Bakteriyel Yapay Kromozom: RNA Virüsler Pozitif iplikli Araştırmaları Fonksiyonel Genomik Aracı

Özet

Burada, Japon ensefalit virüsünün pozitif sarmallı genomik RNA'sının tam uzunlukta bir cDNA'sını içeren bulaşıcı bir bakteriyel yapay kromozom oluşturmak için bir protokol sunulmaktadır. Bu protokol, diğer pozitif sarmallı RNA virüslerinin işlevsel bir cDNA'sını oluşturmak için kullanılabilir, bu da onu virüs biyolojisini incelemek için güçlü bir genomik araç haline getirir.

Özet

Enfeksiyöz virüsü klonlanmış bir cDNA'dan tamamen kurtarmaya yönelik bir yaklaşım olan ters genetik, genomları hücresel mRNA ile aynı polariteye sahip olan pozitif sarmallı RNA virüsleri alanında devrim yarattı. cDNA tabanlı ters genetik sistem, viral genomik RNA'nın doğrudan manipülasyonunu sağlayan, böylece viral replikasyon ve patogenezde hem viral RNA elementlerinin hem de gen ürünlerinin moleküler ve genetik çalışmaları için rekombinant virüsler üreten ufuk açıcı bir yöntemdir. Ayrıca, yabancı genlerin verilmesi için genetik olarak tanımlanmış aşıların ve viral vektörlerin geliştirilmesine izin veren değerli bir platform sağlar. Bununla birlikte, Japon ensefalit virüsü (JEV) gibi birçok pozitif sarmallı RNA virüsü için, klonlanmış cDNA'lar kararsızdır ve fonksiyonel cDNA'nın inşası ve yayılması için büyük bir engel oluşturur. Burada, bu rapor, aşağıdaki genel deneysel prosedürleri kullanarak bir bakteriyel yapay kromozom (BAC) olarak genetik olarak stabil tam uzunlukta bulaşıcı bir JEV cDNA'nın oluşturulması ve çoğaltılmasına ilişkin stratejik hususları açıklamaktadır: viral RNA izolasyonu, cDNA sentezi, cDNA alt klonlaması ve modifikasyonu, tam uzunlukta bir cDNA'nın montajı, cDNA doğrusallaştırması, in vitro RNA sentezi ve virüs geri kazanımı. Bu protokol, bir dizi pozitif sarmallı RNA virüsü için, özellikle >10 kb uzunluğunda bir genoma sahip olanlar için, enfeksiyöz RNA'ların bir bakteriyofaj RNA polimeraz ile in vitro olarak kopyalanabildiği bir BAC vektörüne tam uzunlukta cDNA'nın klonlanması için uygulanabilir genel bir metodoloji sağlar.

Giriş

RNA virologists, 1970'lerin rekombinant DNA teknolojisindeki gelişmeler, daha sonra mümkün RNA virüslerinin genetik manipülasyonu için bakterilerde plazmidler gibi yayınlanabilirdi cDNA klonları, viral RNA genomları dönüştürmek için yapılmıştır. ^1, ilk RNA virüsü olduğu Klonlanmış moleküler bakteriyofaj Qβ, Escherichia coli bozar pozitif sarmallı RNA virüsü oldu. E. verildiğinde Qβ genomik RNA'nın bir cDNA kopyasını ihtiva eden bir plasmid, bulaşıcı Qβ fajlar yol açan E. coli. ² Kısa bir süre sonra, bu teknik, poliovirüs uygulanan, insanlarda ve hayvanlarda bir pozitif tek iplikli RNA virüsüdür edildi. Çocuk felci virüsü genomik RNA'nın bir tam boy bir cDNA taşıyan bir plazmid, bulaşıcı memeli hücrelerine transfekte edilmiş ve enfeksiyöz virionlann üretebilen zaman ^3, klonlanmış cDNA'lar, viral RNA replikasyonunu başlatmak için hücre transkribe edilmesi gerekmektedir, bu "DNA başlatıldı" yaklaşımında.;transkripsiyon başlatılır ve nasıl transkript doğru viral diziye nasıl işlendiğini, ancak belirsizdir. Bu kaygı, bir alternatif "RNA fırlatılan" bir gelişmesine yol açmıştır yaklaşımı viral RNA genomunun tam bir cDNA kopyası bir E. tarafından tanınan bir promoter altında klonlanır, böylece Ev sahibi hücre içine sokulduğunda virüsün replikasyon çembere devam tanımlandığı 5 've 3' uçlarının ile in vitro olarak sentetik RNA'ların üretimi için E. coli ya da faj RNA polimeraz. Bu yaklaşım ilk başarılı brom mozaik virüsü için bildirilmiştir ^{4,5 6,7} bitki pozitif iplikli bir RNA virüsüdür. O zamandan beri, RNA fırlatılan bir yaklaşım kalisivirüs alfavirüsler, flavivirüsler, arteriviruses ve koronavirüslerin dahil pozitif iplik RNA virüslerinin geniş bir yelpazesi için geliştirilmiştir. ^1,4,5,8

Nitelikteki DNA- ve her ikisinde de, ful inşaatı karşıt genetik sistemler RNA başlatılan~ 10 l-uzunluklu cDNA klonu enfeksiyon DNA veya pozitif sarmallı RNA virüslerinin RNA üreten anahtarı, ancak viral genomun boyutu arttıkça önemli bir teknik sorun. Özellikle ^9-17, geniş bir RNA genomu olur -32 kb, tam uzunlukta cDNA işlevsel klonlama ile üç büyük sorun sunulur. RT-PCR aslına viral RNA'nın uzunluğu ile ters orantılı olduğundan, ¹⁸ ilk zorluk, kopyalama sadık bir cDNA sentezi. Uzun RNA molekülleri E. kararsız plazmidler cDNA fragmanının yapabilen beklenmeyen dizileri içeren daha büyük olasılıkla, çünkü ikinci bir engel, potansiyel olarak toksik sekansların varlığı E. coli. O> 10 kb viral cDNA insert ev bir klonlama vektörü bulmak zor olduğundan üçüncü ve en kritik konu, uygun bir vektör mevcudiyetidir. Son üç yılda, bu engeller enzimolojisi, metodoloji, An çeşitli gelişmeler aşılmıştırd vectorology. Bunlardan ^1,4,5,8, en yenilikçi gelişimi büyük pozitif sarmallı RNA virüsleri gibi bulaşıcı bakteriyel yapay kromozomları (BAC'ler) klonlanması olup. BAC vektörü E. göre bir düşük kopya plazmid klonlama (1-2 kopya / hücre) bir arasında bir ortalama DNA insert boyutu ile coli doğurganlık faktörü, ~ 120-350 kb ^19-21 bir DNA parçası, genel klonlama vektörleri içine klonlama için benzer bir şekilde BAC vektörü içine sokulur.; Ortaya çıkan BAC klonları E. birçok nesiller boyunca stabil E. coli. Bugüne kadar ^22,23, BAC teknolojisi yani üç pozitif iplikli RNA virüsüdür aileleri, Flaviviridae, ^24-29 Arteriviridae, ³⁰ ve Coronaviridae> 10 üyeleri için bulaşıcı cDNA klonları oluşturmak için kullanılır olmuştur. ^{9,16,17 , 31,32}

