Katı Lipit nanopartiküller (SLNs) Hücre içi Hedefleme için başvurular

Özet

Bu çalışmada, biyouyumlu nanopartiküllerin ultra küçük popülasyonlarını sentezlemek için bir yöntemin yanı sıra, hücresel etkileşimlerini değerlendirmek için birkaç in vitro yöntem tanımlanmıştır.

Özet

Nanoparçacık tabanlı dağıtım araçları, hücresel sinyallemeyi ve gen ekspresyonunu spesifik olarak değiştirmek için bir mekanizma sağlayarak hücre içi hedefleme uygulamaları için büyük umut vaat etmiştir. Önceki bir araştırmada, topikal ilaç dağıtımı ve biyobelirteç tespit uygulamaları için ultra küçük katı lipid nanopartiküllerinin (SLN'ler) sentezi gösterildi. SLN'ler, umut verici bir ilaç dağıtım aracı olarak ortaya çıkan bir nanopartikül dağıtım sisteminin iyi çalışılmış bir örneğidir. Bu çalışmada, SLN'lere floresan bir boya yüklendi ve parçacık-hücre etkileşimlerini araştırmak için bir model olarak kullanıldı. Faz ters çevirme sıcaklığı (PIT) yöntemi, biyouyumlu nanopartiküllerin ultra küçük popülasyonlarının sentezi için kullanıldı. Nanoparçacık-hücre etkileşimi çalışmalarından önce uygun dozlama seviyelerini belirlemek için bir 3-(4,5-dimetiltiyazol-2-il)-2,5-difenilfeniltetrazolyum bromür (MTT) testi kullanıldı. Ayrıca, primer insan dermal fibroblastları ve fare dendritik hücreleri zamanla boya yüklü SLN'ye maruz bırakıldı ve toksisite ve partikül alımı ile ilgili etkileşimler floresan mikroskobu ve akış sitometrisi kullanılarak karakterize edildi. Bu çalışma, bir nanopartikül dağıtım sistemi olarak ultra küçük SLN'lerin, farklı hücre tiplerinin hücre içi hedeflemesi için uygun olduğunu göstermiştir.

Giriş

Nanoparçacık tabanlı dağıtım araçları, özellikle hücresel sinyalizasyon ve gen ifadesini değiştirmek için bir mekanizma sağlayarak, hücre içi hedefleme uygulamalar için büyük umut göstermiştir. Bu araçlar, ilaç, proteinler, hem de hücresel yanıtları etkileyecek ve hedef dokularda arzu edilen bir etkiyi elde etmek için tasarlanmış bir nükleik asit ile yüklenebilir. Nanocarriers birçok tipi lipidler, polimerler, silisyum ve manyetik malzemeler de dahil olmak üzere terapötik ve diagnostik yararı için incelenmiştir. Bu sistemler bir terapötik hedef dokularda konsantrasyonu, ve sistemik toksisite azalmasına sebep lokalize ilaç dağıtımı için potansiyeli, için çekicidir.

Katı lipid nanoparçacıklarının (SLNs) son yıllarda umut verici bir ilaç verme vasıtası olarak ortaya çıkan bir nanopartikül verme sisteminin iyi çalışılmış örnektir. SLNs hali hazırda biyo-algılayıcı ^1, kozmetik ² ve t de dahil olmak üzere çok sayıda uygulama için formüle edilebilirherapeutic teslimat ^3-7. Onların yarar onlar gelişmiş biyouyumluluk sonuçlanan emilebilir, toksik olmayan lipitlerin tamamen oluşmaktadır gerçeğinden kaynaklanmaktadır. Sentez sırasında, lipofilik ilaçlar böylece parenteral uygulama için ilacın çözünürlüğünü ve uygunluğu, artan SLN araç içine dahil edilebilir. SLN araçlar aynı zamanda bozulması ve açıklığını azaltarak ve terapötik etkisini maksimize kapsüllü terapötikler stabilize etmek için yardımcı olur. Bu araçlar sayesinde vücut sıcaklığı ^3,4,8,9 de stabiliteleri özellikle uzun etkili, kontrollü salım preparasyonlar için uygundur. Önemli olarak, lipid nanoparçacıklarının ilaç kapsülleme ilaç moleküllerin içsel farmakokinetik profiller değiştirir. Bu dar bir terapötik indeksi olan ilaçların kontrollü bir salınıma izin veren, bir potansiyel bir avantaj sağlar. SLN-dahil terapötik salım hızı ayarlanmış lipid bozunum hızı ya da ilaç yayılma hızına dayalı olabilirlipit matris.

