Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Primer Multipl Miyelom Hücrelerinin İlaç Duyarlılık Karakterizasyonu için bir Organotipik Yüksek Verimli Sistemi

8.3K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/53070

⸱

15 Temmuz 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cancer Imaging and Metabolism, H. Lee Moffitt Cancer Center and Research Institute

Bu makalede

Özet

Primer multipl miyelom hücreleri için yüksek verimli bir ilaç duyarlılık testi tanımlıyoruz. Çok kuyulu plakalarda kemik iliği mikro çevresinin (hücre dışı matriks ve stroma dahil) yeniden yapılandırılmasından ve hücre canlılığının uzunlamasına ölçülmesi için invaziv olmayan bir yöntemden oluşur.

Özet

Bu çalışmada biz, hasta kaynaklı multipl miyelom (MM) hücreler kemosensitiviteyi ve heterojenitesini tahmin etmek ex vivo ilaç duyarlılık testleri ve dijital görüntü analizi birleştiren yeni bir yaklaşım açıklar. Bu yaklaşım, hasta-Taze hücre dışı matrisin (kolajen ya da temel membran matrisi) ve stroma (dahil olmak üzere her kemik iliği mikro bir yeniden oluşan, çok oyuklu plakalara uygulanan mikroakışkan odaları içine, kemik iliği elde primer MM tohum hücreleri oluşur türetilmiş mezenkimal kök hücreleri) veya insandan türetilmiş endotel hücreleri (HUVECler). odaları, farklı ajanlar ve konsantrasyonları ile uyuşturulmuş olan ve bir dijital kamera ile donatılmış bir motorlu mikroskopta, parlak bir alan mikroskobu ile 96 saat süreyle sırayla görüntülenmiş. Dijital görüntü analiz yazılımı varlığı veya zar hareket yokluğu canlı ve ölü hücreleri algılar ve bir fonksiyon o kadar canlılığı değişim eğrileri üretirf ilaç konsantrasyonu ve maruz kalma süresi. Her ilaç, tümör nüfusun duyarlılığında parametrelerini yanı sıra, tümör heterojenite bir ölçüsü olarak, bu alt-popülasyonlarının sayısını belirlemek için bir hesaplama modeli kullanırlar. Bu hasta özel modeller daha sonra tedavi rejimleri taklit ve klinik yanıtı tahmin etmek için kullanılabilir.

Giriş

Bu yöntemin amacı, bu sonuçlar Kemoterapiye alt tespit etmek için kullanılabilir yeterli hassasiyetle, fizyolojik koşullara mümkün olduğunca yakın, ex vivo olarak ajanların bir panele birincil hücreler multipl miyeloma (MM), ilaç duyarlılığını karakterize etmektir tümör yükü ve içinde nüfusları sonuçta, klinik yanıtı tahmin etmek için tasarlanan hesaplama modelleri parameterize için.

Hesaplamalı modelleri, kanser konak-terapi etkileşimleri gibi kompleks sistemler, analiz etmek güçlü araçlardır. Ancak, modeller sadece veri onları parameterize eskisi kadar iyi. Ne yazık ki, literatürde mevcut olan en veriler genellikle birbirini dışlayan deney koşullarında elde edilenler gibi, bu tür modeller parametrelerini elde etmek için, mevcut biçimde kullanılamaz. Böylece, yeni deneyler genellikle gerekli deneysel parametrelerin set elde etmek amacı ile ihtiyaç vardır. Çoğu canlılık deneyleri, ancak, yıkıcı ve inci vardırBize zaman noktalarında az sayıda, genellikle sadece birine sınırlı. Bu büyük ölçüde bu tür deneyler sistemin zamansal dinamikleri hakkında bilgi vermek için başarısız beri kemosensitivite tahlillerin kullanımı, hesaplama modelleri parameterize için yaşlılık ve sakatlık. Bu genellikle, böylece mevcut deneysel koşullar sayısının sınırlandırılması, numune başına birkaç milyona sınırlı ve biyopsi sonra kısa bir ömre sahip olan primer kanser hücrelerinin, özellikle de geçerlidir. Buna ek olarak, çoğu canlılık deneyleri ayrıca hücreleri bozan ve yapılabilir deneyler sayısını sınırlar, protokole ekstra çalışma ekler ölçümü, zamanında olmayan kanser (stroma) hücrelerinden kanser ayrılmasını gerektiren .

40 yıl kadar önce, somon ve ortak 1 tümör hücrelerinin duyarlılığında değerlendirilmesi için in vitro koloni oluşturma deneyi kendi ünlü önerdi. Ne yazık ki bu deney sayesinde çoklu mye az sayıda karışık başarı bulunduKontrol koşulları altında koloniler oluşturabilen edildi Loma (MM) hasta numuneleri: Bu, AA hücrelerin 0.1 ila% 0.001,% sadece küçük bir alt-grup replikasyon kabiliyetine sahip olduğu tahmin edilmiştir multipl miyelom kök hücreler 2 olarak adlandırılan edilir. Bu anlamlı daha yeni modeller 3, testin başarı oranını ve bir anda test edilebilir ilaçların sınırlı sayıda. (Standart ya da deneysel) MM ajanlar, dört yıl önce daha çoktur Bu sorun artık çok daha önemlidir.

