Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Toplam Lignin, lignin Monomer ve enzimatik Şeker Yayın: Lignocellulosic Biyokütle rekalsitrantların Varyasyonları yüksek verimlilik Taraması

9.7K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/53163

⸱

15 Eylül 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1BioEnergy Science Center, National Renewable Energy Laboratory

Bu makalede

Özet

Bitki hücre duvarı yapısı ve kimyası özellikleri, biyoyakıtlar ve biyo-malzemeler için ideal hammaddeleri belirlemek için değerlendirilir. Standart yöntemlerin büyük veri kümelerine uygulandığında sınırlamaları vardır. Bu yüksek verimli ön arıtma, enzim sakarifikasyonu ve piroliz-moleküler ışın kütle spektrometresi yöntemleri, çok sayıda biyokütle örneğini düşük deney süresi ve maliyeti ile karşılaştırır.

Özet

Lignoselülozik biyokütlenin yakıtlara, kimyasallara ve diğer emtialara dönüştürülmesi, yenilenemeyen enerji kaynaklarının kullanımında azalmaya yönelik olası bir yol olarak araştırılmıştır. Farklı bir havuzdan hangi bitkilerin aşağı akış uygulamaları için istenen kimyasal özelliklere sahip olduğunu belirlemek için, selüloz ve lignin içeriği veya enzimatik bir sakrifikasyonu takiben monomerik şeker salınımı gibi özellikler karşılaştırılmalıdır. Standart analiz yöntemlerinin deneysel ve veri analizi protokolleri zaman alıcı olabilir, bu nedenle ölçülebilecek numune sayısını sınırlar. Yüksek verimli (HTP) yöntemler, standart yöntemlerin eksikliklerini hafifletir ve istenen özelliklere sahip olanları izole etmek için mevcut numunelerin hızlı bir şekilde taranmasına izin verir. Bu çalışma, Ulusal Yenilenebilir Enerji Laboratuvarı'nda kullanılan HTP şeker salınımı ve piroliz-moleküler ışın kütle spektrometresi boru hatlarını göstermektedir. Bu boru hatları, binlerce tesisin verimli bir şekilde değerlendirilmesini sağlarken, işçilik ve sarf malzemelerindeki azalmalar yoluyla deney süresini ve maliyetlerini azalttı.

Giriş

Olmayan yenilenebilir yakıtlar ve bunlarla ilgili ürünlerin düşüşler küresel kaynağı olarak, bilim adamları bitki kökenli kaynaklardan 1 benzer yakıtlar ve kimyasallar oluşturmak için meydan oylandı. Bu çalışmanın önemli bir yönü, bitki türleri biyoyakıt ve biyomalzeme 2,3 üretilmesi için uygun olabilecek belirlemektir. Tipik olarak, bu besleme stokları lignin, selüloz ve hemiselüloz içeriği için değerlendirilir; ile de veya sonradan enzim sakarifikasyon olmadan, termal, mekanik ve / veya kimyasal ön yoluyla yapısızlaştırma (rekalsitrantların) kendi duyarlılık olarak. Daha detaylı bir analizi gerekiyordu lignin ve yarı selüloz parçacığına spesifik bileşim olarak uygun enzim aktivitelerini belirlemek için kullanılır. Özünde istenilen emtia biyokimyasal veya termokimyasal dönüşüm için ideal özelliklere sahip olmayan bitkilerin transgenik değişiklikler pot bir ölçüde genişletilmiş kaynağı ile araştırmacıların sağladıential hammaddeler 4. Küçük bir numune kümesi için oldukça yararlı ise, bir bitkinin kimyasal özelliklerini ölçülmesi için standart analitik metotlar, örnekler 5-7 yüzlerce ya da binlerce süratle taranması için uygun değildir. Burada tarif edilen yöntemler, HTP hızlı ve verimli bir termokimyasal ve / veya enzimatik degradasyona hücre duvarı rekalsitrantların değişiklikler için biyokütle varyantlarının çok sayıda değerlendirmek için geliştirilmiştir.

Bu HTP tarama deneyleri burada tarif edilen dönüşüm ya da verim en üst düzeye çıkarmak için tasarlanmış değil anlamak için önemlidir. Amaç, ilgili biyokütle örneklerinin içsel rekalsitrantların nispi farklılıkları belirlemektir. Bunun bir sonucu olarak, analiz adımları birçok amacı, maksimum dönüşüm hızını veya derecesini elde etmek için bir "tipik" biyokütle dönüşüm deneylerinde, farklıdır. Örneğin, daha düşük ön-muamele şiddeti ve daha kısa enzim hidrolizinden kat farklılık en üst düzeye çıkarmak için kullanılırörnekler arasında daha olgun. Pek çok durumda, nispeten yüksek enzim yükler önemli ölçüde sonuçlan saptıracaktır olabilir enzim etkinliği deneysel varyasyon, bağlı farkları azaltmak için kullanılır.