SLNs genellikle belirli hedef dokularda birikir tasarlanmıştır. Örneğin, kendi boyutu (tipik olarak daha fazla 10 nm), tümör dokusunun sızdıran damar birikimi kolaylaştıran dolaşım içinde tutma güçlendirir. Buna ek olarak, partikül uygulama yolu gibi lenf düğümleri ^10,11 gibi özel fizyolojik yapılar hedef potansiyeli olan bir biyo dağılıma değiştirmek için gösterilmiştir. Hedef dokularda birikimi, uygun hücresel etkileşimi sağlamak ve nanopartiküllerin nihai bunun üzerine bağlı seçici hücre içine ve ¹² üzerinden iyon ve moleküllerin akışını kontrol etmek için hücre zarlarının yeteneği nedeniyle zordur. Hücresel alımı kolaylaştırmak için, peptidler, küçük moleküller, ve monoklonal antikorlar da dahil olmak üzere ^13,14 spesifik ligandlarla nanocarriers değiştirmek mümkündür. Pasif penetrasyon ve nanopartiküllerin aktif ulaşım de dahil olmak çeşitli mekanizmalarhücre zarı boyunca, daha önce ^3,12,15 tarif edilmiştir. Genel olarak, bu, hücre-nanopartikül etkileşimleri, hücre tipi veya hücre döngüsü faz ¹² olarak hücreye özel parametrelere ek olarak, boyut, şekil, yüzey yükü ve yüzey kimyası da dahil olmak üzere nanopartiküller fizikokimyasal özellikleri tarafından etkilendiği gösterilmiştir.

Bir önceki soruşturma aşaması inversiyon sıcaklığı (PIT) yöntemini kullanarak ^{17 16} topikal ve biyomarker algılama uygulamaları ¹ için alt 10 nm SLNs sentezini gösterdi. Bu sıcaklık yavaş yavaş değişir ise bileşimi aynı kalır ² hafif bir sentez yöntemidir. Isıtılmış çözeltinin sürekli karıştırma, gibi nanoemülziyon RT sonuçlarına soğur. Daha küçük bir partikül boyutuna sahip ¹ SLNs sentezinde Bu işlem, daha önce sonuçlar lipid nan sentezi için çeşitli yöntemler kullanılarak raporoparticles ^17-22. Elde edilen boyut ölçeği, en az 20 nm, artan yüzey alanı ve gelişmiş bir hücresel etkileşimler için potansiyeli, hücre içi hedef uygulamalar için avantaj sağlamaktadır.

Bir floresan boya veya terapötik sağlamak üzere tasarlanmıştır SLNs şematik, Şekil 1 'de gösterilmiştir. SLNs bir lipit iç (örneğin, lineer alkan) lipofilik bileşiklerin (örneğin, boyalar veya terapötik) dahil edilmesine izin veren ve bir yüzey aktif dış oluşmaktadır su ile çevrili (örneğin, doğrusal noniyonik yüzey aktif madde). Bu çalışmada, SLNs bir floresan boya ile yüklenir ve partikül-hücre etkileşimleri incelemek için bir model olarak kullanılmıştır. Primer insanlara özgü dermal fibroblastlar ve fare dendritik hücreler toksisite ve parçacık alımı ile ilgili etkileşimler karakterize etmek amacıyla zaman SLN yüklü boyamaktadır maruz bırakıldı. A: 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-diphenylphenyltetrazolium bromid (MTT) deneyi utili olduUygun doz seviyelerinin kurmak amacıyla zed. Floresan mikroskobu ve akım sitometri in vitro parçacık alımını incelemek için kullanılan iki yöntem vardı.

Önemli bileşenlerini gösteren SLN Şekil 1. şematik. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Protokol