Ya bir hasta belirli bir ilaca "hassas" veya "dirençli" dir: Bu erken tahlillerin önemli bir sınırlama onların ikiye bölünmüş çıkışıdır. Hiçbir bilgi tümör nüfusun duyarlılık ve heterojen derecesine ilişkin sağlanmaktadır. Böylece, hızlı büyüyen dirençli hücrelerin küçük alt popülasyonlar olan hastalar tedaviye "hassas" olarak sınıflandırılır, ancak kısa bir süre nüks olur ve böylece değil bentedaviden Efit. Kanser hastalarının 4,5 genel sağkalım (OS) yanıt süresi önemi göz önüne alındığında, bu deneyler doğru sürekli OS tahmin etmek mümkün değildi nasıl açıktır.

Amacıyla bu sınırlamaları aşmak için, ve uyuşturucu bir panele kişiselleştirilmiş klinik yanıtı tahmin ediyorum hastaya özgü hesaplama modelleri üretmek edebilmek için, biz multipl miyelom (MM) hücre hatlarının olmayan yıkıcı test ilaç duyarlılığı için bir yöntem geliştirdik ve hücre dışı matriks ve stroma 6 olmak üzere kemik iliği mikroçevresindeki bir ex vivo yeniden, birincil MM hücreleri. Bu deney, ancak, kimin boyutları ve maliyetli ekipman belirli bir parça bir defada yapılabilecek deneyler veya ilaç sayısını sınırlı belirli bir ticari mikroakışkan slayt, güvenerek sınırlama vardı.

Burada anlatılan sistem, yüksek içine bu orijinal tahlil uzanırolmayan yıkıcı hücre canlılığını ölçmek için bir dijital görüntü analizi algoritmasına dayalı ilaçlar, in vitro tarama için Organotipik doz-yanıt platformu, -throughput. De 384 ya da 1536 oyuklu plakalarda her primer MM hücreleri, hücre-dışı matris ve hasta türevi stroma ve büyüme faktörleri de dahil olmak üzere kemik iliği mikro-3D rekonstrüksiyonu vardır. Canlı mikroskopi ve dijital görüntü analizi doz-yanıt yüzeyler üretmek için kullanılan farklı ilaç konsantrasyonları, hücre ölümü olayları tespit etmek için kullanılır. In vitro verilerden, bir matematiksel model hastanın tümör yükü içinde boyutu ve alt-popülasyonlarının kemosensitiviteyi tanımlar ve tümörü (klinik rejime 6 fizyolojik koşullarda ilaç (lar) nasıl tepki vereceğini simüle etmek için kullanılabilir Şekil 1).

Bu platformun temel yenilikler şunlardır: İlaç konsantrasyonlarda başına gereken kanser hücrelerinin, (a), az sayıda (1,000-10,000rasyon); (B) anılan ilacı, fizyolojik koşullar etkinlik (hücre dışı matrisin, stroma hasta türevli büyüme faktörleri) değerlendirilmesi; (C) Sadece parlak bir alan görüntüleme beri canlılık belirteçleri 7 No toksisite, floresan 8 veya 9 biyoparlaklık ile hücreleri transfect böylece hiç gerek kullanılır; (D) Sürekli görüntüleme konsantrasyonu ve uygulama zamanı (farmakodinamik) 'in bir fonksiyonu olarak, ilaç etki sağlar; ve (e) in vitro ve hesaplamalı evrimsel modeller arasındaki entegrasyon, klinik sonucu 6 (Silva ve ark., hazırlık) tahmin etmek.

Dijital görüntü analizi algoritması stromal hücrelerin kanser ayırt sağlar önemli bir faktördür altına onların farklı afinite de: dd hücreleri uygun ve stromal hücreler alt uygun ise, matris içinde süspansiyon halinde kalır yok iyi ve daha sonra streç.

Bu ayrılık bile MM ve stroma a da oluşurAynı zamanda tohumlanmıştır ve inkübasyon O / N işlemi sırasında oluşur yeniden. plaka santrifüj aşağı iplik aşağıdaki tohumlama daha bu süreci hızlandırır. Stroma düşük bir profil ve koyu gölge (Şekil 2) korurken Sonuç olarak, MM hücreleri, karanlık bir halka ile çevrili yuvarlak parlak diskler gibi görüntüde görünür. Algoritması ayarlamaları gibi boyut ve şekil olarak diğer morfolojik özellikleri, dayalı ayrı kanser ve stroma ile yapılabilir rağmen Böylece, mevcut haliyle tahlil, yapışmayan kanser hücreleri için uygundur. Bu protokolde, (kemik iliğinden elde edilen mezenkimal stem hücreleri) BHYK ve HUVECler, kemik iliği interstisyel ve perivasküler niş temsil eden, hücre-dışı matrisi (kollajen ve temel zar matris) iki tip olarak ko-kültürler iki tip tarif sırasıyla.

