Yöntem makalesi

Hazırlanması ve Bireysel Karakterizasyonu ve Multi-ilaç Fiziksel, polimerik misellerin Entrapped Loaded

DOI:

10.3791/53047

⸱

28 Ağustos 2015

 ,  ,  ,  , 
1School of Pharmacy, Pacific University, 2Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, Oregon State University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolün amacı, amfifilik blok kopolimerlerden oluşan misel ilaç taşıyıcı sistemlerde fiziksel olarak hapsolmuş, suda az çözünür ilaçların hazırlanmasını ve karakterizasyonunu tanımlamaktır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Polietilenglikol blok -polylactic asit (PLA b- PEG) gibi bir amfifilik blok kopolimerleri, sulu ortamlarda hidrofilik kabuğuyla çevrelenmiş hidrofobik çekirdekler oluşturulmasını kritik misel konsantrasyonunun üzerinde miseller halinde kendi kendine birleşebilen olabilir. Bu misellerin çekirdek dosetaksel (DTX) ve everolimus (EVR) gibi hidrofobik, suda çözünürlüğü zayıf olan ilaçların yüklemek için kullanılabilir. Misel yapısı ve ilaç yükleme özellikleri sistematik karakterizasyonu yapılabilir in vitro ve in vivo çalışmalar önce önemlidir. Bu tarifnamede tarif edilen protokol amacı standart misel ürünler elde etmek için gerekli olan karakterizasyon adımları sağlamaktır. DTX ve EVR, sırasıyla, bu misellerin hazırlanışı, sırasıyla 1.86 ve 1.85 mg / ml için DTX ve EVR suda çözünürlüğünü arttırır solvent döküm yoluyla elde edilebilir ml / 1.9 ve 9.6 ug içsel çözünürlüklere sahiptir. Eval miseller ilaç stabilitesi48 saat boyunca oda sıcaklığında değerlendirmeler yapılmıştır ilaçların% 97 ya da daha fazla çözelti içinde muhafaza ettiğini göstermektedir. Misel boyutu, dinamik ışık saçılması ile değerlendirildi ve bu misellerin büyüklüğü 50 nm'nin altında ve polimerin molekül ağırlığına bağlı olduğu belirtilmiştir. Misellerin gelen ilaç salım 48 saat içinde 37 o C'de pH 7.4'te lavabo koşullarında diyaliz kullanılarak değerlendirildi. Eğri uydurma sonuçlar ilaç salım difüzyon tahrik belirten birinci dereceden bir işlem tarafından tahrik edilir olduğunu göstermektedir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hidrofilik ve hidrofobik alanlardan oluşur yinelenen yapısına Amfifilik blok kopolimerleri kendiliğinden polimerik miseller olarak bilinen üç boyutlu bir makro-moleküler derlemeleri oluşturmak üzere kendi kendine birleşebilen olabilir. Bu yapılar, bir hidrofilik kabuk tarafından çevrelenmiş bir iç hidrofobik bir çekirdeğe sahiptir. Hidrofobik merkez fiziksel olarak yakalanmalarında hidrofobik etkileşimler yoluyla ya da polimer omurgasına kimyasal konjügasyon yoluyla hidrofobik ilaçların da kapsama alınması için yeteneği vardır. 1 Bir çok avantajı, ilacın verilmesi için miselleri meydana getirmek üzere, bu blok kopolimerleri kullanarak bulunmaktadır. Bu polimerlerin az çözünen ilaçların birleşme, dahil ilaçların farmakokinetik özelliklerini iyileştirmek ve biyo-uyumluluk ve / veya biyo-bozunabilirlik içerir olanağına klasik çözünür hale güvenli bir alternatif yapar. 2, polimerik miseller kullanmanın bir diğer avantajı 15- arasında kendi kolloidal parçacık büyüklüğü olan pa için onları çekici hale 150 nm 3,eksipiyanlar teslimat. Bu nedenle, son 20 yılda, polimerik miseller, özellikle kanser terapisi için suda zayıf çözünür ilaçlar için uygun bir ilaç verme sistemleri olarak ortaya çıkmıştır. 3,4

