal karaciğer lobu arasındaki alt kaval ven circumscribe. Retroperitoneal uzaydan damar parçalara ayır. Çölyak gövde izleyerek aorta Açığa.
   11. Retroperitoneal adipoz doku teşrih. Inferior vena kava içine 1 ml serum fizyolojik içinde 1.000 IE heparin enjekte edilir. Kanül geri çekin ve pamuklu ped ile kesi kapatın. Heparin sistemik etki için 1-2 dakika bekleyin.
   12. Forseps ile aorta circumscribe. Aorta incelemek ve sıçan asıl bulbus olfaktoryusları alındı. Ayrıca, böbrek distal inferior vena kava teşrih.
9. Portal Venöz Kanülasyon (Kullanım bölüm 1.2 hazırlanan kanül)
   1. Distal portal vende bir balık ağzı kesi olun. Forseps ile kesi açın ve portal ven cannulate. Karaciğer rengini yitiren kadar 20 ml Ringer solüsyonu ile karaciğer yıkayın ve bitişik harfler (ipek 6-0) ile kanül düzeltin.
10. Arteriyel Kanülasyon (Kullanım bölüm 1.3 hazırlanan kanül)
    1. Çölyak gövde üzerinde aorta parçalara ayır. Retroperitoneal uzaydan aort segmenti Özgürleştirin. Aort yama oluşturmak için uzunlamasına aort segmenti kesin. Statik tutucu içine kendini inşa kanül yerleştirin.
    2. Kanül üzerinde aort yama kayma 2 forseps kullanın. Kanül üzerinde ipek 6-0 ile hepatik arter bağlanır ve dayanak olarak yama sabitleyin.
11. Karaciğer eksplantasyonu
    1. , Diyaframı açıp dairesel kesi yapmak ve çevre yapılardan karaciğer teşrih.
12. Depolama
    1. Stokullanılana kadar 350 ml Ringer çözeltisi ile doldurulmuş, steril 500 ml tankında karaciğer yeniden.

2. Deterjan Çözümleri

1. % 10 Triton X-100 stok solüsyonu
   1. 900 ml su dest ile 1.000 ml'lik şişe doldurun. ve 100 ml Triton X-100 (% 99,9) ekleyin. Triton X-100 eritmek için bir karıştırıcıyı kullanarak. Damıtılmıs şişeyi doldurun. 1000 ml'lik toplam hacme kadar ulaşılır.
2. % 1 Triton X-100
   1. 1.000 ml şişe stok çözeltisi, 100 ml (% 10) ilave edilir. 900 mi su Hedef ekle. ve iki kez şişeyi çalkalayın. Steril bir filtre içerisinden,% 1 Triton X-100 çözeltisi filtre.
3. % 10 SDS Stok Çözeltisi
   1. 900 ml su dest ile 1.000 ml'lik şişe doldurun. ve 66.99 g SDS (% 99.9, yoğunluk 0.67) ekleyin. SDS çözmek için bir karıştırıcı kullanın. Damıtılmıs şişeyi doldurun. 1000 ml'lik toplam hacme kadar ulaşılır.
4. % 1 SDS
   1. 1.000 mi bot stok çözeltisi, 100 ml (% 10) ilave edilirtle. 900 mi su Hedef ekle. ve iki kez şişeyi çalkalayın. Steril bir filtre ile% 1 SDS çözeltisi filtre.

3. Decellularization

1. Perfüzyon Cihaz Set-up

Şekil 1:. Oscillating Basınç Koşullarda Seçici Arter ve Dört Rat karaciğerinin Portal Venöz Perfüzyon için Perfüzyon Cihaz Programı (. Struecker ark değiştirilmiş ¹⁴⁾

1. Üç yollu ve dolum seviyesini düzenleyen ve 500 ml% 0,9 NaCl ile reaktörü doldurmak için Heidelberger uzantısı drenaj bağlayın.
   

Şekil 2:. (4) portal venöz yoldan kabarcık kapanı (5) (2) ya da arteriyel ac yoluyla uzak ucuna perfüzyon set-up Plan perfüzyon odasına bağlantı (1.400 cm ³⁾ (1)ri (3). Kabarcık kapanı (5) uzak ucunda bir tıkama (4) ve bir delik (6) ile donatılmış olmalıdır. Bir Heidelberger uzatma (7) kabarcık tuzak (5) bağlayın. Pompa segmenti (8) ile Heidelberger uzantısı bağlayın. Bundan başka, bir başka Heidelberger uzantısı (9), pompa segmenti (8) bağlanır. Deterjan çözeltisinin (10) şişenin içine geçen Heidelberger uzantısı (9) takın. (Ya da birden perfüzyonları durumunda basınç dağıtıcıya) perfüzyon odasına solunum cihazı (11) takın. Reaktör sıvıları boşaltmak için, atık şişe (12) çıkışı bağlayın.