384-plaka kullanarak, ilaç başına 5 konsantrasyonları ve iki çoğaltır, biz tes başardıkTek bir hastanın numune ile 31 farklı ilaçlara t kadar. Ek Şekil 1 bir robot pipet kullanarak optimum dağılımını temsil ederken 1,536 kuyucuğu bu sayı, 3 şu anda manuel hücre tohumlama için kullanılan düzen göstermektedir 127. Şekil olduğunu. Şekil 3'ten tasarımda, her bir 384-oyuklu plaka 21 ilaç test 7 farklı ilaçlar, ya da bir hasta örneği 3 hasta numuneleri taşıyabilir. Her ilaç 5 konsantrasyonları ile temsil edilir, ve her bir durum çiftleri olarak tohumlanır. 4 kontrol kuyuları (ilaç yok) eklendi 7 ilaçlar (örneğin, kuyular 36-39, 126-129 ve 200-203) her biri için tohumlanır. Kullanılan ilaçların etkisini temin etmek için, insan miyeloma hücre kuşağı (örneğin, H929 ya da MM1.S), aynı zamanda tohumlandı ve (kuyular 76-89) kullanılan ilaçların her birinin en yüksek konsantrasyonda iki kopya halinde uyuşturulmuş. pozitif hücre hattı kontrolü onların doz yanıt eğrileri karşılaştırılabilir ac beri kullanılan ilaçlar, yeterli güce sahip olmalarını sağlarross deneyleri. Iki kuyu (kuyular 75 ve 90), görüntüleme sırasında tezgah üstü inkübatör olası sorunları tespit etmek için, başka bir deyişle, çevre koşulları için bir kontrol olarak, bir miyeloma hücre kuşağı ile tohumlanır. Kuyuların numaralandırma etme süresini azaltır ve ekipmanın aşınmasını azaltan mikroskop motorlu aşamasında tarafından katedilen mesafeyi azaltmak için zikzak bir yol izler.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Aşağıda açıklanan Moffitt Kurumsal Değerlendirme Kurulu tarafından onaylanmış ve H. Lee Moffitt Kanser Merkezi ve Araştırma Enstitüsü'nde yürütülen klinik araştırmada MM # 14745 altında gerçekleştirildi olarak biyopsi türetilen insan hücrelerinin kullanılması.

Kemik İliği ASPİRAT gelen MM Hücreleri 1. Sıralama

  1. Sodyum heparin şırınga içinde hastaların kemik iliği aspiratları (20 mi) toplayın.
  2. Ortam sıcaklığında 30 dakika boyunca 400 x g'de steril sulu ortam santrifüj gradyan: (steril PBS ile 1: 1) seyreltilmiş iliği santrifüjle mononükleer hücreleri izole edin.
  3. Mononükleer hücreleri içeren arayüzü, toplayın. Canlılığının belirlenmesi için tripan mavisi kullanarak, soğuk PBS ile hücreleri yıkayın ve bir hemasitometre veya otomatik hücre sayıcı kullanarak saymak.
  4. Plazma hücresi yüzdesini 11 değerlendirmek için Wright-Giemsa boyası ile ince katmanlı bir hücre hazırlama slayt 10 ve lekeyi hazırlayın.
  5. HesaplamakCD138 tanelerin miktarının göre hücreler ve plazma hücre yüzdesi sayısı kullanılır. Örnek başlayarak% 20'den az plazma hücreleri ise, ayırma tamponu 90 ul 5 x 10 6 hücre başına CD138 boncuk 10 ul kullanarak hücrelerin yeniden askıya. Örnek başlayarak% 20'den fazla plazma hücreleri ise, ayırma tamponu 80 ul, 1 x 10 7 hücre başına CD138 boncuk 20 ul kullanılarak yeniden süspansiyon haline getirilmiştir.
  6. 15 dakika boyunca 4 ° C 'de boncuklar olan hücreler inkübe edin.
  7. 35 mikron süzgeç vasıtasıyla hücrelerin önceden ıslatılmış ayrılık eklendi geçirin (LS) sütunlar (malzemelerin listesine bakınız) manyetik alan ayracı yerleştirilir.
  8. Mıknatıstan sütun çıkarın. Ayırma 1 ml tampon ile sütundan 3 kez yıkanarak CD138 seçilmiş hücreler toplanır.
  9. 10 slayt başka lekeli ince tabaka hücre hazırlığı ile CD138 zenginleştirme değerlendirin.
  10. Filtre plazma 0.22 mikron bir şırınga filtresi ile, her bir hastanın kemik iliği biyopsisinden elde edilmiştir. Taze plazma kullanCD138 + hücreleri aynı hastadan.
  11. % 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu,% 10 hastanın plazma ve% 1 penisilin-streptomisin ile RPMI-1640 takviye ederek deney için ortamı hazırlar.
  12. Seçim (CD138-) akış-through toplayın ve kemik iliği mezenkimal hücreler (BMSCs) seçmek için klasik yapışma yöntemi 12 izleyin. BMSCs kullanılmak üzere hazır olana kadar bu işlem hafta gerektirdiğinden, daha önceki hastalar ya da sağlıklı vericilerden BMSCs hazır olması gerekmektedir.