Örnek olarak Japon ensefaliti virüsü (JEV) kullanarak, mevcut iş olabilir detaylı prosedürler raporlarıpozitif sarmallı RNA virüslerinin çeşitliliği için bir genetik olarak stabil, tam uzunlukta enfeksiyon BAC oluşturmak için kullanılır. Meydana JEV, JEV enfeksiyonu ağır sıklıkla ölümcül bir nörolojik hastalıktır Japon ensefalit neden olabilir İnsanlarda bir zoonotik sivrisinek vektörleri tarafından kuş, domuz ve diğer omurgalı konaklar arasında doğada iletilir flavivirüs ^{33. 34,35} olan (JE), ³⁶ ~ 50,000-175,000 klinik vakaların tahmini yıllık insidansı Asya ve Batı Pasifik, ^37,38 parçaları. ^39,40 Jev genomu bir ~ 11-kb, tek iplikli, pozitif-sens RNA molekülüdür ve oluşan 5 've 3' iki kodlayıcı olmayan bölgeleri (NCRs) ile çevrili bir tek bir açık okuma çerçevesi (ORF) sona erer. ^41,42 ORF olarak 10 bağımsız proteinlerin üretilmesi için host ve viral proteazlar tarafından bölünen bir poliproteini şifreler C prM, E, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B ve NS5 Ayrıca C-terminal yönüne N-. ^34,43,44, eNS1 (NS1 ') ne sahip Xtended şekilde kodonları NS2A 8-9 de tarafından -1 ribozomal çerçeve ifade edilir. Bu 11 proteinlerden ^45,46, üç yapısal proteinleri (Cı prM ve E) enfeksiyon oluşumu için gerekli olan virionlar, ^47,48 ve kalan sekiz yapısal olmayan proteinler (NS5'in için NS1 ve NS1 '), viral RNA replikasyonu, ^49-51 parçacık montaj, ^52-56 ve doğal bağışıklık kaçırma için çok önemlidir. ^57-59 İkisi 5' ve 3 'NCRs birincil dizileri ve viral RNA replikasyonu modüle için önemli olan formu RNA ikincil / üçüncül yapıları, ^60-62 korunmuş içerirler. ^63,64

Bu protokol, SA ₁₄ -14-2 tam uzunlukta JEV enfeksiyöz BAC üretilmesi için araçlar, yöntem ve stratejiler açıklanmaktadır. ²⁸ Bu fonksiyonel BAC klonu bir promoter tarafından kapsanmaktadır JEV genomik RNA'nın bir cDNA kopyasını, ⁶⁵ içerir SP6 RNA polimeraz için üst başViral 5'-uç ve in vitro Çoğaltma transkripsiyonu ayrıca viral 3'-ucunun alt baş benzersiz bir Xba I kısıtlama sahasının. Bu BAC teknolojisi pozitif sarmallı RNA virüslerinin bir dizi için tamamen işlevsel bir cDNA klonu molekül oluşturmak için de geçerlidir.

Protokol

Not: Şekil 1 BAC gibi tam uzunlukta bulaşıcı JEV cDNA yapımı için bir strateji sunar ²⁸ Tablo 1 Bu protokolde kullanılan oligonükleotidlerden bir listesini sağlar ^28..

1. hücre kültürü süpernatanlarında JEV Taneciklerinden Viral RNA ekstrakte

1. JEV SA ₁₄ -14-2, Biyogüvenlik Seviyesi 2 çevreleme gerektiren canlı JE aşısı virüsü içeren hücre kültür ortamı ile başlayın.
   Not: bir viral titresi yaklaşık 1-3 x 10 ⁶ plak oluşturucu birim / ml olmuştur.
2. Önce JEV SA ₁₄ -14-2 ile çalışmak için tüm standart mikrobiyolojik uygulamaların, güvenlik ekipmanları ve laboratuvar olanakları için gerekli biyogüvenlik eğitimi alın.
3. Fenol ve guanidin izotiyosiyanat ⁶⁶ (Şekil 1A) bir tek fazlı çözelti kullanılarak virüs ihtiva eden hücre kültür ortamı bir böleni ile viral RNA'yı saflaştırmak.
   1. Reklamd 1,7 mi mikrotüp kültür yüzey 200 ul tek fazlı reaktifin 600 ul. 30 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde tüp elle çalkalama ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edilerek homojen bir karışım.
   2. Homojenize örnek kloroform 160 ul ekle. 15 saniye boyunca kuvvetlice tüp el sallayarak ve oda sıcaklığında 2-3 dakika boyunca bırakarak iyice karıştırın.
   3. Yani iki sıvı fazdan oluşan bir ayırma, daha düşük bir organik faz ve bir üst sulu faz sonuçlanır 4 ° C'de 15 dakika boyunca 13.400 x g'de toplam lizat santrifüjleyin. Yeni mikrotüpe RNA içeren üst sulu fazı (az 200 ul) aktarın.
   4. 5 ug / ml glikojen 1 ul% 100 izopropanol 400 ul ilave edilmesi ve oda sıcaklığında 10 dakika daha inkübe RNA çöktürün.
   5. Santrifüj 4 ° C'de 10 dakika boyunca 13.400 x g'de karışımı ile gerçekleştirilmektedir. Süpernatantı atın ve beş darbe vorteks üç tarafından% 75 etanol 1 ml RNA pelet yıkayınsüresi ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 13.400 x g'da santrifüjleme.
   6. 10 dakika boyunca RNA pelet Hava kuruması ve dH ₂ O. 40 ul feshedip Kullanılana kadar -80 ° C'de ekstre RNA saklayın.