Son polietilenoksit içeren bir üç bloklu kopolimer ise şu anda klinik denemeler geçiren kanser tedavisi. Klinik çalışmalarda misellerin 4 Four için beş polimerik misel formülasyonları PEG-bazlı çift bloklu kopolimerleri bulunması halinde. Bu misellerin büyüklüğü 20 nm ila 85 nm için değiştirilebilir. PEG bazlı polimerlerin kullanılmasının avantajı, bunların biyolojik uyumluluk ve ikinci blokta bağlı olarak biyo-bozunabilir de olabilir. Polietilenglikol blok -polylactic asit (-PLA b PEG), polimerik miseller göre en son yeni ilaç verme sistemleri birden fazla anti-kanser ilaçları eş zamanlı verilmesi için geliştirilmiştir. PEG-PLA b- misellerin bir biyouyumlu ve biyobozunur her ikisi de. Yüklenen miseller olarak göstermiştir bu çoklu ilaçynergistic vitro ve in vivo 2,5,6 farklı kanser modelleri önlenmesi ve direncini önleme kemoterapide birden fazla ilaç kullanan ve toksisiteyi düşürmek mevcut paradigma uyum sağlar. Bu nedenle, hazırlanması ve kanser ve diğer hastalık durumlarında kullanılmak üzere bu misel ilaç taşıyıcı sistemleri karakterize bir ilgi çok şey var.

Çalışmada bu tür misel hazırlanmış ve ilgi hastalık durumlarında onları değerlendirilmeden önce karakterize edilebilir bir adım-adım süreci ana hatlarıyla aşağıda. Bu çalışmanın amacı için iki zayıf çözünen anti-kanser ajanları, dosetaksel (DTX) ve everolimus (EVR) seçilmiştir. DTX ve EVR Hem sırasıyla ml / 1.9 ve 9.6 ug içsel su çözünürlük ile suda az çözünen bileşiklerdir. Farklı moleküler ağırlıklara sahip 7,8 İki PEG b -PLA polimerler formüle polimer yapı taşları olarak bu protokolü kullanılmıştır miseller,-PLA 1800 (3800 Da) ve PEG 4000 b - - -PLA 2200 (6200 Da) b bu polimerler PEG 2000 bulunmaktadır. PEG-b -PLA miseller, bu nedenle DTX ve EVR tek tek ve kombinasyon halinde bir nanocarrier olarak benzersiz bir platform sağlar. Gerekli Reaktifler / Malzeme ve Ekipmanları hazırlamak ve bu misel Tablo 1'de belirtilmiştir karakterize gerekiyordu.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çözücü döküm yöntemiyle ayrı ayrı ve Çok-ilaç yüklü misellerin hazırlanması 1.

  1. Çift ilaç miselleri için 1 mg her (DDM) de DTX 1 mg veya EVR 1 mg veya her ikisi ilaçlar tartılır.
  2. PEG 2000 15 mg tartılır - -PLA 1800 veya PEG 4000 b - b -PLA 2200 bireysel ya da DDM biri için.
  3. Ilaç / uyuşturucu ve bir 5 ml'lik yuvarlak dipli bir şişeye asetonitril ve yerine 0.5 ml içindeki polimeri ayrıştırın.
  4. Bir döner buharlaştırıcı kullanılarak indirgenmiş basınç altında ilaç (lar)-polimer asetonitril çözeltiyi buharlaştırarak ince ilaç dağıtılmış polimer film oluşturmak. 100 rpm, 40 o C su banyosu sıcaklığında ve 3 dakika daha 100 mbar, bir redüksiyon sonrasında 5 dakika boyunca 260 mbar'lık bir vakum basıncı döner bir buharlaştıncı ayarlayın.
  5. 50 ° C'de iyonu giderilmiş su, 0.5 ml ilaç polimer film rehidrate ve yavaşça miseller oluşturmak için çalkalanır.
  6. Filtre sonucu0.2 um naylon filtre vasıtasıyla misel çözeltisi ing 1,5 ml santrifüj tüpüne bir Erimemiş ilaç veya kirleri çıkarmak için.

Ters fazlı yüksek performanslı sıvı kromatografisi (RP-HPLC) kullanarak Değerlendirme miseller ilaç yükleme ve stabilitesi 2.