(Manuel Çok kanallı pipet kullanarak) Tabaklar 2. Tohumculuk Hücreleri

  1. Tercihen bir optik uygulamalar ve hücre kültürü için optimize edilmiş siyah duvarlı, çok oyuklu bir plaka (384 ya da 1536) ile saydam bir düz dipli kullanın.
  2. Kolajen tip I ya da temel membran matrisi ya Co-kültür BMSCs MM hücre Ancak HUVECler bazal membran matrisi gerektirir.
  3. Her hücre türü nihai yoğunlukları tutunAşağıdaki aralığı: MM hücre hatları için 3 x 10 5 hücre / mi, HUVEC ya KİKSH 2 x 10 5 hücre / mi, ve hasta-türevi MM hücreleri için 2 x 10 6 hücre / ml olmuştur.
    Not: Bu yoğunluklar tahlillerinde biyolojik alaka korurken mümkün olan en yüksek görüntü kalitesi ve mümkün olan en uzun süre görüntüleme sağlamak için deneysel optimizasyon sonucudur. MM hücre hatları da daha hızlı çoğaltma oranı ve daha büyük bir boyuta bağlı olarak birincil, MM hücrelerine daha düşük yoğunluklarda tohumlanır.
  4. KİKSH primer MM hücrelerinin Co-kültür:
    1. 4 ° C'de 10 x MEM 20 ul deiyonize H2O içinde 20 ul,% 7.5 sodyum bikarbonat çözeltisi 10 ul ve 1 x RPMI 1640, 50 | il ve mağaza oluşan önceden karıştırılmış ortam 100 ul alikotları hazırlayın.
    2. AA hücreleri ile plakaları ekim sırasında, 250 ul bir son hacme kadar 3.1 mg / ml sığır kollajen tip I 150 ul ile önceden karıştırılmış ortam alikotları karıştırın.
    3. Yeniden asmalaraltı kez, istenen son yoğunlukta RPMI 1640 hücre 50 ul son.
    4. P200 pipet kullanarak 300 ul bir son hacim oluşturmak için kolajen karışımı ile hücre süspansiyonuna karıştırılır.
    5. Manüel veya tekrarlayıcı pipet kullanarak, iyi 1536 gözlü levhalar (mekansal düzenlemesi bir örnek için adım 2.6 bakınız her çukuruna 384 oyuklu plaka ya da 2 ul her merkezinde / matriks karışımı nihai hücrenin 8 ul damla yatırmak kuyu).
    6. 500 xg'de 2 dakika süreyle Santrifüj plaka görüntüleme sırasında aynı odak düzlemine tüm hücreleri konsantre.
    7. Jel polimerizasyonu için, 1 saat için bir kuluçka makinesi (% 5 CO2, 37 ° C), plaka bırakın.
    8. 1536 oyuklu plakalar içinde desteklenmiş büyüme ortamı içinde 80 ul (RPMI-1640,% 10 FBS HI,% 10 hasta oluşan plazma,% 1 P / S), her bir sıra 384 oyuklu plakalar ya da 8 ul ekle.
    9. Plaka O / N stroma yapışması için inkübatör (% 5 CO2, 37 ° C), plakanın alt bırakın.
  5. Co-CuHUVEC primer MM hücre lture:
    1. Buz ile bir kova -80 ° C transfer bazal membran matrisi erimesine.
    2. Sayın ve ayrı bir tüp içinde 4 kez son yoğunluğuna, her biri, RPMI-1640 ortam içinde primer hücreleri ve HUVECler yeniden askıya.
    3. 1 oranında: 1 de hasta hücreleri ve HUVECler hacimleri karıştırın.
    4. Önceki adımda elde edilen hücre karışımı ile 1: bazal membran matrisi çözülmüş, ama yine de polimerize olmayan sonra, 1 karıştırın.
    5. Her bir merkezinde hücre-matriks karışımı yeterli olan tohum damlacıkları (384 oyuklu plakalar 8 ul 1536 kuyucuğu için 2 ul, kuyu mekansal düzenleme bir örnek için adım 2.6).
    6. 10 dakika boyunca 500 xg'de Santrifüj plaka.
    7. Inkübatör plaka matrisi polimerizasyonu için 1 saat boyunca (% 5 CO2, 37 ° C).
    8. Büyüme ortamı ekleme, 384 oyuklu levhalar için (her bir oyuğa 80 ul (RPMI-1640,% 10 FBS,% 10 hastanın plazma ve% 1 P / S ile takviye edilmiş) 1,5 8 ul36 oyuklu plakalar).
    9. Plakasının tabanına kadar HUVEC'lerin yapışması için inkübatör (% 5 CO2, 37 ° C), plaka O / N bırakın.
  6. ., 384 oyuklu plaka Tohum 3 tohumlama tipik bir dağılımını tasvir etmektedir.
    1. Ilaçlar, test edilecek da B2 başlayarak, çok sayıda sütun tohum. Şekil 3'ün örneğinde, yedi uyuşturucu kullanımı.
    2. Konsantrasyonları gibi birçok kez tohum tekrar kullanılır. Şekil 3'te örnek olarak beş konsantrasyonları kullanırlar.
    3. Kontrol koşulları için dört kuyu Tohum.
    4. Tekrarlayın 2.6.1 ve ikinci deney için 2.6.2 yineleyin.
    5. Tekrarlayın her hasta numune plakasına test edilecek için 2.6.4 için 2.6.1 adımları.
    6. Ilaçlar (iki kopya halinde), test edilecek kadar çok kuyucuklu kuyu iki sıra, her bir MM hücre doğrusu, tohum. Bu Gözlerden her biri kullanılan hazır yeterli Poten sahip olmasını sağlamak için, her ilaç yüksek konsantrasyon ile tedavi edilecektirCY (örneğin, bakınız Şekil 3).
    7. Bir MM hücre hattı ile Tohum iki kuyu vb tezgah üstü inkübatör düzgün işlemesi, büyüme ortamı gibi deneysel koşullar, kontrol olarak hizmet vermektedir.