2. Dört Çakışan cDNA Fragments (F4 F1) Ters Transkripsiyon tümünün Viral genomik RNA (RT) Kapsayan -PCR bir Set sentez

1. Bir şablon olarak saflaştınlmış viral RNA'nın bir 10 ul alikot ve Moloney mürin lösemi virüsü modifiye edilmiş bir formu, ters transkriptaz içeren 20 ul RT reaksiyonu gerçekleştirin. ⁶⁷
   1. 10 saflaştırılmış RNA ul, 1 ul 10 mM dNTP karışımı, 1 ul 4 pmol / ul primer, ve 1 ul dH _{2 O} ihtiva eden bir 13 ul karışım ayarlama F4 için F3 F1, F2 2RT için 3RT için 1RT ve 4RT: Her bir RT reaksiyonu için fragmanı spesifik primer kullanarak.
   2. 1 dakika boyunca, 5 dakika boyunca 65 ° C 'de buz üzerinde yer karışımı inkübe ve sonra hızlı bir spin Conte toplamaktüpün dibinde NTS.
   3. Ul ters transkriptaz / 4 ul 5 x RT tamponu, 1 ul 0.1 M DTT, 1 ul 40 U / ul RNaz inhibitörü ve 1 ul 200 U ekleyin. Yukarı pipetleme ve üç beş kez aşağı karıştırın.
   4. Reaksiyon daha sonra 15 dakika boyunca 70 ° C 'de örnek ısı ile inaktive, 1 saat süre ile 50 ° C' de devam edelim. Kullanılana kadar -20 ° C 'de sentezlenen ilk-iplikçik cDNA saklayın.
2. Şablon ve yüksek güvenilir bir termo stabil DNA polimeraz ⁶⁸ (Şekil 1B) halinde ısı ile inaktive edilmiş RT reaksiyonunda bir 5 ul alikot ile 100 | il PCR reaksiyonu gerçekleştirmek.
   1. RT reaksiyonu 5 ul, 20 ul 5 x PCR tampon, 4 ul 10 mM dNTP karışımı, 5 ul 10 uM ileri primer, 5 ul 10 uM ters primeri, 1 ul 2 U içeren, buz üzerinde 100 | il PCR reaksiyonu ayarlama / ul DNA polimeraz ve 60 ul dH _{2 O} Her PCR reaksiyonunun için fragmanı spesifik primer çifti kullanınn: F1 (2573 bp) için 1F + 1R, F2 için 2F + 2R (4171 bp), F3 için 3F + 3R (3922 bp) ve F4 için 4F + 4R (1798 bp).
   2. Altta içeriğini toplamak için parmak çevirme tüp üç beş kez ve santrifüj kısaca tarafından yavaşça karıştırın.
   3. Aşağıdaki PCR profili ile 25-30 döngü izledi 98 ° C 'de 30 saniyelik bir başlangıç ​​denatürasyon basamağından ile termodöngüleme başlayın: 98 ° C'de 10 saniye, 60 ° C'de 30 saniye, ve 1-2 dakika (30 s / 72 ° C'de kb). Analiz edilene kadar 4 ° C 'de, PCR ürünlerini saklayın.
3. 0.5 ug / ml etidyum bromür (EtBr) (Şekil 2) ihtiva eden bir% 0.8 agaroz jeli üzerinde PCR reaksiyonunun her bir 2-5 ul tablet çalıştırın.
   DİKKAT: EtBr güçlü bir mutajen ve kullanımı, depolanması ve bertaraf sırasında dikkat edilmesi gereken laboratuvar mont, koruyucu gözlük ve giyilmek üzere eldiven ve son derece dikkatli gerektirir.

3. Altklon BAC Vector içine dört cDNA Fragments (F4 F1) Her pBAC / F4 b pBAC / F1 oluşturmay moleküler klonlama teknikleri