Bitki hücre duvarlarına ve monomerik şekerlerin bileşimin belirlenmesi için hızlı teknikler enzimatik sakarifikasyon kızıl ötesi gibi titreşim spektroskopisi gibi robotik, özel, termo kimyasal uyumludur, 96 gözlü levhalar, ve standart laboratuar yöntemleri 8-11 arasında modifikasyon ve enstrümantal protokolleri (şunlardır açığa çıkan (IR), yakın kızıl ötesi (NIR) ya da Raman) ve nükleer manyetik rezonans (NMR), 12-17. Bu metodolojiler, deneysel azalmalara neden yüksek selüloz veya düşük lignin içeriğinin, ya da en yüksek glikoz, ksiloz, etanol vermesi beklenen olanlar, vb Bu yöntemler biyokütle ve sarf küçük miktarlarda istihdam downscaled analizler sağlamıştır ile hammaddeleri izole anahtarıdır Gider 18 yedekleyin. Bu yöntem yaklaşımın diğer bir özelliği, çeşitli deneysel koşullar hızlı olabilir ve aynı zamanda bazı durumlarda değerlendirilmiştir. Örneğin, ön-muamele stratejileri veya enzim kokteyl, farklı çeşitli en uygun deney parametreleri hızla tespit kullanılabilir sağlayan test edilebilir. Örneğin, mısır koçanından 9, kavak 8,10, şeker kamışı küspe 8 ve switchgrass 8 gibi popüler besleme stokları, başarılı bir şekilde, bu HTP yöntemler kullanılarak değerlendirilmiştir.

Toplam lignin ve lignin monomerik kompozisyon da yaygın biyokütle özellikleri ölçülür. Lignin içeriğindeki azalmalar polisakkaritler 19,20 enzimatik sindirilme artırmak için gösterilmiştir. Lignin monomerik oranı (genellikle syringly / guaiacyl (S / G) içerik olarak rapor) bu rolü soruşturma altında hala bitki hücre duvarının yıkılmasında oynar. Bazı raporlar belirttiler S / G azalmalardiğer çalışmalar zıt eğilim 19,22 açıklayacak ederken oranı hidroliz 21 aşağıdaki artan glikoz verimi yol açtı. Lignin ve monomerleri değerlendirmek için yüksek kapasiteli yöntemleri titreşim çok değişkenli analiz ile birleştiğinde spektroskopisi (IR, NIR ve Raman 23-26) ve piroliz moleküler ışın kütle spektrometresi (pyMBMS) 27,28 sayılabilir.

Biyokütle taranması için HTP yöntemleri geliştirirken, birkaç ayrılmaz hususlar göz önünde tutulması gerekir. Bir önemli yönü yönteminin karmaşıklığı olduğunu. Teknik için gerekli beceri düzeyi nedir? Kemometrik analizler, örneğin, inşa değerlendirilmesi ve tahmini modeller korumak için özel beceriler gerektirir. Standart yöntemler istenmeyen hazırlayıcı veya veri analiz adımları sergilemek veya zehirli reaktifler kullanır. Modellerin geliştirilmesi, yeni veri modelin sağlamlığı artırmak için zamanla modele dahil edilmiştir devam eden bir süreçtir. Başka bir consideration maliyet tasarrufu ve önerilen yüksek verimlilik yöntemlerinin deneysel analiz sürelerini azalmıştır. Yöntem oldukça hızlı, ancak oldukça maliyetli ise, çok sayıda laboratuar kabul etmek için uygulanabilir bir teknik olabilir. Bu yazıda gösterildiği yöntemler verim özelliklerini güçlendirmek için modifiye standart teknikler türevleridir. Bu protokoller nicel öngörü modellerinin geliştirilmesi gerektirmeden ilgi biyokütle özelliklerini ölçmek. Standart modelleri geliştirmek için kullanılan analizleri ile güçlü bir korelasyon sergilerken Bu öngörü yöntemleri beri bu tekniklerin önemli bir nitelik olduğunu, aslında numunelerde ilgi miktarını ölçmek gibi doğru değildir. Esasen standart tezgah ölçekli analitik yöntemlerin sürümleri küçülttüm Kullanılan yöntemler ise doğruluk ve hassasiyet hız ve performans için işlem görmektedir. Çoğunlukla, bu sonucun küçük hacimli pipetleme ve tartı yüksek hatalar nedeniyle; ve artan sörneklem büyüklüğü olarak geniş heterojenite azalır. Büyük örnek setleri ekranlı ve mukayese edilebilir olsa ayrı kampanyalar arasında ve tezgah ölçekli sonuçlarına karşılaştırmalar yaparken, büyük bir özenle olunmalıdır.