3. Tabaklar Hücreleri Tohumlama (a Robotik pipet kullanarak)

Not: adım tohum Bu dizi, bir robot pipet kullanarak 384 oyuklu plaka. plaka tasarımı, primer AA hücreleri iki kez tekrarlanmış beş farklı konsantrasyonda 31, farklı bir ilaç paneline karşı test edilir Ek Şekil 1, ek bir negatif kontrol olarak gösterilmektedir. Gibi bir hücre dizisi aynı zamanda ilaç etkinliğinin değerlendirilmesi için pozitif kontrol olarak tohumlanır ve iki tekrarlı, en yüksek konsantrasyonda 31 ilaçlara karşı test edilir. sağlanan dosyalar belirli bir marka ve model içindir (Malzeme tabloya bakınız) fakat algoritma herhangi robot pipet adapte edilebilir.

  1. Birincil mm'lik bir hücre ko-kültürüKİKSH S:
    1. 10x MEM 240 ul deiyonize H2O içinde 240 ul,% 7.5 sodyum bikarbonat çözeltisi 120 ul, 600 1 x RPMI 1640 ul ve 1.8 ml 3.1 mg / ml sığır kollajeni tip I Etiket oluşan 15 ml'lik bir tüp hazırlanır "CD138 + için ön-karışım" gibi tüpü. Buz üzerinde kullanıma kadar yerleştirin.
    2. 10x MEM 50 ul deiyonize H2O içinde 50 ul,% 7.5 sodyum bikarbonat çözeltisi 25 ul, 1 x RPMI 1640 125 ul 3.1 mg 375 ul oluşan bir 1.5 ml tüp hazırlanır / ml sığır kollajeni tip I Etiket "Hücre Hattı ön karışım" olarak tüpü. Buz üzerinde kullanıma kadar yerleştirin.
    3. Altı kez nihai istenilen yoğunlukta RPMI 1.640 yılında CD138 + hücreler 300 ul yeniden askıya. Altı kez nihai istenilen yoğunlukta RPMI 1640 yılında BMSC hücrelerinin 300 ul yeniden askıya. 1.5 ml tüp ve etiket "CD138 +" birlikte her iki hacimleri karıştırın. Inkübatör kullanıma kadar yerleştirin.
    4. 60 ul yeniden askıyaaltı kez, istenen son yoğunlukta RPMI 1640 hücre hattı. Altı kez nihai istenilen yoğunlukta RPMI 1640 yılında BMSC hücrelerinin 60 ul yeniden askıya. 1.5 ml tüp ve etiket "Hücre Hattı" nda bir araya hem hacimleri karıştırın. Inkübatör kullanıma kadar yerleştirin.
    5. Robotik pipet ile verilen yazılımı kullanarak, ilk komut dosyasını, "cell_seedingPt47.PGM" yüklenemedi. Robotun, sırasıyla istasyon A, B ve E bir 200 ul pipet kutusu, bir mikrotitre plaka, ve steril bir 384 plaka yerleştirin.
    6. Tüplerin içeriğini ve "CD138 +" "CD138 + için ön karışımı" karıştırın. Mikrotiter plakasının iyi # 1 içeriğinin 1.5 mi aktarın. Buz üzerinde hacim kalan tüp yerleştirin. Programını başlatın. Robot 384 plaka ilk 176 kuyu (11 en soldaki sütun) tohum ve ardından duraklar. Mikrotiter plakasının iyi # 2 için buz üzerinde tüp kalan aktarın. Programı devam edin.Robot 384 plaka ve duraklama kalan 144 kuyu tohum olacak.
    7. Tüplerin içeriği "hücre hattı için ön karışım" ve "Hücre Hattı" karıştırın ve mikrotiter plakasının # 3 içeriğini aktarın. Programı devam edin. Robot 384 oyuklu plakanın geriye kalan 64 kuyu tohum olacaktır.
    8. 500 x g'de 10 dakika 4 ° C'de santrifüj 384 oyuklu plaka koyun. Transfer levhası kollajen polimerizasyonu için 1 saat boyunca (% 5 CO2, 37 ° C) kuluçka.
    9. İkinci komut dosyası, "media_layer.PGM" Yük. 120 ul pipet kutusu,% 10 FBS,% 10 hastanın plazma ve% 1 P / S ile takviye edilmiş RPMI-1640 içinde 31 ml bir ayıraç hazne ve istasyon A, B ve E içine hücreleri ile 384 oyuklu plaka koyun sırasıyla. Programı çalıştırın. Robot her kuyuya medya 81 ul transfer olacak. Bittiği zaman, / N O substrata uymak için stroma inkübatör ve izin 384-plaka transfer.

4. İlaç Hazırlama ve Plakaların drugging (Manuel Çok kanallı pipet kullanarak)