1. Aşağıdaki gibi vektör Digest ve iki uygun sınırlama endonükleazı ile DNA'lar ekleyin:
   1. 60 ul (ihtiva eden toplam hacim yaklaşık 500 ng DNA, ^içinde, 30 Pme I ile pBeloBAC11 plazmid (7507 bp, GenBank erişim numarası U51113), bir türevi ve Not I pBAC / PRRSV / FL (vektör) 'in bir ardışık sindirim gerçekleştirme , 15.426-bp vektör fragmanı verir 12-15 saat boyunca 37 ° C'de 10 U enzim, 1 x sindirim tamponu ve 1 x BSA).
   2. 25 ° C'de 60 ul toplam hacim içinde sıralı bir Sma I ile dört cDNA amplikonlarının (insert) her birinin sindirim ve Not I gerçekleştir (~ 1 ug DNA, 20 U enzim, 1 x sindirim tampon ihtiva eden ve 1 x BSA) ° C (Sma I) ya da 12-15 istenen büyüklükte aşağıdaki ekleme parçalarını verir saat için 37 ° C (Not I): F1 (2559 bp), F2 (4157 bp), F3 (3908 bp) ve F4 (1784 bp).
2. Arındırmakvektör, istenen ve jel ekstraksiyonu ile DNA kıtalarının yerleştirin.
   1. Ihtiva eden bir% 1 düşük erime noktalı agaroz jel 0,5 ug / ml EtBr ile iki kat sindirilmiş ürünler ayırın. Uzun dalgalı ultraviyole ışığı altında agaroz minimum miktarda (genellikle yaklaşık 200 ul) ile arzu edilen bir DNA fragmanının bir bant kesin.
   2. 1.7 ml'lik bir mikrotüp agaroz kesilmiş eşit TEM tampon hacmi (10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA ve 10 mM _MgCI2) ekleyin. Agaroz tamamen eriyene kadar 2-3 dakika süre ile girdap ile 10-15 dakika boyunca 72 ° C 'de örnek inkübe edin.
   3. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 13.400 x g'de 1 dakika, ve santrifüj boyunca kuvvetli bir şekilde, girdap önceden ısıtılmış tampon, doymuş fenolün eşit hacim.
      Not: Karışım daha düşük bir organik faz ve bir üst sulu faz ayrılır. Yeni bir mikrotüp Üstteki DNA içeren sulu faz transfer.
   4. Izoamil alkol (24: 1), kloroform eşit hacimde ekleme 13 yaşında, 1 dakika süre ile girdap ve santrifüjOda sıcaklığında 10 dakika boyunca 400 x g. Yeni bir mikrotüp üst sulu faz transfer.
   5. 10 ug / ml maya tRNA, 0.5 ul 3 M sodyum asetat 10/01 hacim, ve% 100 etanol içinde 2.5 hacim ekleyin. 20 dakika boyunca buz karışımı tutun.
   6. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 13.400 x g'de santrifüjleyin karışımı. Süpernatantı ve üç ila beş kez darbe vorteks ve 10 dakika boyunca 13.400 x g'de santrifüjleme ile,% 70 etanol içinde 1 ml DNA pelet yıkayın.
   7. 10 dakika için DNA pelletini hava-kurutun ve TE tamponu 20 ul (10 mM Tris-Cl ve 1 mM EDTA [pH 7.6]) içine çözülür.
3. Istenen vektörü bağlanır ve T4 DNA ligazı kullanılarak DNA fragmanları yerleştirin.
   1. Vektör DNA, 50-100 ng sokma DNA'nın ~ 3-kat molar fazlalığı, 400 U T4 DNA ligazı ve 1 x ligasyon tampon ihtiva eden bir 20 ul ligasyon reaksiyonu ayarlayın. 12-15 saat boyunca 16 ° C'de bağlanma reaksiyonu inkübe edin.
      Not: Negatif Contr dahilol reaksiyonu, yani sadece paralel insert olmadan vektör.
   2. Her (F1) 2559-bp ile pBAC / PRRSV / FL 15426-bp Pme I- Not I fragmanı katılmadan, dört ayrı ligasyon gerçekleştirin 4157-bp, (F2 için) (F3) 3908-bp veya (F4 için) 1784-bp dört cDNA amplikonlarının birinin Sma I Not I fragmanı, altklonların pBAC / F4 pBAC / F1 üretmek için.
4. E. lige DNA Dönüşümü _CaCl2 -Isı şok yöntemiyle coli DH10B.
   1. _CaCI2, 100 ul tam bölünen miktarları, yetkili DH10B hücrelerini -80 ° C'de saklandı ⁶⁹ ile tedavi edilen alın ve buz üzerinde eritin.
      Not: dönüşüm başına hücre 100 ul kullanın.
   2. Bir 1.7 mi mikrotüp Çözülen hücrelerin 100 ul DNA ligasyon reaksiyonu 10 ul kısım ekleyin tüp dokunarak yavaşça karıştırın ve 30 dakika boyunca buz üzerinde tutulur.
   3. Isı şoku 42 ° C wa 45 saniye boyunca DNA hücre karışımıdaha sonra ter-banyosu, 2 dakika için buz üzerinde bir yer ve LB suyu 900 ul, oda sıcaklığına kadar önceden ısıtılmış ekleyin.
   4. 225-250 rpm'de çalkalanarak 1 saat boyunca 35 ° C'de ısı ile şoklanmış hücre inkübe edin.
   5. 10 ug / ml kloramfenikol içeren LB agar plakaları üzerinde kültürlendi hücreleri (Cml) 50 ila 200 ul alikotları yayıldı. Onlar kuruyana kadar, sağ yan, oda sıcaklığında plakalar tutun.
   6. Ters plakaları getirin ve 15 saat boyunca 35 ° C'de inkübe edin.
5. Bir sütun bazlı saflaştırma yöntemi (Şekil 1C) ile konakçı hücrelerden klonlanmış BAC DNA kurtarma.
   1. LB-agar plakaları Cml altı ila sekiz bakteriyel koloniler 10 ug / ml CML ihtiva eden 2xYT suyu 3 ml içine inoküle. Sertçe çalkalandı (225-250 rpm) ile 10 saat boyunca 35 ° C'de kültürler inkübe edin.
   2. Üretici tarafından yönlendirildiği gibi, spin kolonları kullanılarak bakteri kültürlerinin 1-1.5 ml rekombinant BAC DNA'lar izole edin. ⁷⁰ Zehir ekstre DNA (tipik olaTE tamponu 20 ul jik olarak 100-200 ng).
   3. Bir Klonlama için kullanılan aynı enzimler kullanılarak doğru bir ekleme ile vektörün varlığı tespit etmek, 10 ul toplam hacim içinde ~ 6 saat süre ile izole BAC'lerin iki analitik sınırlama enzim sindirimleri gerçekleştirir (Protokol 3,1) ve diğer tek bir kısıtlama fragmanı örneği oluşturur (ör Bgl II, Nco I ya da Pst I), uygun bir enzim ile klonlanmış BAC'lerin bütünlüğünü test etmek.
   4. 2xYT-Cml ortamı, 500 ml (Protokol 3.5.1 gelen) pozitif bakteri kültürlerinin 500 ul inokülasyon ve 225-250 rpm'de çalkalayarak 35 ° C sıcaklıkta 6 saat boyunca inokulum işleyerek doğru klonlanmış BAC'ler yayar. Üretici tarafından önerildiği üzere, filtre kolonları kullanılarak 500 ml'lik bir kültürden alınan BAC DNA (tipik olarak 10-20 ug) saflaştınlır. ⁷¹
      Not: İlk dört BAC altklonları, JEV genomik RNA'nın bir cDNA fragmanı içeren her üzerinde olması kanıtlamak olabilire ya da (bir referans dizi olarak hizmet eder), viral genomun ⁴² konsensüs sekansı ile karşılaştırıldığında daha istenmeyen mutasyon (lar). Böyle bir mutasyon, bir tam uzunlukta cDNA JEV birleştirilmesinden önce PCR-bazlı bölgeye-yönelik mutagenez ile düzeltilmiştir edilmesi gerekmektedir. ²⁷