SLNs 1. İşleme

1. SLNs sentezi
   Not: alt 20 nm SLNs ¹ hazırlamak için PIT yöntemi ^1,17,20 kullanın.
   1. Aseptik teknik, bioreagents veya hücre kültürü sınıf reaktifler ve steril malzemeler (yani, pipetler, spatula, şişeler, vs.) kullanın.
   2. SLNs sentezinde (Şekil 2) için bir biyogüvenlik kabini kullanın.
   3. Floresan boya, 0.6 mg birleştirin ve bir viyal (15 ml) içine Heneicosane (Lipid, 5 ağırlık / ağırlık olarak% lipid konsantrasyonu), 0.10 g, en ortak eriyik (Nil Kırmızısı (NIR), NIR konsantrasyonu yaklaşık 0,3 mg / ml'dir) 90 ° C ve heyecan.
   4. 0,11 g polioksietilen (10) oleil eter (yüzey aktif madde, 5,5 ağırlık / ağırlık olarak% sürfaktan konsantrasyonu) eklenir. 90 ° C ve karıştırın de elde edilen karışımın Co-eritebilir.
   5. 90 ° C'ye kadar karışıma ısı steril su 1,79 g ekleyin ve şeffaf nanoemülsiyondur oluşana dek karıştırın.
      Not: sürekli karıştırma ve kontrollü bir soğutma, SL altındaNs oluşturulur. Bu koşullar, bir yağ-içinde-su emülsiyonu su içinde yağ emülsiyonu, bir inversiyon neden olur. Böyle lipid damlacıkları Nir bölüm olarak lipofilik moleküller.
   6. Bir kontrol numunesi olarak hizmet vermek üzere, floresan boya eklemeden paralel nanoemülziyon hazırlayın. 90 ° C ve kızgın bir şişeye (15 mi) birlikte eriyik halinde Heneicosane 0.10 g ve 0.11 g polioksietilen (10) oleil eter birleştirin.
      1. 90 ° C'ye kadar karışıma ısı steril su 1,79 g ekleyin ve şeffaf nanoemülsiyondur oluşana dek karıştırın.
   7. Dahası steril 0.2 mikron filtre kullanarak her nanoemülziyon sterilize edin.
   
   Şekil SLNs sentezi 2. şematik. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
2. Partikül Boyutu ve Polydispersity
   1. Parçacık boyutu ve bir çoklu-dağınıklığa cam küvet kullanıldığında SLNs ¹ ve tanecik boyutunu ölçmek için tasarlanmış bir cihaz ölçmek için dinamik ışık saçılımı (DLS) kullanın.
   2. Numunelerin ölçümleri önce, standart hazırlanması ve ölçümü için, imalatçının protokolü takip eden iki bilinen standartların parçacık boyutlarına ölçer.
   3. Standart çözeltinin 1,5 ml 'si ile, cam küvet doldurun ve örnekleri gibi aynı ölçüm koşulları kullanılarak standart solüsyonu ölçer.
      Not: Önceki adım, her standart için tekrarlandı.
   4. Hazırlanan numuneler ölçün. Her biri için, aşağıdaki deney parametreleri kullanın: 100 saniye, suyun kırılma indeksi (1.33), su viskozitesi bir çalışma süresi 20 ° C (1,002 mPa saniye).
      Not: Bu teknik frekans nanopartiküllerin boyutunu ölçmek için ışık kaymıştır kullanır.
   5. Partiküller ortalama parçacık çapı ve poli dağılım raporcle boyut dağılımı.
3. Erime Noktası ve erime gizli ısısı
   1. SLNs ¹ termal davranışını incelemek için bir otomatik numune alıcı ve sıvı nitrojen soğutma kaynağı ile donatılmış bir diferansiyel taramalı kalorimetre (DSC) kullanarak.
   2. Yaklaşık 25 mg değerinde bir kütle ile 40 ul alüminyum tavaya olarak hazırlanmış SLNs pipet ve hava geçirmez bir şekilde DSC taraması sırasında nem kaybını en aza indirmek için evrensel bir kıvırma presi kullanılarak pan mühür.
   3. 5-80 ° C arasında, her nanoemülziyon ölçün.
   4. Erime noktası ve vadi erime noktasına ve malzeme miktarına bölünmesiyle DSC arsa eğri altında kalan alan integralini temsil DSC arsa gelen erime latent ısı erime için gerekli gizli ısının temsil bildirin.