En zaman alıcı adımlar biyokütle fiziksel manipülasyon içerir. Taşlama örnekler örnekler arasındaki değirmen temizleme dahil numune başına birkaç dakika sürebilir. Elle, boşaltma ve temizleme bunker yükleme ve doldurma ve çay poşetleri ve örnek çanta boşaltma da çok emek yoğundur. Her adım bir dakika veya daha fazla sürebilir iken, numunelerin yapıyor binlerce birçok saatler hatta günler sürebilir. Robotlar yaklaşık 3 ila 4 saat veya 6 -1 tabak gün 8 robot biyokütle ile tipik bir reaktör plakasını yükleyebilirsiniz -1. Bu durum, aynı zamanda, test edilecek Çeşidi ve biyokütle miktarı olarak kullanılan hassas parametrelere bağlıdır. Reaktörü su plakaları Benzin, seyreltik asit veya enzim hızlı bir sıvı kotarma robotu kullanılarak yapılır. PBir plaka yığıtı (1 20 reaktör plakalar) için yeniden tedavi tertibatı, soğuma sırasında 1 ila 3 saat sürer, ve demontaj dahildir. Enzim hidroliz 3 gün sürer ve şeker analiz sonuçları tahlil tamamlamak ve okumak için hazırlık süresi yaklaşık 1 saat artı reaktör plaka başına 10 dakika gerektirir. Set Tedavi öncesi ve analiz gün bir haftalık program sürekli olarak haftada ~ 800 1000 örnekleri tahlil insan bileşeni için tek saat ve hafta sonu çabalarını en aza indirerek, makul bir çalışma programı barındırır ve işlenmesi için izin verir. Maksimum verim çok donanım (robotlar, reaktörler tabak, vb) ve ne kadar "yazılım" (yani, personel) el işi yapmak için kullanılabilir başta nasıl birçok faktöre bağlıdır. Pratik üst sınır 2500 3.000 örnekleri / hafta; Ancak, çıkış 7 gün-bir hafta çalışma ve çok sayıda öğrenci stajyerleri ve teknisyenleri gerektirir. Buna karşılık, HPLC ile 3000 örnekleri sam yaklaşık 125 gün gerektirecektirple analizi artı elle analizden önce reaktörler ve filtreleme numuneleri içine örnekleri tartı ek emek.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Glikoz ve Ksiloz Verimi 1. Yüksek verim tayini enzimatik sakarifikasyon 9,29 takiben