4. 5 'SP6 Promoter ve 3' Run-off Site ile Full-uzunluk JEV cDNA oluştur

1. Üç genetik değişiklikler otantik 5 've 3' ile birlikte genom uzunlukta RNA'ların in vitro Çoğaltma transkripsiyonu sağlamak için klonlanmış cDNA bölgesi (4.1.1-4.1.3 Protokoller aşağıya bakınız) Marka Viral genomun sona erer.
   1. Üst üste gelen uzatma PCR (Şekil 1D, pBAC / F1 ^SP6) viral genomunun 5 'ucunun, doğrudan üst akışında bir SP6 başlatıcısı tanıtılması.
      1. Ürün s (iki primer çiftiyle SP6F + SP6R (ürün boyutu, 173 bp) ve F1F + F1R ile pBAC / F1 ilk standart PCR ile örtüşen iki DNA parçalarını yükseltmekize, 676 bp), 1 ul hedef DNA (~ 200 pg / ml) ihtiva eden bir 50 ul reaksiyon, her biri 10 ul 5 x PCR tampon maddesi, 2 ul 10 mM dNTP, 2.5 | il ileri 10 uM her birini ve ters primerler, 0.5 ul 2 U / ul DNA polimeraz, ⁶⁸ ve 31.5 ul dH _{2 O} 30 saniye için 98 ° C ve 10 sn için 98 ° C 25 döngü, 30 saniye için 60 ° C ve 20 sn için 72 ° C: Aşağıdaki PCR döngü profili kullanılarak gerçekleştirin.
      2. Protokol 3,2 de tarif edildiği gibi,% 1.5 düşük erime noktalı agaroz jel ile iki PCR ürününün her biri çalıştırdıktan sonra, iki PCR ile amplifiye DNA fragmanları jel-saflaştırılması.
      3. 1 ul, iki saflaştırılmış DNA parçalarının her biri (~ 100 ug / ml) içeren bir 100 ul reaksiyon (ürün boyutu, 821 bp), dış astarlar SP6F + F1R kullanılarak ikinci füzyon PCR üzerinden iki jelle saflaştınlmış DNA parçalan sigorta, 20 ul 5 x PCR tampon maddesi, 4 ul 10 mM dNTP, 5 ul ileri 10 uM her birini ve ters primerler, 1 ul2 U / ml DNA polimeraz, ⁶⁸ ve 63 ul dH _{2 O} 30 saniye için 98 ° C, ve 10 saniye, 30 saniye için 60 ° C, 30 sn için 72 ° C, 98 ° C 25 döngü: Aşağıdaki termal döngü profili kullanın.
      4. Protokol 3,2 de tarif edildiği gibi, bir% 1 düşük erime noktalı agaroz jelinden kaynaşık PCR amplikon jel-saflaştırılması.
      5. Oluşturmak için pBAC / F1 9532-bp Pac I- BSI WI fragmanı ile jel-saflaştırılmış erimiş PCR amplikonunun 760-bp Pac I- BSI WI fragmanı Arter Protokollerinin 3,1-3,5 açıklanan beş adımlı klonlama işlemini gerçekleştirin pBAC / F1 ^SP6.
   2. Örtüşme uzatma PCR (Şekil 1D, pBAC / F3 ^KO) üzerinden sessiz nokta mutasyonu (T → A ⁹¹³⁴⁾ tanıtarak nükleotid 9131 de önceden var olan iç XbaI siteyi çıkarın.
      1. İki primer çiftleri X1F + X1R ile pBAC / F3 ilk standart PCR ile örtüşen iki DNA fragmanlarını yükseltmek(ürün boyutu, 746 bp) ve X2F + X2R Protokolü 4.1.1.1 tarif edilen deney koşulları altında, bir 50 ul reaksiyon (ürün boyutu, 316 bp).
      2. Protokol 3,2 ayrıntılı olarak,% 1.5 düşük erime noktalı agaroz jeller üzerinde elektroforezle ayrılması sonra iki PCR amplifiye edilmiş DNA fragmanları jel-saflaştırılması.
      3. Protokol 4.1.1.3 tarif edilen deney koşulları altında, bir 100 ul reaksiyon dış primerler X1F + X2R (ürün boyutu, 1033 bp) kullanılarak ikinci füzyon PCR üzerinden iki jelle saflaştınlmış DNA parçalan sigorta.
      4. Protokol 3,2 detaylı olarak, bir% 1 düşük erime noktalı agaroz jelinden kaynaşık PCR amplikon jel-saflaştırılması.
      5. 16245-bp Değil I- BSI WI ve 2141-bp BSI W I jel-saflaştırılmış erimiş PCR amplikonunun 949-bp Avr II- Not I fragmanı bağlanması için Protokolleri 3,1-3,5 açıklanan beş adımlı klonlama işlemini gerçekleştirin - pBAC / F3 Avr II fragmanları pBAC / F3 ^KO üretmek.
   3. PCR bazlı bölgeye yönelik mutajenez (Şekil 1D, pBAC / F4 ^RO) viral genomunun 3 'ucunun hemen alt baş tarafındaki yeni bir yapay Xba I run-off sitesi Engineer.
      1. 1 ul hedef DNA ihtiva eden bir 100 ul reaksiyon primerleri, rof + ROR (ürün boyutu, 324 bp) (~ 200 ug / ul) ile pBAC bölgesinin PCR ile, bir DNA fragmanını oluşturmak / F4, 20 ul 5 x PCR tampon maddesi, 4 ul 10 mM dNTPs, 5 ul ileri 10 uM her birini ve ters primerler, 1 ul 2 U / ul DNA polimeraz, ⁶⁸ ve 64 | il _DH 2 O 30 saniye için 98 ° C ve 10 sn için 98 ° C 25 döngü, 30 saniye için 60 ° C ve 15 sn için 72 ° C: Aşağıdaki PCR döngü profili kullanılarak gerçekleştirin.
      2. Protokol 3,2 detaylı olarak, bir% 1 düşük erime noktalı agaroz jelden PCR ile amplifiye DNA fragmanı jel-saflaştırılması.
      3. 283-bp Sfi I N Arter Protokollerinin 3,1-3,5 açıklanan beş adımlı klonlama işlemini gerçekleştirinpBAC / F4 ^RO oluşturmak için pBAC- / F4 16933 bp'lik Sfi I Not I fragmanı ile jelle saflaştırılmış PCR amplikonunun her ot I parçası.
2. (Üç doğal kısıtlama sitelerde Bsr GI, Bam HI, ve Ava I katılarak (pBAC / SA ₁₄ -14-2) tek tam uzunlukta SA ₁₄ -14-2 BAC içine cDNA'lan örtüşen, modifiye dört bir dizi birleştirin ) Protokolleri ayrıntılı prosedürler klonlama beş adımı kullanarak sıralı bir şekilde 3,1-3,5 (Şekil 1E): pBAC o ile pBAC / F1 ^SP6 Bsr G I- Not I fragmanı değiştirerek F1 ^SP6 → F1 ^SP6 F2 (/ Ava I- Not I fragmanını değiştirerek (F1 ^SP6 F2F3 ^KO F4 ^RO → pBAC / F3 ^KO) o ile pBAC / F1 ^SP6 F2 Bam H I Not I fragmanı değiştirerek F1 ^SP6 F2F3 ^KO → F2) ( pBAC / F1 ^SP6 F2PBAC / F4 ^RO bununla F3 ^KO).

