Yöntem makalesi

Metabolik Analiz Mitokondriyal Zenginleştirilmiş Kesirler Hazırlanması

8.9K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/53149

⸱

30 Eylül 2015

 , 
1Biology Department, Adelphi University, 2Department of Ecology and Evolutionary Biology, Brown University

Bu makalede

Özet

Mitokondri, metabolizma ve homeostazın düzenlenmesinde merkezi rol oynar. Organizma fizyolojisini etkileyen mitokondriyal metabolizmadaki ince değişikliklerin tüm organizma metabolomik çalışmalarında tespit edilmesi zor olabilir. Burada, Drosophila melanogaster'deki ince metabolik değişimlerin tespitini geliştiren bir izolasyon yöntemini açıklıyoruz.

Özet

Mitokondri amino asit metabolizmasında, karbonhidrat metabolizmasında ve yağ asidi oksidasyonunda rol oynadığından, mitokondriyal fonksiyondaki kusurlar genellikle bu karmaşık hastalıklardan muzdarip olanların yaşamlarını tehlikeye atar. Mitokondriyal metabolik değişikliklerin saptanması, mitokondriyal bozuklukların ve farmakolojik ajanlara mitokondriyal yanıtların anlaşılması için hayati önem taşır. Mitokondriyal metabolizma metabolik düzenlemenin merkezinde yer almasına rağmen, mitokondriyal metabolizmadaki ince değişikliklerin tespiti, tüm organizma veya tüm doku ekstraksiyonları kullanılarak elde edilen diğer sitozolik metabolitlerin aşırı temsili ile engellenebilir.

Burada, Drosophila'da tam sinek ve mitokondriyal zenginleştirilmiş preparatlar arasında belirgin mitokondriyal metabolik değişiklikleri tespit eden bir izolasyon yöntemini açıklıyoruz. Bu yöntemin hassasiyetini göstermek için, genetik olarak çeşitli mitokondriyal DNA'ları (mtDNA) barındıran bir dizi Drosophila kullandık ve bunları rapamisin ilacına maruz bıraktık. Bu yöntemi kullanarak, rapamisinin mitokondriyal metabolizmayı mitokondriyal-genotipe bağlı bir şekilde değiştirdiğini gösterdik. Bununla birlikte, bu değişiklikler, metabolitlerin mitokondriyal zenginleştirilmiş fraksiyonlardan ekstrakte edildiği metabolomik çalışmalarda çok daha belirgindir. Buna karşılık, tüm doku ekstraktları, mtDNA'lardan bağımsız olarak sadece rapamisin ilacının aracılık ettiği metabolik değişiklikleri tespit etti.

Giriş

Bu prosedürün amacı, Drosophila melanogaster'in kullanılmasının metabolomiks çalışmalar için yeterli mitokondriyal metabolitleri elde zenginleştirilmiş mitokondriyal fraksiyonlar geliştirmektir. Bizim tecrübelerimize göre, tüm hücresel çıkarma yöntemlerini kullanarak metabolomik analiz Drosophila ince mitokondriyal metabolit değişikliklerini tespit edemiyoruz. Ancak önceki metabolomik analiz mitokondriyal fraksiyon mitokondriyal metabolit vardiya tanımlamak için hassasiyetini artırır.

Mitokondri hücreleri normal fonksiyon 1 için gereken enerjinin% 90 sağlanmasından sorumlu hücresel organellerdir. Son yıllarda bu mitokondrinin sadece adenozin trifosfat (ATP) üretmek daha hücresel ve organizma işlevi çok daha dinamik bir rol oynayabilir ve şimdi metabolik homeostazı 2,3 düzenlenmesi için hub olarak tanınan kabul edilmiştir. Mitokondri dis olan bir endosimbiyotik işleminin sonucudurTinct mikrobik soy 1,5 milyar yıl önce 4 ~ birleşti. Mitokondri gerçek organellere haline gibi, endosymbiont gelen genler ortaya çıkan nükleer genomu dahil edildi. 37 gen oksidatif fosforilasyon 5 enzim komplekslerinin alt birimleri olan mitokondriyal proteinleri kodlayan 13 olan mtDNA, kalırken hayvanlarda bugün yaklaşık 1.500 mitokondriyal proteinlerin, nükleer kodlanmış bulunmaktadır. Mitokondri ve nükleer bölmeleri arasında koordinasyon düzgün mitokondriyal fonksiyonunu korumak için gereklidir.