  1. Numune Hazırlama (De-Tutkal, Taşlama, Ekstraksiyon, Ön İşlem)
    1. Wiley değirmen, bu parçacıklar, bir 20 ağ üzerinden geçmesi (850 um) elek kullanılarak her bir biyokütle, örneğin, en az 300 mg öğütün. Anti-statik fermuarlı üst torba transfer (tipik bar kodlu) ve barkod veritabanına kayıt örneği bilgileri.
    2. Dikkatle, çay-bag (mürekkep veya işaretleyici kullanmayın, kalemle) önlemek için biyokütle üzerinde uçlarını katlamak için emin olmak, Sallama çaylar sıvayıp bir numaralı yaklaşık 250 mg ya da anti-statik torbasından zemin biyokütle daha ekleyin de-starching ve ekstraksiyon sırasında kayıp.
    3. Kalay kaplı bakır tel kullanılarak kapalı teabag sarın. Her barkodlu numune için teabag numarasını kaydedin.
    4. Ticari enzimlerin (tipik haliyle,% 0.25 (v / v) glukoamilazını (~ 1600 AGU / L) 'den de-kolalama enzim çözeltisi hazırlayın% 1.5 (v / v) alfa-amilaz, 0.1 M sodyum asetat (~ 2900 KNU-S / L) (pH 5,0)). Toplu biyokütle gramı başına 16 ml veya 120 çay poşeti örnekleri başına 500 ml hazırlayın. Not: Zemin biyokütleden nişasta çıkarma yeteneğine sahip bir enzim yüklemeler yüklemeleri ve oranlar bir dizi ile sindirmeden sonra nişasta için test ampirik bir şekilde tespit edilmelidir.
    5. Plastik bir kap içinde, dökme zemin biyokütle 1 gramı başına de-kolalama enzim çözeltisi 16 ml ekleyin. Bir parti de-Tutkal protokolü için, tampon, enzim çözeltisi, 500 ml 120 teabags ekleyin.
    6. Mümkün olan nişastayı atmak üzere 120 rpm'de, 24 (± 4) saat 55 ° C'de bir çalkalayıcı içinde inkübe edin.
    7. De-kolalama inkübasyondan sonra, durulama ve 30 dakika için deiyonize su birkaç litre biyokütle ıslatın. Kaskad Sıcak sıvı etanol neden çözelti seviyesinde bir ani ve şiddetli bir artışa neden olabilir çözelti içinde gaz kabarcıklarının darbeleme (oluşumuna neden olabilir buffer tuzlarını yok etmek bu işlemi iki kez daha tekrarlayınekstraksiyon sırasında reaksiyona damar) üzerinden.
    8. De-kolalı biyokütle ayrıntılı durulama ardından, çıkarılması için Soxhlet sütuna teabags yerleştirin. Resim yüksük Bu aşama için gereklidir.
    9. % 95 etanol kullanılarak, Soxhlet reflü kurmak ve 24 saat için örnekler ayıklayın.
    10. Soxhlet reaktörden Sallama çaylar çıkarın ve düz tepsi üzerinde tek kat olarak yayılır.
    11. Numuneler, bir çeker ocak içinde, bir gece boyunca oda sıcaklığında kurumaya bırakın.
    12. Sallama çaylar önüne sermek ve orijinal barkodlu anti-statik poşetler kurutulmuş biyokütle dönün.
      Not: anti-statik poşetler kullanım özellikleri, biyokütle statik elektriği azaltarak geliştirmeyi etkilidir. Diğer depolama seçeneği kullanıldığı, ek biyokütle nedeniyle depolama kabı kenarına biyokütle yapışan için gerekli olabilir.
    13. Barkodlu hazneye kurutulmuş biyokütle en az 50 mg aktarın (daha fazla malzeme kullanarak doğru karışması için iyidir). Santi-statik çanta ve alıcı huninin barkod doğru örnek izleme sağlamak için olabilir.
    14. Katı rafları örneklerin sipariş yakından ilgilenerek, robot tartı üzerine yük hazneleri. Kullanılan plakaların sayısına dayalı dağıtım protokolü, tüm örnekleri içeren ve seçmek için yeterli reaktör plakaları yükleyin.
    15. Robotik aside dayanıklı paslanmaz çelik 96 oyuklu plakalar içerisine (± 0.3 mg) kurutulmuş örneklerin 5 mg ağırlığında. Herhangi bir yerelleştirilmiş varyasyonları en aza indirmek için plaka etrafında dağıtılan her numunenin 3 çoğaltır tartın.
    16. Tahlil performansını izlemek için iyi karakterize biyokütle standart malzeme 8 kontrol biyokütle örnekleri ekleyin. Birden plakalar için, birden fazla standart biyokütle silosu kullanılması tekrarlanan dağıtım döngüleri boyunca haznede eleme kaynaklanan partikül büyüklüğü kayması en aza indirecektir.
      Not: her bir plaka olarak, 3 kez tekrarlanmış, iyonu giderilmiş su ve enzim içeren 4 boşlukları ve 8 contro 24 numune olmalıdırls, daha önce karakterize standart biyokütle kullanarak. Plaka 4 köşe, her 3 köşe kuyuları şeker standartları için ayrılmıştır.
    17. Serseri biyokütle parçacıkları için boş ve şeker standart kuyu kontrol edin ve varsa çıkartın.