Fibroblastları ve dendritik hücrelerle 2. SLNs Etkileşim

1. Primer insanlara özgü fibroblastlar Kültür
   1. Kültür primer insan fibroblasts düşük serum büyüme ek (LSGS) kiti ile desteklenmiş (106 ortamı), insan dermal fibroblastlar, kültürü için sıvı ortam içinde üreticinin talimatlarına göre aktifleştirilir. % 80 kaynaşmaya eriştikten sonra 37 ° C'de,% 5 _CO2 ve alt-kültür nemlendirilmiş bir atmosferde hücreleri koruyun.
   2. MTT ve görüntüleme oyuk başına 2 x 10 ⁴ hücre yoğunluğunda analizi bir 96-çukurlu plaka içinde tohum hücrelerinde, ve 37 ° CO / N önceden SLN maruz en dengelenmeye olanak her ikisi için.
   3. Lipit konsantrasyonuna göre (Şekil 4) belirtilmiştir, ve her bir oyuk başına 10 ul olarak Sıfır zamanında, tam bir ortamda SLNs seyreltik 96 oyuklu plakanın üzerindeki çukurların çoğaltırlar.
   4. Kuluçka süresi boyunca, 37 ° C'de,% 5 _CO2 hücreleri koruyun.
2. MTT Deneyi Toksisite
   1. SLNs inkübasyonu 24 saat sonra, üreticinin protokolüne uygun olarak, MTT deneyi kullanılarak hücre canlılığı belirler.
   2. Bir kez hücre yıkayın ve her bir oyuğa (100 ul / çukur) taze ortam ilave edin. Taze ortam ile değiştirmeden önce 10 dakika boyunca% 70'lik bir metanol çözeltisi içinde inkübe edilerek kontrol kuyuları öldürmek.
   3. Mikrolevhanın her çukuruna MTT ayıracı (oyuk başına 10 ul) ilave edin ve 37 ° C 'de O / N inkübe edin.
   4. O / N inkübasyondan sonra, üreticinin protokolüne göre elde edilen bir deterjan çözeltisi ile hücre içi formazin kristaller (oyuk başına 100 ul) çözünür.
   5. Oda sıcaklığında kuluçkalamadan 3 saat sonra, bir mikroplaka okuyucu kullanılarak 570 nm'lik bir dalga boyunda ölçülmesi absorbans değerlerini elde.
      Not: 3- (4,5-Dimetiltiazolil-2) -2, 5-difenil-tetrazolyum bromid (ağırlık / hacim)% 1'den daha az olmalıdır kullanılan MTT ayıracı.
3. Floresan Mikroskopi
   1. SLN olan fibroblastların uygulamayı takiben belirli bir zaman noktalarında, steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile iki kez yıkama fibroblastlar ve soğuk% 70 metanol ile 10 dakika boyunca sabitlemek.
   2. 10 dakika sonraBir grup geçiş (BP) 690/50 nm filtre seti kullanarak, ters bir mikroskop kullanılarak PBS ve yakalama görüntüleri ile metanol değiştirin.
4. Fare Kemik İliği Hücrelerinin Kültürü Dendritik
   1. Indükleyin fare kemik iliğinden elde edilen dendritik hücreler (BMDC) halinde, daha önce tarif edildiği ^23,24. Kısaca, yeniden birleştirici sıçangil granülosit-makrofaj koloni stimüle edici faktör (GM-CSF, 300 U / ml) ve rekombinant fare IL-4 ile 2 x 10 ⁶ / plaka 100 mm Petri tabaklarda C57BL / 10 kemik iliği levhası tek hücre süspansiyonları (B hücre faktörü, 200 U / ml uyarıcı). 3 günde ortamı değiştirmek.
   2. 7. günde, 37 ° C hücreleri 0,5 ve 5,0 ug / ml lipid nihai konsantrasyonda yemekleri NIR yüklü SLNs eklemek ve korumak, maruz kalma istenen uzunluğu için,% 5 _CO2 kuluçka makinesine kondu.
   3. Plakasının ayrıntılı yıkanır, 50 ml'lik bir tüp içinde toplanacak şekilde plakanın tüm ortamı aspire yemekler hücreleri toplamak (gevşek reklam çıkarmak için4 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) içeren fosfat tamponlu tuzlu su, 5 ml (PBS) herent hücreleri) içerir. Aynı 50 ml bir tüp içinde elde edilen hücre süspansiyonu toplanır.
5. Akım Sitometrisi aracılığıyla SLNs Kuruluş Değerlendirilmesi
   1. Alanına 2.4.3 'de elde edilen hücre süspansiyonu konsantrasyonunu belirlemek ve 12 mm x 75 mm yuvarlak tabanlı tüp içine FACS 3x10 ⁵ hücreleri dağıtın.
   2. 1 ml PBS ilave edilmesi ve daha sonra 4 ° C arasındaki bir sıcaklıkta, 400 x g'de 5 dakika boyunca santrifüje tabi tüpler hücreleri yıkayın.
   3. Süpernatant atılır ve anti-CD11c-FITC monoklonal antikoru (0.25 ug / ml nihai) ihtiva eden PBS / 2 mM EDTA /% 0.1 sığır serum albümini, 100 ul (BSA) (boyama tamponu) pelletini. Karanlıkta buz üzerinde 30 dakika süreyle inkübe edilir.
   4. 1 ml PBS ile hücreleri yıkanır ve daha sonra 4 ° C arasındaki bir sıcaklıkta, 400 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj tüpleri.
   5. Süpernatantı atın ve her tekrar süspansiyonlekeleme tampon maddesi içinde 400 ul pelet. Hücreler artık bir akış sitometresinin (muhtemelen mavi ve kırmızı lazer ile donatılmış) örneklerin edinimi için hazırız.
   6. Analiz yazılımı kullanılarak akış sitometrisi, CD11c + hücreleri (FITC pozitif) nüfusu üzerindeki yolluk ve (PerCP Cy5.5-veya APC kanalları olarak ölçülür) SLNs ilişkili floresans yoğunluğunu karşılaştırarak DC ile SLNs dahil edilme düzeyini değerlendirmek.