  1. 1 ml / dk'lık bir akış oranında, bir cep asetonitril / su fazı (62/38)% 0.1 fosforik asit,% 1 metanol ile izokratik modda, 40 ° C'de equilibriated bir C8 sütunu ile RP-HPLC analizi gerçekleştirmek ve 10 ul bir enjeksiyon hacmi.
  2. Önceden ilk ilaç yükleme belirlemek için RP-HPLC ile analiz mobil faz: 100 taze hazırlanmış miseller (bölüm 1) 1 seyreltin. RP-HPLC ile tekrar değerlendirilmesi ve 24 saat boyunca miselleri içine ilaç (lar) dengesini belirlemek için mobil faz olarak 100 seyreltilmiş örnekleri: Mağaza seyreltilmemiş bağımsız miselleri ve 48 st için oda sıcaklığında (25 ° C) de DDM ve taze 1 hazırlar.
  3. Sırasıyla 227 ve 279 nm DTX ve EVR doruklarına Monitörsırasıyla 1.7 ve 5.7 dakika tutma süreleri ile. Üçlü olarak tüm ölçümleri yapın. Ortalama ± SD ilaç yüklemesi olarak mevcut veriler.

Dinamik ışık saçılımı ile misel Partikül Boyutu 3. Değerlendirmesi (DLS)

  1. 1.5 mg / ml'lik nihai bir polimer konsantrasyonuna vermek üzere 1:20 oranında iyonu giderilmiş su içinde (bölüm 1 'de tarif edildiği gibi), taze hazırlanmış miseller seyreltilir.
  2. Saçılma belirlemek için 173 ° He-Ne lazer (633 nm) yoğunluğunu ölçün. 2 dakika süresince ön-dengeyi takiben 25 ° C 'de, tüm ölçümler gerçekleştirmek.
  3. Üçlü olarak tüm ölçümleri yapın. Dağıtım polidispersite indeksi (PDI) ile birlikte SD ± Ortalama Z-ortalama boyutu olarak mevcut veriler.

Bireysel miselleri ve DDM 4. Değerlendirme In Vitro İlaç Yayın

  1. 3 ml diyaliz kaseti içine bölüm 1. Yük misellerin 2.5 ml açıklandığı gibi bireysel miseller ve DDM hazırlayın7000 g / mol bir molekül ağırlığı kesme değeri (MWCO).
    Not: Bu MWCO kaset dışına serbestçe yaygın ve böylece lavabo koşulları sağlamak için ilişkilendirilmemiş polimer molekülleri ile birlikte ücretsiz ilaç (lar) etkinleştirmek için seçildi.
  2. (Stok 200 mM'lik çözelti seyreltilerek hazırlandı), 10 mM pH 7.4 fosfat tampon maddesi 2.5 L, kasetler yerleştirin ve lavabo koşulları temin etmek üzere bir tampon her 3 saat değiştirin. Deney süresi boyunca 37 o C tampon sıcaklığını muhafaza.
  3. 'De 0, 0.5, 1, 2, 3, 6, 9, 12, 24, ve 48 saat, kasetlerinde çözeltisi 150 ul çekme ve taze tampon 150 ul ile değiştirin.
  4. Ilaç konsantrasyonu belirlemek için 2. bölümünde kurulan RP-HPLC kullanılarak numunelerin analiz. Stastitical yazılımını kullanarak bir fazlı üstel dernek ile basit difüzyon modeline dayalı ilaç (lar) salım verileri Eğrisi-uyacak.
  5. E ilaç salımı% 50 ulaşmak için gereken süreyi hesaplayın (t 1/2)eğri dayanan bireysel miseller veya DDM olarak ach uyuşturucu. Dördüzden tüm ölçümleri yapın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bireysel DTX veya EVR miselleri ve miseller başarıyla PEG 4000 ya formüle edilir -PLA b PEG içinde DTX ve EVR DDM - b -PLA 2200 veya PEG 2000 - b -PLA 1800 (Şekil 1).