Burada açıklanan yöntemleri kullanarak mitokondriyal ve nükleer genomlarındaki arasındaki koordinasyon manipülasyon sonucu Drosophila mitokondriyal metabolik değişiklikleri tespit etmek mümkün. Biz hangi mtDNA D. kardeş türünden Drosophila bir yük kullanılan simulans tek D. yerleştirildi Nükleer arka plan 6 melanogaster. Bu "kesintiye 'mitonuclearGenotip D. 'doğal', ya da ko-evrimleşmiş mitonuclear genotip ile karşılaştırılmıştır kendi doğal D. ile aynı nükleer genomu taşıyan melanogaster mtDNA melanogaster. D. melanogaster ve D simulans mtDNAs 100 ~ tarafından amino asitler ve mitonuclear iletişim 7,8 etkileyen> 500 eşanlamlı değiştirmelerin farklıdır. Biz farmakolojik strese yanıt olarak metabolit vardiya çalışmak için tüm sinek özleri ve mitokondriyal zenginleştirilmiş özleri üretti. Burada mitokondrial zenginleştirilmiş kesirler kullanırken biz D. taşıyan yerli, eş-evrim genotip arasındaki mitokondriyal metabolitleri belirgin değişimler tespit olduğunu göstermektedir melanogaster mtDNAs ve D. taşıyan kesintiye genotip simulans mtDNA. Buna karşılık, bu iki genotipleri arasındaki metabolit değişiklikleri tüm sinek özü kullanan, normal yöntemlerle ince olur. Bu nedenle, bu yöntem mtDNAs mitokondriyal değişiklikler arabuluculuk nasıl anlamak için bir yol sağladıFarklı ilaçlara yanıt.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Reaktifler ve Çözümleri

  1. Sinek gıda ve medya hazırlanması
    1. Isı uçucu bileşenler 90 ° C 'ye ayarlanmış bir ocak su içinde ağırlık / hacim olarak% 0.79 agar% 11 şeker,% 2 otolize uğramış mayası,% 5.2 mısır unu. Homojen biraz yoğun karışım elde edilinceye kadar düzenli olarak karıştırın. Her bir yiyecek kalkan 5 ml ile 100 şişelerde bir toplam uçucu gıda 550 ml'lik bir nihai hacim hazırlayın.
    2. Isıtma cihazından çıkar Gıda aşağı 80 ° C'ye gelene kadar zaman karışması ve% 95 etanol,% 0.2 tegosept-metil 4-hidroksibenzoat ekleyin.
    3. Iki eşit hacimlerde gıda bölün. Diğer hacim etanol, 50 mM bir hacme kadar etanol rapamisinin 1,1 ml 1,1 ml ilave edilir. Rapamisini ve gıda içine etanol çözümleri karıştırın. Sıcaklık ilaçlar eklemeden önce 50 ° C'ye düşer emin olun.
  2. İzolasyon Tampon
    1. İzolasyon Tamponu [225 mM Mannitol, 75 mM sakaroz, 10 mM 3- (N <500 ml hazırlayın/ em> morfolino) propansülfonik asit (MOPS) ve 1 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA), 2.5 mg / ml sığır serumu albümini (BSA)] su içinde.
    2. Sodyum hidroksit kullanarak pH'ı 7.2'ye ayarlayın. Başlangıç ​​pH'ı asidik olacaktır.
    3. Solüsyonu sterilize etmek ve 4 ° C de saklamak için 0.22 um gözenek boyutuna sahip olan steril filtre depolama şişeler kullanın.
  3. Yıkama Tamponu
    1. Yıkama tampon maddesi [225 mM Mannitol, 75 mM sakaroz, 10 mM KCI, 10 mM Tris HCI ve 5 mM KH 2 PO 4] su içinde 500 ml hazırlayın.
    2. Sodyum hidroksit kullanarak pH'ı 7.2'ye ayarlayın. Başlangıç ​​pH'ı asidik olacaktır.
    3. Solüsyonu sterilize etmek ve 4 ° C de saklamak için 0.22 um gözenek boyutuna sahip olan steril filtre depolama şişeler kullanın.