  1. Kuyulara ilaç ekleme işlemini kolaylaştırmak ve karışıklık olasılığını azaltmak amacıyla Şekil 3'e benzer bir şablon hazırlayın.
  2. 96 oyuklu bir plaka içerisinde, ilaçların her bir seri seyreltme, bir 3-kat seyreltme kullanarak beş konsantrasyonları için, örneğin, tabak içinde test edilecek Hazırlama:
    1. Iyi 10x en yüksek konsantrasyonda istenen konsantrasyona ilacın 120 ul ekleyin. Hücreler plaka maruz kalacağı yüksek konsantrasyon 50 uM olması durumunda örneğin, 500 uM melfalan kullanın.
    2. Büyüme ortamı 80 ul ekle dört ardışık oyuklara (RPMI% 10 FBS,% 10 hasta türevi plazma ve% 1 penisilin / streptomisin (P / S) ile desteklenmiş).
    3. Aktarım, ikinci ilk kuyusundan 40 ul ve birinci kuyunun ilaç konsantrasyonu 1/3 ya da 1 ile 120 ul toplam hacmine tamamlamak üzere, karışımı67 uM.
    4. Kalan kuyulara adımı tekrarlayın 4.2.3 (örn, üçüncü karıştırmak için ikinci 40 ul transferi, daha sonra üçüncü, dördüncü, vb 40 ul transferi).
  3. Hücre plakası iyi gelen iyi içeren her ilaçtan 8 ul aktarın. Iyi içeren her ilaç hücre plakası 10 kuyu için yeterli hacme sahip olmalıdır. Şekil 3'ün örneğinde, her bir ilaç konsantrasyonu 8, oyuklara ilave edilir, en yüksek konsantrasyon, hariç olmak üzere, 6 farklı, oyuklara ilave edilir.
  4. Büyüme ortamı 8 ul ekle kontrol oyuklarına (RPMI% 10 FBS,% 10 hasta türevi plazma ve% 1 P / S ile takviye edilmiş).
  5. Mikroskop yerleştirin hücreleri kısa sürede hazır olarak ve tezgah üstü inkübasyon açın.

Plakaların 5. İlaç Hazırlama ve drugging (a Robotik pipet kullanarak)

  1. Http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Precision XS fi dan robotik pipet için komut dosyaları indirinles.zip
  2. Robotik pipet kullanıcı arayüzünde komut "media_layer_DRUGPLATE.PGM" Yük. 120 ul pipet kutusu,% 10 FBS,% 10 hastanın plazma ve% 1 P / S ve istasyonları, sırasıyla A, B ve D, boş bir 384-oyuklu bir plaka ile desteklenmiş RPMI-1640 içinde 21 ml 'si ile hazne yerleştirin. Programı çalıştırın, robotik pipet 384 plaka tüm kuyulara medya 30 ul katacak.
  3. Ek, Şekil 2 ile ilgili şablon sonra bir mikrotitre plakasının her bir oyuğuna 20x en konsantrasyondaki ilacın 200 ul ilave edin. Bu kurulum 31 ilaçlara kapasitelidir. Kontrol gözü (CTRL) için% 10 FBS,% 10 hastanın plazma ve% 1 P / S ile takviye edilmiş RPMI-1640 ekler.
  4. Istasyonları, sırasıyla A, B ve C bölgesi (aşama 5.1) ortamı ile 384 oyuklu 20X konsantrasyonunda ilaç ile 120 ul pipet kutusu, mikrotitre plakası yerleştirin ve. Programı "drug_plate.PGM" Yük. Robotik pipet seri seyreltme yaratacakEk Şekil 1'de mekansal dağılımı aşağıdaki 3, 1:.
  5. 120 ul pipet kutusu istasyonları, sırasıyla A, B ve C içine ilaç (adım 5.3 arasında) seyreltme ve (aşama 3.1.9 gelen) hücreler ile 384 oyuklu plaka ile 384 oyuklu plaka koyun. Yük ve çalışma programı "drug_add.PGM". Robotik pipet hücre plakasına muadili ilaç levhanın herbir ilacın 8 ul transfer edecektir. Bir kez işlenmiş, mümkün olan en kısa zamanda, dijital mikroskop inkübatör hücre plakası aktarın.

Plate Hücreleri 6. Görüntüleme

Not: Aşağıdaki prosedür Evos Oto FL mikroskop için de geçerlidir, ancak kolayca tezgah üstü inkübasyon veya kuvöz gömülü mikroskopları ile diğer motorlu sahne mikroskopları adapte edilebilir.

  1. Ile tezgah üstü inkübatör içini temizlemek bir etanol-ıslak mendil ve dikkatle inc kapağını yerleştirirken plakanın kapağını kaldırınubator.
  2. Işaretleri eklemek için yazılım adımları izleyin. Bu ilgi bölgeler için önemli noktalara başvurmak için kullanılan bir terimdir, deney (ayrıntılar için yazılım kullanım kılavuzuna bakın) sırasında arka arkaya yansıması için.
  3. 5X veya 10X büyütme hedefi kullanın. Odak 2 Şekil benzer olduğundan emin olun: MM hücreleri koyu halka ve BMSCs veya HUVECler zorlukla görülebilir çevrili parlak diskler görünür. Bazı birincil MM hücreleri çok küçük ve böylece ince ayar optimum odak bulmak için gerekli olabilir vardır.
  4. 10-30 dakika arasında ve en az 96 saat süresince satın alma aralığını ayarlayın. Satın arasında daha uzun aralıklar kabul edilebilir olsa da, 45 dakika ya da daha fazla aralıklarla belirgin canlılığının ölçüm hassasiyetini azaltır.
  5. Her kuyunun görüntüleri Beacon-1, Beacon-2, vb robotik pipet kullanılmışsa adlı ayrı dosyalarda saklanır, böylece gösterilen sırayla işaretleri ayarlamak, yazılım yapılandırmaEk Şekil 3.
  6. Hücreler Optimum koşullarda olacak şekilde inkübatör nemlendirici ve gaz yeterince su, olduğundan emin olun.
  7. Deneyin tamamlanmasından sonra, analiz çalıştırılacağı bilgisayara görüntüleri içeren klasörleri kopyalayın.