DTX EVR ve DDM PEG 4000 içindeki kararlılık göstermiştir - 48 saatten fazla bir -PLA 1800 b (Şekil 2) - -PLA 2200 veya PEG 2000, b. -PLA 2200, b ve...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İlaç dağıtımında polimerik misellerin kullanımı, çok yönlülükleri ve çeşitli hastalık durumları için hidrofobik ilaçlar verme yetenekleri nedeniyle genişlemeye devam ediyor. Bu nedenle, hücre kültüründe veya hayvanlarda kullanılmadan önce bu formülasyonları hazırlamak ve karakterize etmek için gereken teknikler, ilaç ve polimer arasındaki en iyi eşleşmeyi belirlemek için kritik bir ilk adımdır. PEG-b-PLA, ilaç dağıtım amaçları için mükemmel amfifilik blok kopolimerlerdir. Bununla birlikte, hidrofilik ve hidro...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, AACP Yeni Eczacılık Fakültesi Araştırma Ödül Programı, Oregon Tıbbi Araştırma Vakfı Yeni Araştırmacı Hibesi, Oregon Eyalet Üniversitesi-Başlangıç fonu ve Pasifik Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi Başlangıç fonu tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
PEG2000-b-PLA1800Advanced Polymer Materials, Inc6-01- PLA / 2000PLA MW
PEG4000-b-PLA2200Advanced Polymer Materials, Inc6-01- PLA / 4000PLA MW sipariş üzerine belirtilebilir
DocetaxelLC LaboratoriesD-1000100 mg
EverolimusLC LaboratoriesE-4040100 mg
AsetonitrilEMD / VWREM-AX0145-1HPLC sınıfı; 4 L
Yuvarlak tabanlı şişe Glassco/VWR89426-4965 ml
RV 10 Kontrollü Döner EvaporatörlerIKA Works8025001DAD dedektörlü Rotoevaporatör
Shimadzhu HPLCShimadzhuRP-HPLC
Slide-a-lyzer diyaliz kaseti MWCO 7000Thermo Scientific, Inc663703 ml
Fosfat tampon pH 7.4, 200 mMVWR100190-870500 ml
Malvern NanoZSMalvern Instruments, UKDLS
Naylon filtreAcrodisc/VWR28143-24213 mm; 0.2 & M
Fosforik asit, NFSpectrum Chemical/VWR700000-626100 ml
GraphPad Prismwww.graphpad.comAnaliz yazılımı
Zorbax SB-C8 Hızlı Çözünürlük kartuşu Agilent Technologies866953-9064.6 ve kez; 75 mm, 3,5 & # 956; m
,

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yokoyama, M. Polymeric micelles as a new drug carrier system and their required considerations for clinical trials. Expert Opin Drug Deliv. 7, 145-158 (2010).
  2. Shin, H. C., Alani, A. W., Rao, D. A., Rockich, N. C., Kwon, G. S. Multi-drug loaded polymeric micelles for simultaneous delivery of poorly soluble anticancer drugs. J Control Release. 140, 294-300 (2009).
  3. Adams, M. L., Lavasanifar, A., Kwon, G. S. Amphiphilic block copolymers for drug delivery. J Pharm Sci. 92, 1343-1355 (2003).
  4. Oerlemans, C., et al. Polymeric micelles in anticancer therapy: targeting, imaging and triggered release. Pharm Res. 27, 2569-2589 (2010).
  5. Shin, H. C., et al. A 3-in-1 polymeric micelle nanocontainer for poorly water-soluble drugs. Mol Pharm. 8, 1257-1265 (2011).
  6. Hasenstein, J. R., et al. Antitumor activity of Triolimus: a novel multidrug-loaded micelle containing Paclitaxel Rapamycin, and 17-AAG. Mol Cancer Ther. 11, 2233-2242 (2012).
  7. Mazzaferro, S., et al. Bivalent sequential binding of docetaxel to methyl-beta-cyclodextrin. Int J Pharm. 416, 171-180 (2011).
  8. Iwase, Y., Maitani, Y. Preparation and in vivo evaluation of liposomal everolimus for lung carcinoma and thyroid carcinoma. Biol Pharm Bull. 35, 975-979 (2012).
  9. Mishra, G. P., Doddapaneni, B. S., Nguyen, D., Alani, A. W. Antiangiogenic effect of docetaxel and everolimus as individual and dual-drug-loaded micellar nanocarriers. Pharm Res. 31, 660-669 (2014).
  10. Xu, W., Ling, P., Zhang, T. Polymeric micelles, a promising drug delivery system to enhance bioavailability of poorly water-soluble drugs. J Drug Deliv. 2013, 340315(2013).
  11. Lavasanifar, A., Samuel, J., Kwon, G. S. Poly(ethylene oxide)-block-poly(L-amino acid) micelles for drug delivery. Adv Drug Deliv Rev. 54, 169-190 (2002).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

la Y klemeSolvent D k mDinamik I k Sa lmasTers Faz HPLCDiyalizle Sal mla StabilitesiMisel BoyutuBirinci Derece Sal mPEG b PLA

İlgili makaleler