Sonuçlar

PIT yöntemi SLNs sentezlemek için kullanılmış ve faz tersinmesi sıcaklık bir su banyosu kullanılarak belirlenmiştir. Numuneler yavaş yavaş ısıtılır ve çözelti berrak göründü kadar yavaşça ajite edildi. Heneicosane lipid kullanılarak yapılan SLNs için faz tersinmesi sıcaklığı 45 ° C. Tablo 1 parçacık boyutuna, polidispersiteye, erime noktası ve SLNs erimeye latent ısı özetlemektedir. Yukarıda tarif edilen işlem koşulları kullanılarak sentezlenmiştir SLNs 18,59 ve 16,87 nm bir ortalama parçacık çapı 5.83 ...

Tartışma

Bu çalışmada, SLNs sentezi ve hücre içi uygulamalar için hedefleme uygulanabilirlikleri incelenmiştir. Bu biyouyumlu nanopartiküller ilaç dağıtımı, gen susturma ve aşı teknolojilerine ^25-30 olmak üzere birden fazla uygulama için dağıtım araçları olarak söz göstermiştir. Ultra küçük SLNs bir uyduruk işlemi kullanılarak sentezlendi ve primer deri hücreleri ve primer immün hücreleri ile etkileşimleri incelenmiştir. SLNs model terapötik kargo olarak görev yapan bir floresan boya (NIR), kapsüllenmesini ihtiva edec...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Nil Kırmızısı (NiR)	Sigma	19123	BioReagent, floresan için uygun, &ge için; % 98.0
Heneicosane	Aldrich	286052	% 98
Brij O10	Sigma	P6136	Brij 97, C18-1E10, Polioksietilen (10) oleil eter
Su	Sigma	W3500	Steril filtreli, BioReagent, hücre kültürü için uygun
Şırınga Filtresi 0.2 ve mikro; m Supor Membran Düşük Protein Bağlayıcı	Yaşam Bilimleri	PN4612	Pirojenik
Olmayan Nanotrac Ultra	Microtrac	seri numarası U1985IS	Enstrüman
Diferansiyel Taramalı Kalorimetre	Mettlet-Toledo		Instument
Birincil insan fibroblastları	Yaşam Teknolojileri	C-004-5C	Yenidoğan (HDFn)
Orta 106	Yaşam Teknolojileri	M-106-500	İnsan dermal fibroblastlarının kültürü için steril, sıvı bir ortam.
Düşük Serum Büyüme Takviyesi Kiti (LSGS Kiti)	Life	Technologies S-003-K	Komple LSGS
MTT Hücre Proliferasyon Test Kiti'nin	Trevigen	4890-025-K	Tetrazolyum tuzunun indirgenmesine dayalı hücre proliferasyonunun ölçümü için hassas kit, 3- [4,5-dimetiltiyazol-2-il] -2,5-difenil-tetrazolyum bromür (MTT)
Safire2 mikroplaka okuyucu	Tecan	----	Enstrüman
Fosfat tamponlu salin	Moleküler biyoloji için	Sigma	P5493
Rekombinant murin GM-CSF	Peprotech	315-03	>97%, SDS-PAGE ile indirgeme koşulları altında ve gümüş leke ile görselleştirilmiştir.
Rekombinant murin IL-4	Peprotech	214-14	>97%, SDS-PAGE ile indirgeme koşullarında ve gümüş leke ile görselleştirilmiştir.