    18. Her bir oyuğa iyonu giderilmiş su, 250 ul ekleyin ve silikon yapışkan sırtlı, politetrafloroetilen (PTFE) bant ile plakaları mühür.
    19. 1/8 "havya ucu kullanarak, her plaka için her buhar portu (117 toplam) PTFE bandı delmek. Bir kılavuz olarak kapalı reaktör plaka üzerinde yığılmış boş bir levha kullanın ve PTFE filmi hareketini kısıtlamak için.
    20. Sıkıca üst ve yığının altındaki plaka ve boş levha arasına 0.031 "kalınlığında cam takviyeli PTFE contaları (buhar portlar için delikli önceden delinmiş) ile plakaları Kelepçe. 17.5 dakikada, veya arzu edilen şiddetine bağlı olarak diğer sıcaklık / zaman kombinasyonları için 180 ° C olarak ayarlandı buhar reaktörü kullanılarak numuneleri önceden işleme.
    21. 50 ° 'ye serin reaktör plakalarıC deiyonize su ile sel.
  2. Enzimatik Saccharification
    1. 1.0 M sodyum sitrat, pH 5.0,% 8 (h / h) bir enzim çözeltisi içeren bir enzimatik sakarifikasyon çözelti hazırlayın. Reaktör plaka başına 5 ml hazırlayın. Not: belirli bir stok enzim çözeltisinin etkinliği ve protein içeriğine göre belirlenmelidir gerekli seyreltme.
    2. Plakalar serin olduğunda, 20 dakika boyunca 1500 xg sallanan bir kova rotor onları santrifüj. Filmi sızdırmazlık çıkarın. Not: Bu plakalar ağır ve santrifüj özellikleri uyumluluk için kontrol edilmelidir.
    3. Her bir oyuğa (g biyokütle başına 70 mg enzim)% 8 enzim stok çözeltisi, 40 ul ekle.
    4. Yeni PTFE bandı ile kapatın. Manyetik plaka kelepçe içine kapalı plaka koyun.
    5. Yavaşça ters çevirerek örnekleri (en az 15 kez) karıştırın ve 70 saat süre ile 50 ° C'de inkübe edin.
    6. Sakarifikasyon sonucuna zaman çevirerek karıştırın ve 1500 x plakaları santrifüj20 dakika boyunca örn.
  3. Şeker Deneyi
    1. 6 glikoz ve 0,014 M sitrat tampon maddesi içinde ksiloz Birleştirilen kalibrasyon standartları 0 ila 0,750 mg / ml arasında değişen (pH 5.0) 'in bir dizi hazırlanması (0, 0.2, 0.3, 0.45, 0.65 ve 0.75 mg / ml tavsiye edilir) ve 0-0,600 mg / ml (0, 0.1, 0.2, 0.35, mi önerilen 0,45 ve 0,6 mg /), sırasıyla glukoz ve ksiloz için.
    2. Kit talimatlara göre glikoz oksidaz / peroksidaz (Gopod) ve ksiloz dehidrogenaz (XDH) reaktifler hazırlayın.
    3. Bir pipet kullanarak, reaktör levhanın köşe oyuklara (12, toplam kuyu) bitişik 4 köşe kuyuları ve kenar kuyulardan sıvının 200 ul çıkarın.
    4. Bir pipet kullanarak, 96 çukurlu bir polistiren düz tabanlı seyreltme plakası, her sıra için deiyonize su, 180 ul dağıtmak. 12 şeker standart ve köşe kuyu suyu katmayın (96 kanal kafasını kullanıyorsanız bu ipuçlarını kaldırın).
    5. Bir pipet kullanarak, pl glükoz tahlil her oyuğuna 180 ul Gopod reaktif dağıtımyedi.
    6. Bir pipet kullanarak, ksiloz deney plakasının her oyuğuna 180 ul XDH reaktif dağıtın.
    7. Bir pipet kullanarak, seyreltme plaka 96 oyuklu plaka reaktörü 20 ul alikotları hidrolizat aktarın. Kuyular üst bölümünden Pipet biyokütle katı ve köşe kuyularda kalan sıvıyı önlemek için. En az 10 döngü ezilerek karıştırılır.
    8. Bir pipet kullanarak, Seyreltme levhası köşe gözlere, iki kopya halinde, şeker standartları 110 ul transfer.
    9. Bir pipet kullanarak, glikoz ve iksiloz gibi deney plakası seyreltme plakasından 20 ul alikotları aktarın. Ezilerek karıştırılır.
    10. 30 dakika için oda sıcaklığında glukoz ve ksiloz deney inkübe edin. Dikkatle okumadan önce herhangi bir yüzey kabarcıkları kırmak. Kısaca plaka yüzeyinden devamlı olarak geçirilmesi bir ısı tabancası ile iyi çalışır.
    11. Bir morötesi / görünen 96 oyuklu bir plaka okuyucusu kullanılarak, 510 nm'lik dalga boyunda ölçülen ayarlamak ve reaktif boşluğa karşı absorbans kaydedin.Bu ölçüm, glükoz konsantrasyonuna orantılıdır quinonimine oluşumunu takip eder. Glukoz konsantrasyonu 1.3.1 hazırlanan kalibrasyon standartları göre kalibrasyon eğrisinden hesaplanmıştır.
    12. Bir morötesi / görünen 96 oyuklu bir plaka okuyucusu kullanılarak, 340 nm'lik bir dalga boyuna ayarlanır ölçülen absorbansı kaydedin. Bu ölçüm, ksiloz konsantrasyonu ile orantılıdır NADH NAD + 'azalma izler. Ksiloz konsantrasyonu, 1.3.1 hazırlanan kalibrasyon standartları göre kalibrasyon eğrisinden hesaplanmıştır.