İlaç Duyarlılık 7. Kantitasyonu

Not: Aşağıdaki talimatlar bir kişisel bilgisayar bir çok-çukurlu plaka analizden sonra, bir bilgisayar küme kullanılarak görüntü analizi kullanımı kılavuz çok zaman alıcıdır.

  1. NIH web sitesinden ImageJ yazılımını indirin: http://imagej.nih.gov/ij/
  2. Http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/ de script ve eklentileri indir
  3. Dijital görüntü analizi yazılımı çalıştırmak için http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/UserGuide.pdf yönergeleri izleyin. Sonuç EAC için düzenli aralıklarla canlılık ölçümleri içeren Results.csv adında bir elektronik tablo olmalıDeney (örneğin, 96 saat) boyunca plaka h de.
  4. Manuel çok kanallı pipet kullanarak, aşağıdaki adımları uygulayın.
    1. Dosyayı http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/ExperimentalDesign.txt indirin ve adım 3.1 tanımlanan plaka planına uyması için değiştirmek (örneğin, Şekil 3).
    2. Yazılım http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Evos384.jar indirin ve adımları giriş parametresi olarak 5.3 ve 5.4 oluşturulan dosyaları kullanarak çalıştırın. Sonuç birden elektronik tablolar içeren bir klasör adı Raporu, her biri belirli bir ilaç için sonuç gruplandırma olacaktır.
    3. Hesap tablosu şablonuna http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/GraphPadAnalysisPT.pzfx içinde kopyalama ve yapıştırma içeriği
      Not: Sonuç, böyle bir ilaç konsantrasyonu ve maruz kalma süresinin bir fonksiyonu olarak farklı ilaçlara örnek kemosensitiviteyi temsil Şekil 4'te gösterilen biri olarak grafikler olmalıdır.
    4. Bir robot pipet kullanarak, aşağıdaki adımları uygulayın.
      1. Http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Robotic Şablon Files.zip gelen robotik pipet Download komut dosyalarını şablon dosyalarını indirin ve bir dizindeki dosyaları ayıklayın.
      2. Hücreleri ile plaka ilaçların listesi ve en yüksek ilaç konsantrasyonuna göre DrugList.csv dosyasını değiştirin. Ek Şekil 2 düzenini takip edin.
      3. Parametre olarak adım 7.3 aşama 7.5.1 çıkarılan dosyaları ve dosyaların Results.csv içeren klasörü geçen programı BuildExperimentalDesign.java çalıştırın. Sonuç, iki klasör MM1_S ve PtSample isim olmalıdır. İlk hücre çizgisi Pozitif kontrol için oyuklara (ilaç ve konsantrasyon) bir tanımını içerir. İkinci hasta hücreleri ile seribaşı plaka parçası ile ilgili aynı bilgileri, ancak içerir.
      4. Adım 7.5.3 oluşturulan dizin her dosyayı Results.csv kopyalayın. İndirYazılım http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Evos384.jar hem klasörler için adımlar 7.5.3 oluşturulan dosyaları kullanarak çalıştırın. Sonuç 7.5.3 oluşturulan klasörlerin her biri bir klasör adı Raporu olacaktır. Rapor klasörü her biri belirli bir ilaç için sonuç gruplama, birden elektronik tablolar içeriyor.
      5. Programı BuildGraphPadFile.java çalıştırın ve parametre olarak adım 7.5.1 yılında Ayıklanan dosyaları içeren klasörü geçmek ve dosyaları adım 7.3 den Results.csv. Sonuçlar, konrol bir GraphPad 31 ilaçlarının her biri için doz tepki eğrileri içeren dosya ve normalleştirilmiş olur. Her grafik birincil MM hücreleri için 5 ilaç konsantrasyonlarını ve pozitif hücre hattı kontrolü için tek konsantrasyon içerecektir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Deney akışı kısaca Şekil 1'de açıklanan tüm adımları başarıyla tamamlandığı takdirde, mikroskop ile elde edilen görüntüler Şekil 2'ye eşdeğer olmalıdır. MM hücreleri açıkça parlak diskler ve BMSCs veya HUVECler zor görünür olmalıdır görülmelidir canlı ve de arka planda dağıtılır. Şekil 2A'da görüldüğü gibi, DD hücreleri bir hastadan diğerine boyutu değişir, ancak genel olarak hücre çizgileri daha küçüktür. Pratik olarak deney aralığında ex vivo repl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Özet olarak, bu kemik iliği, bir yeniden birincil MM hücre ve ilaç ex vivo farmakodinamik kemosensitiviteyi ölçmek için güçlü ve yüksek kapasiteli bir yöntemdir. Bu protokol kapsamında kritik adımlar kuyuların uygun tohumlama ve yeterli (beklenen sonuçlar için bakınız Şekil 2) odaklama: MM ve stromal hücreler düzgün yayılı sağlamak, bu stromal hücreler, kuyunun dibine yapışık olan MM tüm Hücreler, MM hücreleri koyu halka çevrili aydınlık diskin yönü olan aynı odak düzleminde ve vardır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu araştırma Florida'nın Bankhead-Coley Takımı Bilim Grant (2BT03), Sağlık / Ulusal Kanser Enstitüsü (1R21CA164322-01) ve Moffitt Kanser Merkezi'nin Takım Bilim Grant National Institutes Devlet tarafından finanse edildi. Bu eser, H. Lee Moffitt Kanser Merkezi ve Araştırma Enstitüsü, bir NCI belirlenen Kapsamlı Kanser Merkezi'nde (P30-CA076292) de çeviriyle ilgili araştırma Çekirdek Tesisi tarafından kısmen desteklenmiştir. Birincil hücrelere Erişim Moffitt Kanser Merkezi'nde Toplam Cancer Care Protokolü'nün sayesinde mümkün olmuştur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
EVOS FL AUTOAMGAMAFD1000 + AMC1000Motorlu tabla ve tezgah üstü inkübatör ile donatılmış dijital mikroskop.
384 kuyulu plaka CellBindCORNINGCLS3683 SIGMACorning CellBIND 384 kuyulu plaka
384 kuyulu plaka, polistiren, CellBIND yüzey, steril, şeffaf düz tabanlı, siyah, kapaklı
1.536 kuyulu plaka CellBindCORNINGCLS3832 ALDRICHCorning 1.536 kuyulu plaka, düşük tabanlı, yüzey işleme CellBIND, steril
Ficoll-Paque Plus GE SağlıkGE17-1440-02 SIGMAİnsan periferik kanından lenfositlerin in vitro izolasyonu için.
CD138 manyetik boncuklarMiltenyi 130-051-301CD138+ hücrelerinin seçimi için antikor konjuge manyetik boncuklar.
LS sütunlarıMiltenyi   130-042-401Hücrelerin ayrılması için sütun.
MidiMACS AyırıcıMiltenyi 130-042-302Ayırma sütunu için mıknatıs.
MatrigelSigma-AldrichE6909Engelbreth-Holm-Swarm murin sarkomundan SIGMA ECM Jeli
GetrexLife TechnologiesA1413201LDEV-İçermeyen Azaltılmış Büyüme Faktörü Bazal Membran Matrisi
HUVECYaşam TeknolojileriC-003-25P-Bİnsan Göbek Veni Endotel Hücreleri (HUVEC)
RPMI-1640 medyaGIBCO11875-093RPMI 1640 Orta + L-Glutamin + Fenol Kırmızı
FBS Isı ile inaktiveedilmiş GIBCO10082-147Fetal Sığır Serumu, sertifikalı, ısı ile inaktive edilmiş, ABD menşeili
3.1 mg/ml Sığır kollajen tip IGelişmiş Biomatrix5005-BSığır Kollajen Solüsyonu, Tip I, 3 mg/ml, 100 ml
Hassas XSBIOTEKPRC3841Robotik pipetleyici sistemi