Drosophila SUŞLARINDA 2. Yetiştirme

  1. , Gelişim sırasında larva yoğunluğu kontrol bir kültür şişe ebeveynlerin 25 çift yerleştirmek ve onları 48 saat boyunca yumurtalarını bırakmak için izin vermek için.
  2. Yumurta yoğunluğunu düzenlemek için 48 saat sonra anne çıkarın.
  3. Yineleyin ortaya çıkan F1 yavru kullanarak 2.1 ve 2.2 adımları, bu nedenle bu yoğunluk kontrolü iki kuşak elde edilir.
  4. Yetişkin toplamak için, karbondioksit (CO2) ve cinsiyete göre ayrı kullanarak sinekler uyutmak.
    1. 5 psi sürekli bir akış bir yüksek basınçlı tanktan teslim saf CO 2 tek aşamalı regülatör kullanın. Statik elektriği önlemek için, su ile balonun filtreleme 500 ml CO 2 katalize etmek için plastik boru kullanılır.
    2. Şişeyi kapatmak için tek delikle bir lastik tıpa kullanın. CO2 pede şişenin yanal açıklığı bağlamak için plastik boru kullanın.
    3. 10-15 dk daha fazlası için ped sinek yerleştirin. Deneysel koşullar koymadan önce 24 saat anestezi kurtarmak için izin verin.
  5. Mitokondriyal zenginleştirilmiş kesirler için yeterli metabolitleri oluşturmak numune başına 300 sinekler kullanın. Burada, kadın kullanın, ancak gender, diğer deneylerde farklı olabilir. Bir ev yapımı 1 L demografi kafesine 150 sinekler aktarın. Bir şişe içinde uçucu gıda 5 ml erişimine izin verir.
  6. Başka bir 1 L kafesine geri kalan 150 sinekler aktarın. 150'den fazla sinekler kafeslere overpopulate etmeyin.
  7. Deneysel koşul başına altı çoğaltma örnekleri kullanın. Bütün hayvan ekstreleri fazla metabolitleri verim yana, bütün hayvan 1 örnek izolatlarının oluşturmak 50 kadın, bir kafes uçar aktarmak için. Mitokondriyal izolatların gelince, deneysel koşul başına altı çoğaltma örnekleri kullanın.
  8. 12 saat ışık ve 12 saat karanlık çevrimi ile 25 ° C 'de yer kafesleri.
  9. Gıda kalitesini korumak için gıda 5 ml bir şişe içinde her 2 ya da 3 gün taze yiyecek sağlamak.
  10. 10 gün boyunca gıda sinekler koruyun. Bu adım, rapamisin tedavisi 7 için gereklidir. Diğer tedaviler veya şartlar farklı olacaktır.

Mitokondriyal Kesirler 3. İzolasyonu

  1. Damperli bir içine bir kafes (150 sinekler) çıkışlı uçarCam-Teflon Dounce homojenleştirici soğutulmuş yalıtım 1 ml tampon ile doldurulmuştur.
  2. Aşağı 15 vuruş için havaneli yukarı ve hareket ettirerek homojenleştirin. Sağlam mitokondri tutmak için buz üzerinde harç tutmak.
  3. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de, 1.5 ml tüp ve santrifüj transfer homojenat.
  4. Mitokondri için zenginleştirmek için 4 ° C'de 10 dakika boyunca 6000 x g'de santrifüj süpernatan ve al.
  5. Süpernatant sitozolik fraksiyonu içerdiğinden, süpernatant atın veya alternatif deneyler için kullanabilirsiniz. Yıkama tamponu 300 ul pelletini.
  6. İkinci kafes için 3,5 - 3,1 tekrarlayın adımları. Bir kriyojenik mikrosantrifüj tüpü içinde yeniden süspansiyon haline getirilmiş, her iki kafesleri pelet birleştirin.
  7. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 6000 x g'de santrifüjleyin.
  8. Süpernatantı atın ve sıvı azot içinde pelet flash dondurma.
  9. -80 ° C veya daha düşük bir sıcaklıkta mitokondriyal zenginleştirilmiş kısımlar saklayın.
    1. Alternatif olarak, bütün hayvan öncesi içinTerkip, bir kriyojenik mikrosantrifüj tüp içinde yetişkin yerleştirin. C veya daha düşük sıcaklıkta -80 ° sıvı azot ve mağaza erişkinlerde şişeyi Flash dondurma.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Protokol Yukarıda açıklandığı kullanarak, farklı mtDNAs 7 rapamisin ilacın etkisini test etmek için, mitokondriyal zenginleştirilmiş fraksiyonları ve bütün hayvansal özler üzerine metabolomic analizi yapıldı. Biz sinek gıda ilaç çözerek rapamisinin 200 mcM teslim etti. Sinekler için 10 gün rapamisin maruz bırakılmıştır. Bütün uçucu ekstrelerinden ve mitokondriyal ekstrelerinden metabolitleri standart çözücü çıkarma yöntemleri kullanarak gaz kromatografisiyle kütle spektro...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu protokolde en kritik adımlar şunlardır: 1) bol uzayda yeterli sinekler yetiştirme. 150'den fazla sinekler her biri demografi kafesleri overpopulate değil çok önemlidir; 2) sık sık gıda rekabeti ve beslenme stresi önlemek için kafes gıda değişen; ve 3), 4 ° C 'de, tüm numuneler muhafaza mitokondriyal fraksiyonunun izolasyonu sırasında bütünlüğünü sağlamak için. Ayrıca yalıtım tamponu, yıkama tamponu ve kullanımdan önce kullanılan cam teflon homojenleştirici soğuk Dounce tavsiye edilir. Zenginleştirilmiş mitoko...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Bu çalışma, Adelphi Üniversitesi fakülte geliştirme hibesi ve EVC'ye verilen NIGMS'den hibe R15GM113156, NIGMS'den hibe R01GM067862 ve DMR'ye verilen NIA'dan hibe R01AG027849 tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 0.2 tegosept-metil 4-hidroksibenzoatVWRAAA14289
EtanolSigma-Aldrich792799
MannitolSigma-AldrichM4125
SükrozSigma-AldrichS9378
3- ( N < / em >-morfolino) propansülfonik asit (MOPS)Sigma-AldrichM1254 ve nbsp;
Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)Sigma-Aldrich38057 
Sığır serum albümini (BSA)Sigma-Aldrich5470
KClSigma-AldrichP9333
Tris HClSigma-AldrichRES3098T-B7
KH2< / sub>PO 4< / sub>Sigma-Aldrich1551139
sinekleri uyuşturmak için CO2< / sub> pedleriTritech AraştırmaMINJ-DROS-FP
1 L kafesWeb Restoran Mağazası999RD32
1 L kafes kapağıWeb Restoran Mağazası999LRD
bir cam-teflon dounce homojenizatör Fisher ScientificNC9661231
Sodyum hidroksitSigma-AldrichS8045
rapamisin ve nbsp;LC Laboratuvarları R-5000
anti-porinMitoSciencesMSA03
anti-alfa tübülinGelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası12G10
Pierce BCA Protein Test Kiti  Termo Bilimsel 23225
CO2 pedTritech Research, IncMINJ-DROS-FP
filtre şişesienascoSB08184M
kauçuk tıpaenascoS08512M