5. Tam uzunlukta bir yüksek saflıkta maksi-hazırlık SA ₁₄ -14-2 BAC Hazırlama

1. E. tek bir koloni büyümeye daha sonra 225-250 rpm'de çalkalanarak ve 35 ° C 'de 10 saat boyunca 10 ug / ml CML ihtiva eden 2xYT suyu pBAC / SA ₁₄ -14-2 3 ml taşıyan coli DH10B 10 saat 500 ul inokülasyon ile büyütmek 2xYT-Cml orta ve kuvvetli çalkalama ile 35 ° C'de 6 saat boyunca inokulum yetiştirilmesi 500 ml bakteri kültürü.
2. Santrifüj 4 ° C 'de 15 dakika süre ile 3107 x g' de, iki 250 ml şişe içinde bakteri kültürü. GTE çözeltisi (50 mM glukoz, 25 mM Tris-Cl, 10 mM EDTA [pH 8.0]), 30 ml, her pelletini ve / ml lizozim, 60 mg, 500 ul ilave edin. 10 dakika boyunca buz üzerinde, iki hücre süspansiyonları inkübe edin.
3. Her hücre süspansiyonuna taze Lysis çözeltisi (0,2 N NaOH ve% 1 SDS), 60 ml ilave edilir berraklaşana kadar karıştırın ve lizatları tutmak10 dakika boyunca oda sıcaklığında karıştırıldı.
4. Her bir şişeye (60 mi 5 M potasyum asetat, 11.5 ml buzlu asetik asit ve 28.5 ml dH ₂ O'dan oluşan, 100 ml) ile nötrleştirme çözeltisi 45 ml ilave edilir, şişe ters çevirerek iyice karıştırın ve buz üzerinde nötralize lizatları inkübe 10 dakika karıştırıldı.
5. Santrifüj 4 ° C'de 20 dakika boyunca 18.566 x g'de nötralize lizatları. Iki yeni 250 ml'lik şişeler içine hem şişelerin süpernatant aktarın; her bir 100% 0.6 hacim izopropanol ekleyin ve 20 dakika boyunca buz üzerinde tutun.
6. 4 ° C'de 20 dakika boyunca 18.566 x g'de çökeltiler dönerler. TE tamponu, 5 ml her bir pelet çözülür (10 ml toplam) 50 ml'lik bir tüp içinde kombine ve 5 M lityum klorür eşit bir hacminin eklenmesiyle RNA'yı çöktürmek. 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe karışımı.
7. Santrifüj 4 ° C'de 20 dakika boyunca 14.636 x g'de RNA çökeltisi. Yeni bir 250 ml'lik bir tüpe transfer süpernatantı ve% 100 izopropanol 2 hacmi eklenerek DNA'nın çökeltilmesi.20 dakika boyunca buz üzerinde inkübe karışımı.
8. 4 ° C'de 20 dakika boyunca 18.566 x g'de DNA çökeltisi dönerler. Süpernatantı aspire TE tamponu (pH 7.6), 9.5 ml DNA pelletini, ve sezyum klorür (CsCl), 10 g ve / ml EtBr 10 mg 390 ul ilave edin.
9. 18 G iğne ile donatılmış bir şırınga kullanarak 16 × 76 mm yapışmalı polipropilen tüp içine DNA CsCl-EtBr çözümünü yükleyin. 20 ° C'de (Şekil 3), 16 saat boyunca 401.700 x g'de, bir ultra santrifüj mühürlü CsCl gradyanı dönerler.
10. Degrade üstündeki hava deliği ve degrade yanından BAC DNA almak için 20 G iğne donanımlı şırınga oluşturmak için 18 G iğne kullanılarak CsCI degrade BAC plazmid DNA bandı toplayın.
11. _DH 2 2.5 hacimleri ekle EtBr lekeli BAC DNA örneğine butanol O-doymuş ve vorteks karıştırın. Santrifüj 1 dakika boyunca 13.400 x g'de kanşım ve yeni bir 1.7 ml mikrofon alt sulu faz transferirotube. Bu işlemi altı kez tekrarlayın.
12. 3 M sodyum asetatın 1/10 hacmi ve bir butanol ekstre BAC DNA,% 100 etanol içinde 2.5 hacim ekleme ve buz üzerinde 10 dakika boyunca inkübe edilerek EtBr içermeyen BAC DNA Çökelme. Santrifüj 10 dakika boyunca 13.400 x g'de çökelti 1 ml% 70 etanol ile DNA pelet yıkayın ve santrifüj ile yeniden pelet.
13. 10 dakika için DNA pelletini hava-kurutun ve TE tamponu (pH 7.6) içinde 200 ul içinde çözülür.
    Not: Şekil 4 JEV SA ₁₄ -14-2 için ters genetik sistemin bir özetini göstermektedir.

6. Doğrusallaştırılmış Tam uzunluktaki JEV BAC DNA in vitro olarak sentetik RNA'ların uyarlamak

1. Büyük çaplı bir sınırlama enzimi sindirimi gerçekleştirme pBAC / SA ₁₄ 37 ° C'de (3 ug DNA, 60 U enzim, 1 x sindirim tampon ve 1 x BSA içeren) 100 ul'lik bir toplam hacimde Xba I ile -14-2 12-15 st bekletilmiştir. D bir 3 ul tablet incelemek/ ml EtBr 0,5 ug ihtiva eden bir% 0.8 agaroz jeli üzerinde igestion reaksiyonu.
2. 2 saat boyunca 30 ° C'de (Şekil 4A) de, mung fasulye nükleaz 25 U (MBN) ile daha fazla sindirim reaksiyonu inkübe edin.
3. _DH 2 O ile 300 ul Xba I-sindirilmiş, MBG-işlenmiş numune hacmini getirin 10 dakika boyunca 13.400 x g'de, şiddetli bir şekilde 1 dakika için spin seyreltilmiş örnek, girdap ve daha sonra yeni bir 1,7 ml'lik üst sulu faz transferi (1: 24: 25) izoamil alkol: kloroform: fenol eşit hacimde ekleme Mikrotüp. Kloroform eşit miktarda ekleyin ve çıkarma işlemi tekrarlayın.
4. Etanol çökeltme ile, fenol / kloroform ekstre, doğrusallaştırılmış BAC kurtarma: 3 M sodyum asetat 10/01 hacim% 100 etanol içinde 2,5 sayılarını ve 20 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. Santrifüj 10 dakika boyunca 13.400 x g'de Çökelti,% 70 etanol içinde 1 ml DNA pelet yıkama ve sonra da yeniden santrifüjleme ile aşağı döndürün.
5. DNA Pelle Hava kuruması10 dakika boyunca t dH _{2 O} 30 ul içinde çözülür 0,5 ug / ml EtBr (Şekil 5A) ile bir% 0.8 agaroz jeli üzerinde kazanılan BAC bir 1 ul tablet inceleyin.
6. ~ 200 ng DNA örneği, 0.8 mM kap analog [m ⁷ G (5 ') ppp (5'), A], 1 mM rNTPs ihtiva eden 25 ul (toplam hacim içinde doğrusallaştırılmış BAC DNA bir çalışma transkripsiyonu gerçekleştirmek, 40 U RNaz inhibitörü, 1 saat boyunca 37 ° C'de (Şekil 4B), 20 U SP6 RNA ^polimeraz, 72 ve 1 x transkripsiyon tamponu). Dahil 0.5 uM ^[3H] DE-81 filtre kağıdı adsorpsiyon ile denetlendiği haliyle ^[3H] UTP esas olarak RNA ölçümü için UTP. ⁶⁹
7. 0,5 ug / ml EtBr (Şekil 5B) ihtiva eden bir% 0.6 agaroz jeli üzerinde run-off transkripsiyon reaksiyonu bir 1-2 ul tablet çalıştırın.