PyMBMS 28 Kullanma Toplam Lignin ve Lignin Monomerik İçeriğin 2. Yüksek verim tayini

  1. Örnek hazırlama
    1. Öğütün ve adımları 1.1.1 ve 1.1.6-1.1.8 tarif edilen metotlar kullanılarak biyokütle ekstrakte edin. Bu taşlama ve deney denetimlerini kullanmak için standartların bir dizi ayıklanan içerir.
      Not: pyMBMS kuvEMENTS olmayan partikül boyutu bağlıdır, bu yüzden sadece pyMBMS protokolü kullanılarak, eğer, biyokütle hazırlama örneği <, numune tutucuya 4 mm uyacak izin vermek üzere yürütülmelidir.
    2. Yaklaşık 4 mg, küçük bir spatula bir dağıtıcı kullanılarak otomatik numune için tasarlanmış bir 80 ul paslanmaz çelik kabına hazırlanmış biyokütle (3 ila 5 mg tercih).
    3. Analiz edilen örneklerin en az% 10 gibi Standartlar ve Teknoloji Ulusal Enstitüsü edinilebilir gibi kontrol standartları olduğundan emin olun (şeker kamışı küspe-8491; kavak-8492; çam-8493; ya buğday samanı-8494). Standart, daha önce, standart yöntemler kullanılarak karakterize edilmiştir Analiz edilecek numuneler benzer olan herhangi bir tür olabilir.
    4. Rasgele nedeniyle zamanla olası spektrometre sürüklenme önyargıyı engellemek için cımbız kullanarak otomatik numune bardak içine numuneleri yükleyin. Not: Örneklerin Tipik randomizasyon yeniden rasgele ardından bir kez tüm örneklerde ölçümünü içerirYinelenen bir ölçüm için numune düzenin. Randomizasyon programları online olarak mevcuttur.
    5. Standart bir delik yumruk kullanarak, el hiçbir bağlayıcı, Tip A / D cam elyaf levhalar cam filtre diskleri üretirler. , Cımbız ile yuvarlak cam elyaf filtre tutun numune kabının üzerine ortalamak ve deney süresince her fincan malzemeyi sınırlandırmak için 3,5 mm'lik Allen anahtarı kullanarak numune içine itin.
  2. Enstrümantal Protokol
    1. Deney örnekleri için mevcut olabilir bileşiklerin bütün aralığı boyunca en yüksek yoğunluklarına sahip bilinen bir standart kullanılarak kütle spektrometresi kalibre edin. Tipik biyokütle örnekleri için, perflorotirbütilamin (PptBA) kullanın.
    2. Bir gaz akış ölçer kullanılarak 0.9 L / dk helyum taşıyıcı gaz akış hızını ayarlayın.
    3. 500 ° C'lik bir piroliz sıcaklığı ve oto-ömekleyici yazılımı kullanılarak 350 ° C'ye kadar bir arayüz sıcaklığına kadar otomatik numune fırın ayarlayın. Not: Bir 1/8 "paslanmaz çelik ısıtmalıkütle spektrometresi otomatik örnekleyiciyi bağlayan ısı bant sarılmış transfer hattı 250 ° C'de ısı kontrolörü kullanarak kontrol edilir.
    4. Kütle spektrometresi veri toplama başlayın ve arka plan spektrumları koleksiyonu için yeterli veri elde etmek en az 60 saniye bekleyin.
    5. 2.2.2 özellikleri ile otomatik otomatik örnekleyici yöntemini başlatın. Not: Otomatik örnekleyici otomatik örnekleyici fırına tek tek her bir örnek düşer. Toplam veri toplama süresi yaklaşık 1.5 dakika olduğu; Bununla birlikte, tipik bir 4 mg numunenin piroliz 30 saniye sonra tamamlanır.
    6. 0,5 sn tarama hızında kütle spektrometresi yazılımı kullanarak her numunenin Tutanak toplam iyon içeriği (TIC). M / z 30 ile 450 arasındaki Kayıt yoğunlukları.
      Not: Tipik biyokütle bileşikleri 17 eV yumuşak iyonizasyon kullanın. Alet 1.000 m / z 1 büyük aralıklarla kaydedebilirsiniz; Ancak, tarama hızı bilgisayar CPU gücü ile sınırlı olacaktır.
    7. Ma kullanarak spektrumları arka planı kaldırmaknual yazılımında özelliğini geliştirmek. Not: Veri toplama başında bazal 60 tarama kısmı ortalama bir arka plan değerini hesaplamak için kullanılır. Bu ortalama arka plan spektrumu kütle spektrometresi yazılım otomatik deney numune spektrumdan çıkarılır.
    8. Bir veritabanı programı içine her bir numune için spektral verileri içeren kütle spektrometresi yazılımı tarafından oluşturulan tek sütun metin dosyası, ithalat ve tek bir veritabanında tüm örnekleri birleştirir. E-tabloya herhangi bir geçerli meta veriler ekleyin. Istatistiksel yazılım paketi içine biçimlendirilmiş verileri (tablo / CSV dosyası) İthalat ve pirolize örnek kitleler varyasyon için hesap spektrumları normalleştirmek anlamına gelir.
    9. Ölçümlerde kullanılan çoğaltılmış standart numunelerin gruplandırma analiz etmek spektral verileri kullanarak bir ana bileşen analizi (PCA) gerçekleştirmek için bir istatistiksel yazılım paketi kullanımı yanı sıra, kimyasal sınıflandırılması ayrılmaz hangi doruklarına değerlendirmekyüklemelerinde bileşikler 28 arsa.
      PCA gruplar spektrumları benzerliği dayalı örnekler ve standartlar bir çek nedeniyle çalışma sırasında enstrüman sürüklenme deneysel hatayı ölçmek için izin verir: Not.
    10. Lignin syringly (S) / guaiasil (G) oranının hesaplanması için, S maksimum alanları toplamı (m / z = 154, 167, 168, 182, 194, 208 ve 210) G doruklarının toplamı ile ve bölme 124, 137, 138, 150, 164, ve 178 de.
    11. Toplam linyin içeriğini hesaplamak, m / z = 120, 124, 137, 138, 150, 152, 154, 164, 167, 178, 180, 182, 194 ve 210 ile birlikte lignin zirveleri Özetle.
    12. Örneğin Klason lignin gibi toplam lignin tahmin edilmesi için standart bir yönteme pyMBMS ölçüm ölçekleme için, bir düzeltme faktörü hesaplanır. PyMBMS kullanarak standart numune için ölçülen toplam lignin içeriği ile bireysel standardın Klason lignin değerini bölün.
    13. Veri kümesinde gibi tüm türler bu düzeltme faktörü uygulayın. Analiz biyokütle her türü için tekrarlayın. NOT: düzeltme faktörü önemli ölçüde analiz biyokütle S / G göre değişebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Kimyasal ve termal ön ve daha sonra enzim sakarifikasyon birleşik etkisi, deney sonunda serbest glukoz ve ksiloz kütlesinin bir fonksiyonu olarak ölçülür. Sonuçlar biyokütle gramı başına serbest glukoz ve ksiloz miligram cinsinden rapor edilir. Bu genellikle, başlangıç ​​malzemesinin kompozisyon analizi dayanan yüzde teorik verimin olarak rapor edilir laboratuvar ölçekli deneyler, bildirilen verilerin taban tabana zıttır. Henüz haftada örneklerin binlerce kompozisyon analizi yürütmek için pratik değildir, veri en kütle ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Aşağıdaki gibi yüksek verimli tarama deneyleri yaparken doğru ve tekrarlanabilir verilerini elde etmek için temel örnek hazırlama adımları şunlardır:

Şeker Salma Deneyi:

Genel olarak numuneler, birkaç düzine bir kerede birkaç bin arasında değişen sayıda hazırlanır. Her önemli bir adım, tipik olarak örnekler arasında hazırlanmasında değişimleri en aza indirmek için ileri doğru hareket önce, bütün numuneler için gerçekleştirilmiştir. De-Tutkal başlangıçta protokolü...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Yazarlar, bu el yazmasında tartışılan her iki yüksek verimli boru hattı için biyokütle örneklerinin hazırlanmasına ilişkin olağanüstü bilgiler sağlayan stajyer Evelyn Von Neida'ya teşekkür eder. Bu çalışmanın ve el yazmasının geliştirilmesine destek Biyoenerji Bilim Merkezi tarafından sağlanmıştır. Biyoenerji Bilim Merkezi, DOE Bilim Ofisi'ndeki Biyolojik ve Çevresel Araştırma Ofisi tarafından desteklenen bir ABD Enerji Bakanlığı Biyoenerji Araştırma Merkezi'dir. Ulusal Yenilenebilir Enerji Laboratuvarı (NREL), Alliance for Sustainable Energy, LLC tarafından DOE için işletilen ABD DOE Enerji Verimliliği ve Yenilenebilir Enerji Ofisi'nin ulusal bir laboratuvarıdır. Bu çalışma, ABD Enerji Bakanlığı tarafından Sözleşme No. kapsamında desteklenmiştir. DE-AC36-08-GO28308 Ulusal Yenilenebilir Enerji Laboratuvarı ile.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Biomek FX Otomatik İş İstasyonuBeckman CoulterBiomek FXOtomatik Sıvı İşleyici
Wiley değirmeniThomas Scientific3375E15 (Model 4) veya 3383L20 (Mini değirmen)
anti-statik torbalarMinigrip*MGST4P025032.5x3", birden fazla tedarikçi mevcut
kalay kaplı bakır telMcMaster-Carr8871K840.016" çap, bük ve kal tel
çay poşetleriHerbcopress n' demleme çay poşetleri3.5x5 inç
gluko-amilazNovozymesSpirizyme Yakıt 
alfa-amilazNovozymesLiquozyme SC DS
sodyum asetat trihidratherhangi bir kimyasal tedarikçisireaktif sınıfı
asetik asitherhangi bir kimyasal tedarikçisireaktif sınıfı
190 kanıt (%95) etanolherhangi bir kimyasal tedarikçisireaktif sınıfı
haznelerFreeslate
96- kuyu C-276 Hastelloy plakalarıAspen İşleme (Lafayette, Colorado)N / A (özel yapım)
1/8 "havya ucuSears
silikon yapışkan destekli Teflon bant3M51803" genişliğinde (36 yarda rulo)
enzim çözeltisiNovozymesCellic CTec2
sitrik asit monohidratherhangi bir kimyasal tedarikçi
trisodyum sitrat dihidratherhangi bir kimyasal tedarikçi
tek kullanımlık, polistiren 96 oyuklu plakalarGreiner Bio-One655101veya eşdeğeri; birden fazla tedarikçi mevcut
glikoz oksidaz / peroksidaz & nbsp;MegazymeK-GlucMegazyme D-glikoz test kiti
ksiloz dehidrojenazMegazymeK-KsilozMegazyme D-ksiloz test kiti
glikoz standart çözeltisiMegazymeK-GlucMegazyme D-glikoz test kiti
ksiloz standart çözeltisiMegazymeK-KsilozMegazyme D-ksiloz tahlil kiti
paslanmaz çelik numune kaplarıSınır LaboratuvarlarıPY1-EC80F
cam elyaf levhalarPall662278x10" levhalar; Standart delgeç ile delinmiş daireler
Şeker kamışı küspesi Bütün Biyokütle HammaddesiNIST8491
Doğu Kavak Ağacı (kavak) Bütün Biyokütle HammaddesiNIST8492
Monterey Çamı Bütün Biyokütle HammaddesiNIST8493
Buğday Saman Bütün Biyokütle HammaddesiNIST8494