Kaynaklar

  1. Salmon, S. E., et al. Quantitation of differential sensitivity of human-tumor stem cells to anticancer drugs. N Engl J Med. 298, 1321-1327 (1978).
  2. Suggitt, M., Bibby, M. C. 50 years of preclinical anticancer drug screening: empirical to target-driven approaches. Clin Cancer Res. 11, 971-981 (2005).
  3. Kirshner, J., et al. A unique three-dimensional model for evaluating the impact of therapy on multiple myeloma. Blood. 112, 2935-2945 (2008).
  4. Durie, B. G., Jacobson, J., Barlogie, B., Crowley, J. Magnitude of response with myeloma frontline therapy does not predict outcome: importance of time to progression in southwest oncology group chemotherapy trials. J Clin Oncol. 22, 1857-1863 (2004).
  5. Harousseau, J. L., Attal, M., Avet-Loiseau, H. The role of complete response in multiple myeloma. Blood. 114, 3139-3146 (2009).
  6. Khin, Z. P., et al. A preclinical assay for chemosensitivity in multiple myeloma. Cancer Res. 74, 56-67 (2014).
  7. Misund, K., et al. A method for measurement of drug sensitivity of myeloma cells co-cultured with bone marrow stromal cells. J Biomol Screen. 18, 637-646 (2013).
  8. Ramasamy, K., et al. Fluorescence-based experimental model to evaluate the concomitant effect of drugs on the tumour microenvironment and cancer cells. Br J Haematol. 157, 564-579 (2012).
  9. McMillin, D. W., et al. Tumor cell-specific bioluminescence platform to identify stroma-induced changes to anticancer drug activity. Nat Med. 16, 483-489 (2010).
  10. Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods Enzymol. 533, 235-240 (2013).
  11. Al-Quran, S. Z., Yang, L., Magill, J. M., Braylan, R. C., Douglas-Nikitin, V. K. Assessment of bone marrow plasma cell infiltrates in multiple myeloma: the added value of CD138 immunohistochemistry. Hum Pathol. 38, 1779-1787 (2007).
  12. Najar, M., et al. Mesenchymal stromal cells promote or suppress the proliferation of T lymphocytes from cord blood and peripheral blood: the importance of low cell ratio and role of interleukin-6. Cytotherapy. 11, 570-583 (2009).
  13. Scott, J. Phase i trialist. Lancet Oncol. 13, 236(2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

la Duyarl l k AnaliziMikroak kan Odac klarKemik li i AspiratStromal H crelerKolajen PolimerizasyonuDijital G r nt AnaliziCanl l k E rileriKemoterap tik AjanlarMotorize Mikroskop
Primer Multipl Miyelom Hücrelerinin İlaç Duyarlılık Karakterizasyonu için bir Organotipik Yüksek Verimli Sistemi
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.