7. RNA enfektiviteyi ve Virüs Verim belirleyin

1. Yetiştirmek BHK-21 150 mm kültürlerdeki hücrelerin% 5 _CO2 ile 37 ° C 'de 24 saat boyunca 3 x 10 ⁶ hücre / tabak yoğunluğunda yeniden yemekler.
   Not:% 10 fetal sığır serumu, 2 mM glutamin, vitaminler, ve penisilin / streptomisin ile takviye edilmiş a minimal esas ortamı içinde BHK-21 hücreleri koruyun.
2. Soğuk çözelti, A (137 mM NaCI, 2.7 mM KCI, 8.1 mM Na ₂ HPO ₄ ve 1,5 mM KH ₂ PO ₄₎ 10 ml hücre tekli tabakası durulayın. Tripsin-EDTA (% 0.25), 4 ml ile muamele ile tabaklardan hücreleri ayırın ve 2 dakika için bir masaüstü santrifüj 270 x g'da santrifüjleme ile bunları toplamak.
3. 2 dakika için 50 ml konik bir tüp ve santrifüj 270 x g'da hücre süspansiyonu soğuk çözelti A 50 ml hücre pelletini. Bu yıkama prosedürü üç kez tekrarlayın; Son yıkamadan sonra, Sol A. 2 x 10 ⁷ hücre / ml bir yoğunlukta hücre pelletini tekrar süspansiyon
4. 2 μ olan hücre süspansiyonu 400 ul tablet karıştırın980 V, 99 mikro-sn darbe uzunluğu ve 5 darbeler (Şekil 4C): 2 mm aralığı küvet içinde sentetik RNA g ve derhal uygun elektroporasyon koşulları altında bir elektroporatörü Karışımı elektroporasyona.
   Not: daha fazla saflaştırılmadan doğrudan elektroporasyon için Protokol 6,5 sentezlenen ^3H-etiketli RNA kullanın.
5. 10 dakika boyunca oda sıcaklığında Elektroporasyona tabi tutulan hücreler boş ve tam kültür ortamı içinde 600 ul ihtiva eden bir 1.7 ml'lik bir mikrotüp aktarın.
6. Tam kültür ortamı içinde 1 ml elektroporate edilmiş hücrelerde bir 10-kat seri seyreltme hazırlayın ve 6 oyuklu plaka içerisinde unelectroporated BHK-21 hücreleri (5 x 10 ⁵⁾ tek tabakaları üzerinde, her seyreltme 100 ul tablet plaka.
7. Inkübasyondan 4-6 saat sonra,% 10 cenin sığır serumu ihtiva eden minimum gerekli ortamda% 0.5 agaroz ile hücrelerin kaplaması. % 5 _CO2 ile 37 ° C 'de 4 gün boyunca inkübe edin.
8. Bulaşıcı merkezi görselleştirmeks% 5 etanol ²⁷ (Şekil 6A) içinde% 1 kristal viyole ile% 7 formaldehit ve boyama ile tespit ile (plaklar).
   1. İsteğe bağlı: imünoflüoresan deneylerinde ^27,73 (Şekil 6B) ile JEV protein ekspresyonu için 18-20 saat sonra transfeksiyon RNA-elektropore hücreleri incelemek ve virüs için 22 ve 40 saat sonra, transfeksiyondan RNA-elektroporate edilmiş hücrelerde süpernatantlar hasat plak deneyleri ^27,63 (Şekil 6C) tarafından titrasyonu.

Sonuçlar

Tüm pozitif sarmallı RNA virüsü için bir karşıt genetik sistem güvenilirliği ve etkinliği olan dizisi viral genomik RNA'nın konsensüs sekansına denk bir klonlanmış tam boy cDNA'dan genetik stabilitesi, bağlıdır. ²⁷ Şekil 1, bir beş göstermektedir JEV SA BAC gibi tam uzunlukta enfeksiyon cDNA yapımı için aşamalı bir strateji ₁₄ -14-2 ^28: Aşama 1, JEV enfekte BHK-21 hücreleri (Şekil 1A), hücre kültürü üstte yüzen kısmından viral RNA'nın saflaştırılması; Aşama 2, tüm viral genomun (Şekil 1B) kapsayan birbiriyle çakışan dört cDNA amplikonlarının (F1 ila F4) sentezi; PBAC / F4 (Şekil 1C) için pBAC / F1 oluşturma Aşama 3, bir BAC vektörüne bitişik dört cDNA parçalarının her birinin alt-klonlama; Aşama 4, SP6 RNA polimeraz, yani in vitro Çoğaltma transkripsiyonu için klonlanmış cDNA modifikasyonu, bir SP6 yerleştirerekpromoter dizisi, bir sessiz bir nokta mutasyonu sokulmasıyla nükleotid 9131 de önceden var olan bir iç Xba I bölgesi elimine viral 5'-ucunda (pBAC / F1 ^SP6) hemen üst tarafından, bir ⁹¹³⁴ T (pBAC / F3 ^KO) ve ekleme → Viral 3'-ucunda (pBAC / F4 ^RO) (Şekil 1D) hemen aşağı tarafında, yeni bir yapay Xba I run-off yer; ve Aşama 5, tam uzunlukta bir montaj SA ₁₄ -14-2 cDNA BAC, pBAC / SA ₁₄ -14-2 (Şekil 1E). Tablo Klonlama işleminde kullanılan oligonükleotidler 1 listeler. ²⁸

