Caco-2 hücreleri, lipitlerin ve yağda çözünen ilaçların/vitaminlerin enterosit taşınmasını incelemek için in vitro bir model olarak hizmet edebilir. Geçirgen membran sistemi, apikal kısmı bazolateral bölmeden ayırırken, lentivirüs ekspresyon sistemi etkili bir gen aşırı ekspresyon yöntemi sunar. Lipoproteinlerin izolasyonu TEM ile doğrulanır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Bağırsak tarafından Lipit Transport Eğitim için Caco-2 hücreleri kullanarak
Bu makalede
Özet
Özet
Diyetle yağ emilimi ile ilgili çalışmalar genellikle lenf kanülü ile donatılmış bir hayvan modeli kullanılarak yapılır. Bu hayvan modeli, diyetle alınan yağ emiliminin in vivo modeli olarak yaygın olarak kabul edilse de, ilgili cerrahi teknikler zorlu ve pahalıdır. Hayvan modelinin genetik manipülasyonu da maliyetli ve zaman alıcıdır. Alternatif in vitro model tartışmasız daha uygun fiyatlı, zaman kazandıran ve daha az zorlayıcıdır. Daha da önemlisi, in vitro model, araştırmacıların enterositleri izole bir sistem olarak incelemelerine olanak tanıyarak tüm organizma modelinin doğasında bulunan karmaşıklığı azaltır. Bu makale, insan kolon karsinomu hücrelerinin (Caco-2), lipitlerin ve yağda çözünen ilaçların ve vitaminlerin enterosit taşınmasını incelemek için in vitro bir model olarak nasıl hizmet edebileceğini açıklamaktadır. Caco-2 hücrelerinin uygun bakımını ve lipit karışımlarının hazırlanmasını açıklar; Ve ayrıca geçirgen membran sistemini kullanmanın değerli seçeneğini tartışır. Diferansiye Caco-2 hücreleri polarize olduğundan, geçirgen membran sistemini kullanmanın temel avantajı, apikali bazolateral bölmeden ayırmasıdır. Sonuç olarak, lipit karışımı apikal bölmeye eklenebilirken, lipoproteinler bazolateral bölmeden toplanabilir. Ek olarak, lentivirüs ekspresyon sisteminin Caco-2 hücrelerinde gen ekspresyonunu yukarı regüle etmedeki etkinliği tartışılmıştır. Son olarak, bu makale, transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ile bağırsak lipoproteinlerinin başarılı bir şekilde izole edilmesinin nasıl doğrulanacağını açıklamaktadır.
Giriş
4 - diyet yağ ve lipid içinde çözünür ilaçlar ve vitaminler intestinal çalışmaları lenf fistül MODEL 1 kullanılarak in vivo olarak gerçekleştirilebilir. Ancak, ilgili cerrahi teknikler sadece zor değil, aynı zamanda pahalı değil. In vivo kullanılabilmektedir dışkı analizi dayalı yaklaşımlar da, mide-barsak sisteminde 2,5 yüzdesi alımını belirlemek için temel olarak kullanılmaktadır. Bu yazıda anlatılan in vitro model daha düşük maliyetli olduğunu ve ilgili teknikler tartışmalı az zorlayıcı bulunmaktadır. Genetik modifikasyonlar çalışmaları da zaman alıcı, bu in vitro bir model kullanılarak gerçekleş....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
CACO-2 hücrelerinin 1. Bakım
- Düzenli doku kültürü yemekleri kullanma
- (FBS, 37 ° C su banyosu içinde şişe yerleştirerek bir dondurulmuş şişesinden alınan Caco-2 hücreleri çözülme ve hemen önceden ısıtılmış büyüme ortamı (% 15 fetal bovin serumu, 10 ml içeren 10 cm'lik bir doku kültürü kabı eklemek ) Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM)) 'de.
- Caco-2 hücreleri% 50-70 kaynaşmaya ulaştığı zaman, onları 1 bölünmüş: müstakil kadar 37 ° C'de% 0.05 tripsin / 0.53 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA), 3 ml ile hücrelerin inkübe edilmesi ile 6 (15 dk) . Hücre topaklaşmayı önlemek yumuşak pipetleme hücreler karıştırmak için bir....