Kaynaklar

  1. U.S. Billion-Ton Update: Biomass Supply for a Bioenergy and Bioproducts Industry. Perlack, R. D., Stokes, B. J. , Oak Ridge National Laboratory. Oak Ridge, TN. (2011).
  2. Henry, R. Ch. 5. Plant Resources for Food, Fuel and Conservation. , Earthscan. 53-80 (2009).
  3. Henry, R. J. Evaluation of plant biomass resources available for replacement of fossil oil. Plant Biotechnol. J. 8 (3), 288-293 (2010).
  4. Furtado, A., et al. Modifying plants for biofuel and biomaterial production. Plant Biotechnol. J. 12 (9), 1246-1258 (2014).
  5. Sluiter, J. B., Ruiz, R. O., Scarlata, C. J., Sluiter, A. D., Templeton, D. W. Compositional analysis of lignocellulosic feedstocks. 1. Review and description of methods. J. Agric. Food Chem. 58 (16), 9043-9053 (2010).
  6. Lupoi, J. S., Singh, S., Simmons, B. A., Henry, R. J. Assessment of Lignocellulosic Biomass Using Analytical Spectroscopy: an Evolution to High-Throughput Techniques. Bioenerg. Res. 7 (1), 1-23 (2014).
  7. Lapierre, C., Monties, B., Rolando, C. Thioacidolysis of lignin: comparison with acidolysis. J. Wood Chem. Technol. 5 (2), 277-292 (1985).
  8. DeMartini, J. D., Studer, M. H., Wyman, C. E. Small-scale and automatable high-throughput compositional analysis of biomass. Biotechnol. Bioeng. 108 (2), 306-312 (2010).
  9. Selig, M. J., et al. High throughput determination of glucan and xylan fractions in lignocelluloses. Biotechnol. Lett. 33 (5), 961-967 (2011).
  10. Selig, M. J., et al. Lignocellulose recalcitrance screening by integrated high-throughput hydrothermal pretreatment and enzymatic saccharification. Ind. Biotechnol. 6 (2), 104-111 (2010).
  11. Studer, M. H., De Martini, J. D., Brethauer, S., McKenzie, H. L., Wyman, C. E. Engineering of a high-throughput screening system to identify cellulosic biomass, pretreatments, and enzyme formulations that enhance sugar release. Biotechnol. Bioeng. 105 (2), 231-238 (2009).
  12. Gjersing, E., Happs, R. M., Sykes, R. W., Doeppke, C., Davis, M. F. Rapid determination of sugar content in biomass hydrolysates using nuclear magnetic resonance spectroscopy. Biotechnol. Bioeng. 110 (3), 721-728 (2013).
  13. Templeton, D. W., Sluiter, A. D., Hayward, T. K., Hames, B. R., Thomas, S. R. Assessing corn stover composition and sources of variability via NIRS. Cellulose (Dordrecht, Netherlands). 16 (4), 621-639 (2009).
  14. Tucker, M. P., et al. Fourier transform infrared quantification of sugars in pretreated biomass liquors. Appl. Biochem. Biotechnol. 84-86, 39-50 (2000).
  15. Wolfrum, E. J., Sluiter, A. D. Improved multivariate calibration models for corn stover feedstock and dilute-acid pretreated corn stover. Cellulose (Dordrecht, Netherlands). 16 (4), 567-576 (2009).
  16. Ona, T., et al. Non-destructive determination of wood constituents by Fourier-transform Raman spectroscopy. J. Wood Chem. Technol. 17 (4), 399-417 (1997).
  17. Ona, T., Sonoda, T., Ohshima, J., Yokota, S., Yoshizawa, N. A rapid quantitative method to assess eucalyptus wood properties for kraft pulp production by FT-Raman spectroscopy. J. Pulp Pap. Sci. 29 (1), 6-10 (2003).
  18. Hames, B. R., Thomas, S. R., Sluiter, A. D., Roth, C. J., Templeton, D. W. Rapid biomass analysis. New tools for compositional analysis of corn stover feedstocks and process intermediates from ethanol production. Appl. Biochem. Biotechnol. 105-108, 5-16 (2003).
  19. Studer, M. H., et al. Lignin content in natural Populus variants affects sugar release. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (15), 6300-6305 (2011).
  20. Chen, M., Zhao, J., Xia, L. Comparison of four different chemical pretreatments of corn stover for enhancing enzymatic digestibility. Biomass Bioenergy. 33 (10), 1381-1385 (2009).
  21. Davison, B. H., Drescher, S. R., Tuskan, G. A., Davis, M. F., Nghiem, N. P. Variation of S/G ratio and lignin content in a Populus. family influences the release of xylose by dilute acid hydrolysis. Appl. Biochem. Biotechnol. 129-132, 427-435 (2006).
  22. Li, X., et al. Lignin monomer composition affects Arabidopsis cell-wall degradability after liquid hot water pretreatment. Biotechnol. Biofuels. 3, 27-33 (2010).
  23. Lupoi, J. S., et al. High-throughput prediction of eucalypt lignin syringyl/guaiacyl content using multivariate analysis: a comparison between mid-infrared, near-infrared, and Raman spectroscopies for model development. Biotechnol. Biofuels. 7, 93(2014).
  24. Lupoi, J. S., Smith, E. A. Characterization of woody and herbaceous biomasses lignin composition with 1064 nm dispersive multichannel Raman spectroscopy. Appl. Spectro. 66 (8), 903-910 (2012).
  25. Sun, L., et al. Rapid determination of syringyl:guaiacyl ratios using FT-Raman spectroscopy. Biotechnol. Bioeng. 109 (3), 647-656 (2012).
  26. Lupoi, J. S., et al. High-throughput prediction of Acacia and eucalypt lignin syringyl/guaiacyl content using FT-Raman spectroscopy and partial least squares modeling. Bioenerg. Res. in press, (2015).
  27. Sykes, R., Kodrzycki, B., Tuskan, G., Foutz, K., Davis, M. Within tree variability of lignin composition in Populus. Wood Sci. Technol. 42 (8), 649-661 (2008).
  28. Sykes, R., et al. Ch. 12. High-Throughput Screening of Plant Cell-Wall Composition Using Pyrolysis Molecular Beam Mass Spectroscopy. Biofuels: Methods and Protocols. Mielenz, J. R. 581, 169-183 (2009).
  29. Decker, S., et al. Ch. 17. Reducing the effect of variable starch levels in biomass recalcitrance screening). Biomass Conversion. Himmel, M. E. 908, Humana Press. 181-195 (2012).
  30. Evans, R. J., Milne, T. A. Molecular characterization of the pyrolysis of biomass. Energy Fuels. 1 (2), 123-137 (1987).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Biyok tle Diren lili iBuhar n lemiGlukoz Ksiloz KantitasyonuPiroliz Molek ler DemetK tle SpektrometresiH cre Duvar AnaliziRobotik Numune leme
Toplam Lignin, lignin Monomer ve enzimatik Şeker Yayın: Lignocellulosic Biyokütle rekalsitrantların Varyasyonları yüksek verimlilik Taraması
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.