1. Pompanın içine pompa segmenti yerleştirin. PBS ile döngüsü doldurmak için pompayı çalıştırın, kabarcık kapanı distal ucunu kapatın ve havalandırma açın. Kabarcık alt güvenli PBS (2-3 cm) ile kaplı olduğunda, havalandırma kapatın ve baloncuk kapanı distal ucunu açın.
2. Karaciğer Kurulum
   1. İlgili reaktör erişmek için portal ven kanül üç yönlü stopcock bağlayın. Carteriyel erişim arteriyel kanül taşıyıcılarına bağlan- ması. Hava sistemlerini girmemesini sağlamak için dikkatli olun.
3. Titreşimli Basınç Koşullar Uygulaması
   1. 15 bpm bir frekans ve 26 mbar (dak. 4 mbar, maks. 30 mbar), bir genlik solunum cihazı kullanın. Basınç dağılımı odasına solunum bağlayın ve reaktöre odasına bağlayın. Basınç uygulamasını başlatın.
4. Decellularization Protokolü
   1. / Dakika, 5 ml bir akış oranı ile perfüzyon adımları. 90 dakika boyunca,% 1 Triton X-100 ile birlikte karaciğer perfüzyonu ile decellularization başlatın. Perfüzyon odasının sabiti içinde ve perfüze karaciğer üzerindeki sıvı seviyesini korumak için perfüzyon cihazının çıkışı yoluyla atık effluence izin verin. 90 dakika sonra,% 1 SDS deterjan değiştirin.
      
      

Şekil 3: Tüm Deneysel Grupları için Perfüzyon Protokolü.

Sonuçlar

homojenliği ve dolayısıyla farklı decellularization protokolleri etkinliği makroskopik gözleminden, histolojik analiz ve hücresizleştirilmiş karaciğer matrisleri içinde kalan DNA içeriğinin analizi ile değerlendirilmiştir. Ayrıca, korozyon döküm decellularization sonra karaciğerinin sağlam mikroanatomisinin görselleştirmek için yapıldı.

Makroskopi

Decellularization sırasında, karaciğer hücre içeriğine çıkarılmasını gösteren lucent hale gelir. Portal ven aracılığı...

Tartışma

Sıçan karaciğer hasat ve decellularization sunulan tekniği kolayca tekrarlanabilir olmasına rağmen, dikkate bazı kritik adımlar vardır:

Kan pıhtılaşmasını aktive edecek ve karaciğer içinde kan pıhtısı oluşumuna neden olabilir, çünkü karaciğer hasat için hazırlık sırasında, şiddetli kanama önlemek için önemlidir. Bizce, bu portal ven yoluyla perfüzyon sırasında hepatik arter yoluyla kan akışını önlemek için portal ven kanülasyonu önce doğrudan abdominal aorta kesilirken avantajlıdır. Karaciğe...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Kendi kendine inşa edilmiş arteriyel kanül
Portex Steril Olmayan Polieten Boru	SIMS Portex	REF 800/110/100	0,28 mm İç Çap 0,61 mm OD
Portex Steril Olmayan Polieten Boru	SIMS	Portex REF 800/110/200	0.58 mm ID 0.96 mm OD
Venodrop Safe kelebek kateter	Fresenius Kabi	3275851	21 G
portal ven kanülü
Periferik Venöz Kateter	BD	393224	BD Venflon Pro 20G
Üç musluk	demircileri medikal	888-101RE
Pamuk Çubukları	Hecht-Assistent	4302
Pamuklu Pedler	Shaoxing Zhengde Cerrahi pansuman	13H118-03
Gazlı Bez Bandaj	Hubei Haige  Tıbbi Aletler	14388
Ringer Solüsyonu	Fresenius Kabi	13 HKP022	1000 ml
10 ml Şırınga	Braun	4606108V	10 ml/ Luer Solo
5 ml Şırınga	Braun	4606061V	5 ml /Luer Solo
Sütür (İpek 6/0)	Resorba	H1F	LOT 105001.81
tıbbi	örtü Shaoxing Zhengde Cerrahi pansuman	D0613011
cerrahi aletler
iğne tutucu	Geuder	17570
mikro forseps	Inox-Electronic	91150-20
mikro makas	Martin	11-740-11
mikro forseps	S & T
Kelepçe	Aesculap	BH111R
makas	FS T	14501-14
cerrahi forseps	Aesculap	BD 557
Hücre
Dışı Solunum Maskesi Resmed	14.24.11.0004	SmartAIR ST
Perfüzyon Cihazı	Charite, tıp mühendisliği laboratuvarı	ısmarlama cihaz	giderme cihazı
peristaltik pompa ismatec reglo ICC	IDEX	ISM4408	4 kanallı
Heidelberger uzatma 75 cm	Fresenius Kabi	2873	75 cm
MS/CA pompa segmenti	IDEX	IS 3510	MS/CA/tıkla ve git/POM-C
CA 2 durdurucu tüp	Pharmed	BPT NSF-51
kabarcık tuzağı		ısmarlama ürün
Luer Lock hortum bağlantısı	Neolab	No. 02-1887
Deterjanlar
SDS peletleri	Carl Roth	CN30.4	2,5 kg
Triton X-100	Carl Roth	3051.1	10 L
PBS	Gibco	14190-094	DPBS
boyama
Eosin %1	Morphisto	10177
Mayer hematoksilen	AppliChem	A4840
gomori boyama	Morphisto	11104
AlcainBlue-PAS boyama	Morphisto	11388
Doğrudan Kırmızı 80	Sigma Aldrich	365548