Kaynaklar

  1. Scheffler, I. E. Mitochondria (Scheffler, Mitochondria). , Wiley-Liss. 484(2007).
  2. Guarente, L. Mitochondria--a nexus for aging, calorie restriction, and sirtuins. Cell. 132 (2), 171-176 (2008).
  3. Raimundo, N. Mitochondrial pathology: stress signals from the energy factory. Trends in molecular medicine. 20 (5), 282-292 (2014).
  4. Embley, T. M., Martin, W. Eukaryotic evolution, changes and challenges. Nature. 440 (7084), 623-630 (2006).
  5. Lane, N., , Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the Meaning of Life. 368, Oxford University Press. USA. (2006).
  6. Montooth, K. L., Meiklejohn, C. D., Abt, D. N., Rand, D. M. Mitochondrial-nuclear epistasis affects fitness within species but does not contribute to fixed incompatibilities between species of Drosophila. Evolution; international journal of organic evolution. 64 (12), 3364-3379 (2010).
  7. Villa-Cuesta, E., Holmbeck, M. A., Rand, D. M. Rapamycin increases mitochondrial efficiency by mtDNA-dependent reprogramming of mitochondrial metabolism in Drosophila. Journal of cell science. 127 (Pt 10), 2282-2290 (2014).
  8. Zhu, C. -T., Ingelmo, P., Rand, D. M. G×G×E for Lifespan in Drosophila: Mitochondrial, Nuclear, and Dietary Interactions that Modify Longevity. PLoS genetics. 10 (5), e1004354(2014).
  9. Madala, N. E., Piater, L. A., Steenkamp, P. A., Dubery, I. A. Multivariate statistical models of metabolomic data reveals different metabolite distribution patterns in isonitrosoacetophenone-elicited Nicotiana tabacum and Sorghum bicolor cells. SpringerPlus. 3, 254(2014).
  10. Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. Cytochemical Studies Of Mammalian Tissues I . Isolation Of Intact Mitochondria From Rat Liver Some Biochemical Properties Of Mitochondria And Submicroscopic Particulate Material. Journal of Biological Chemistry. 172, 619-635 (1948).
  11. Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nature protocols. 2 (2), 287-295 (2007).
  12. Corcelli, A., Saponetti, M. S., et al. Mitochondria isolated in nearly isotonic KCl buffer: focus on cardiolipin and organelle morphology. Biochimica et biophysica acta. 1798 (3), 681-687 (2010).
  13. Roede, J. R., Park, Y., Li, S., Strobel, F. H., Jones, D. P. Detailed mitochondrial phenotyping by high resolution metabolomics. PloS one. 7 (3), e33020(2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Drosophila Metabolomi iDiferansiyel Santrif jlemeMitokondri zolasyonuRapamisin UygulamasT m Sinek EkstraktMitokondriyal DNAProtein Zenginle tirmeMetabolit Profillendirme

İlgili makaleler