- (FBS, 37 ° C su banyosu içinde şişe yerleştirerek bir dondurulmuş şişesinden alınan Caco-2 hücreleri çözülme ve hemen önceden ısıtılmış büyüme ortamı (% 15 fetal bovin serumu, 10 ml içeren 10 cm'lik bir doku kültürü kabı eklemek ) Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM)) 'de.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
1 görüntüler, normal 13-gün sonrası birleşik Caco-2 hücreleri Şekil. Kubbe-şekilli yapılar ve hücre içi lipid damlacıkları görünümü farklılaşmış Caco-2 hücreleri için karakteristiktir. Caco-2 hücreleri tohumlama sırasında eşit dağılmış değil, onlar kümelenir ve yemeğin belirli alanlarda sarmak olacaktır; ve herhangi bir hücrelerde olmadan çanak birkaç alanları olacaktır. Swirling ve eğimli bir yüzeye çanak yerleştirilmesi kaçınılmalıdır. Bu post-birleşik Caco-2 hücreleri yeni büyüme ort.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu yazıda, kullanılabilecek iki sistem Caco-2 hücreleri, yani düzenli doku kültürü çanak ve geçirgen zar açıklanmıştır korumak için. geçirgen zar sistemi kullanmanın faydaları apikal ayrılmasını ve bazolateral bölmeleri ve lipid karışımı inkübe ve aynı zamanda lipoprotein salgılanmasını toplamak için yeteneği vardır. Ancak, geçirgen zar ekler pahalıdır, ve polikarbonat membran iyi bir hücre görünürlüğü izin vermez. Bu in vitro modelin avantajlarından biri genetik manipülasyon çalışmaları daha ekonomik ve daha a.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarın açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Teşekkürler
Bu çalışma, California Northstate Üniversitesi Eczacılık Fakültesi'nden (AMN'ye) Tohum Hibe Ödülü tarafından desteklenmiştir. Yazarlar, bu makalenin yayın maliyetini karşıladığı için California Northstate Üniversitesi Eczacılık Fakültesi'ne ve bu makalenin düzenlenmesindeki yardımları için George Talbott'a teşekkür eder.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| DMEM | VWR | 16750-112 | Hücre eklemeden önce büyüme ortamını ayrı doku kültürü kabında önceden ısıtın |
| FBS | Fisher | 3600511 | Serumumuzu ısıtmıyoruz |
| VWR | 45000-660 | Hücreler tripsin tedavisinden önce PBS ile yıkanabilir | |
| Geçirgen membran sistemi | Fisher | 7200173 | 10 cm çanak, 3 mm gözenek boyutu, polikarbonat membran |
| 10 cm çanak | Fisher | 08-772-E | Doku kültürü kabı |
| 15 cm tabak | Fisher | 08-772-24 | Doku kültürü kabı |
| 24 oyuklu plaka | Fisher | 12565163 | Doku kültürü plakası |
| Lipid bazlı transfeksiyon reaktifi | Fisher | PRE2691 | Diğer transfeksiyon reaktifi ile ikame edilebilir |
| Azaltılmış serum ortamı | Invitrogen | 11058021 | Transfeksiyon |
| için pLL3.7 eGFP | Addgene | 11795 | https://www.addgene.org/11795/ |
| Şişe üstü filtre | Fisher | 9761120 | 0,45 mm gözenekli |
| Polybrene | Fisher | NC9840454 | 10 mg / ml |
| Oleik asit | Sigma | 01383-5G | Donma-çözülme döngüsünü önleyin |
| Lesitin | Fisher | IC10214625 | Yumurta lesitini |
| Sodyum taurokolat | Fisher | NC9620276 | Ürün durduruldu; Alternatif katalog numarası: 50-121-7956 |
| Proteaz inhibitörü kokteyl tableti (EDTA içermez) | Fisher | 5892791001 | Esas olarak TEM analizine ihtiyaç duyan numuneler için kullanılır |
| Polikarbonat ultrasantrifüj tüpü | Fisher | NC9696153 | Birden çok kez yeniden kullanmak tüpü çökertecektir |
| Ultrasantrifüj tüpü kapağı | Fisher | NC9796914 | Tüpü/kapağı rotordan çıkarmak için bir alet gereklidir |
| Şırınga | Fisher | 50-949-261 | Tek Kullanımlık |
| Şırınga filtresi | Fisher | 09-719C | Gözenek boyutu = 0,2 mm; naylon |
| Fosfotungstik asit | Fisher | AC208310250 | % 2 fosfotungstik asit hazırlamak için, pH 6.0 |
| Cımbız | Fisher | 50-238-62 | Ekstra ince ve güçlü ipuçları |
| Formvar/karbon ızgara | Fisher | 50-260-34 | Formvar/karbon film kare ızgara 400 Bakır |
Kaynaklar
- Drover, V. A., et al. CD36 deficiency impairs intestinal lipid secretion and clearance of chylomicrons from the blood. J Clin Invest. 115 (5), 1290-1297 (2005).
- Nauli, A. M., et al.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