Fonksiyonel JEV cDNA yapımı için, ilk önemli adım RT-PCR için bir şablon olarak saflaştınlmış viral RNA kullanılarak, dört örtüşen cDNA fragmanlarının sentezidir. 2 olan dört RT-PCR ürünleri için temsili bir sonuç sağlar Şekil % 0.8 üzerinde elektroforezagaroz jel. Bu jel, bir tam uzunlukta cDNA JEV dört örtüşen cDNA fragmanları amplifiye olduğunu açık bir şekilde göstermektedir. Bazen, Rt-PCR reaksiyonu için cDNA sentezi / amplifikasyon prosesi esnasında primerlerin spesifik olmayan tavlamanın, istenen ürün daha çok küçük olan bir ya da daha fazla ilave virüse spesifik veya spesifik olmayan ürünler elde olabilir. Diğer taraftan, çok az veya hiç RT-PCR ürünü, viral RNA izolasyonu veya uygun olmayan RT-PCR performans sırasında kazara RNaz kirlenme amplifiye beklediği.

Bir sonraki anahtar aşaması, bir kısmi ya da tam uzunluktaki standart rekombinant DNA teknikleri kullanır nispeten basit bir işlemdir BAC JEV cDNA klonlanması ve bir modifikasyonudur. ⁶⁹ Şekil 3 içeren BAC klon saflaştırılması için temsili bir sonuç sunulur CsCI-EtBr gradyanı bantlayarak JEV SA ₁₄ -14-2 tam boyda bir cDNA.Bu deneyde, 401.700 x g'de 16 saat santrifüj işleminden sonra, iki farklı bantları, yani, E. Yukarıda coli kromozom DNA'sı ve aşağıdaki süper-BAC plasmid DNA'sı uzun dalgalı ultraviyole ışığı altında borunun ortasında görebilir. Alt BAC DNA bandının minimum bir hacmi (~ 400 | il) dikkatli bir şekilde borunun yan tarafında bulunan bir şırınga ile bir delik alay ile toplandı. Daha sonra, EtBr bütanol ekstre BAC DNA elde edildi ve EtBr içermeyen BAC DNA, etanol çökeltme ile konsantre edilmiştir.

Son adım, permisif hücreler içine RNA transfeksiyonundan (Şekil 4) sonra, tam uzunluktaki SA ₁₄ -14-2 BAC (pBAC / SA ₁₄ -14-2) in vitro olarak transkripsiyonu sentetik RNA'ların spesifik enfeksiyon belirlenmesidir. 3 'de Adım 1, tam uzunluktaki doğrusallaştırma SA ₁₄ -14-2 cDNA: Bu adım, üç ardışık adımları içerir-end viral genom (Şekil 4A); Aşama 2, run-off transkripsiyon (Şekil 4B) ile doğrusallaştırılmış cDNA'dan sentetik RNA'ların üretimi; ve Aşama 3, sentetik RNA'ların (Şekil 4C) ile transfekte edilen BHK-21 hücrelerinde rekombinant virüslerin kurtarma. Deneysel olarak, pBAC / SA ₁₄ -14-2 iki adet bağımsız klon Xba I sindirimi ile doğrusallaştırılmış ve Xba I sindirimi ile oluşturulan dört bazlı 5 'çıkıntı kaldırmak için MBN ile muamele edilmiştir. Doğrusallaştırılmış BAC etanolle çökeltme izlenmiş ve fenol-kloroform ekstraksiyonu ile temizlendi. Saflaştırılmış olan iki BAC'lerin doğrusallaştırma bir% 0.8 agaroz jeli (Şekil 5A) ile gösterilmiştir. Fenol-kloroform ekstraksiyon linearize BAC'ler RNaz ücretsiz olmasını sağlamak için çok dikkatli yapılmalıdır. İki linearize BAC'lerin her bir m, ⁷ G (5 ') ppp mevcudiyetinde SP6 RNA polimerazı kullanılarak Çoğaltma transkripsiyonu için bir cDNA şablon olarak kullanıldı (5') Bir kapak benzeri. Sentetik RNA'ların bütünlüğü referans 1kb DNA çaprazı (Şekil 5B) ile birlikte,% 0.6 agaroz jeli üzerinde, iki transkripsiyon reaksiyonu karışımları alikotları çalıştırarak gördü. Bu basit bir deneyde, büyük bir belirgin RNA bandı her zaman sadece geçirilmiş 3 kb altında DNA bandı başvuru ve keskin olduğu ortaya çıktı. Ancak, RNA aynı jel üzerinde bir bulaşmış bir görünüm olurdu bozulmuş.

Bulaşıcı bir merkez tahlil sentetik RNA'ların spesifik enfeksiyon belirlenmesi için altın standarttır. Bu deney, (3 x 10 ⁵ hücre / çukur) saf BHK-21 hücreleri ihtiva eden 6 oyuklu plakalar içinde 10-kat seri olarak seyreltilmiş elektroporate edilmiş hücrelerde eşit hacimde tohumlama, RNA örnekleri ile BHK-21 hücrelerini elektroporat ve agaroz çakıştırılarak yapıldı Hücre mono tabakaları üzerine. 4 gün süreyle inkübe edildikten sonra, kalan hücreler formaldehid ile sabitlendi ve kristal mor ile boyandı sların çözüme hücreleri (Şekil 6A) içine verilecek, enfeksiyöz RNA moleküllerinin sayısına karşılık gelir enfeksiyonlu merkezlerden (plaklar) sayısını ölçmek için. In vitro transkripsiyonu için kullanılan cDNA şablonu olmayan bulaşıcı olması için, kanıtlanmıştır yana transkripsiyon reaksiyon karışımı ^27, bir kısım, doğrudan elektroporasyon için kullanılmıştır. Elektroporasyon RNA transfeksiyonundan için tercih edilen yöntemdir; Alternatif olarak, RNA DEAE-dekstran ve katyonik lipozomlar kullanılarak diğer yöntemler ile transfekte edilebilir. RNA elektroporasyon çok etkili olmakla birlikte, elektrik akımının "ark" Tuzlar elektroporasyon reaksiyonunda ya da elektroporasyon küveti yeniden, mevcut nadir oluşur. RNA-transfekte edilmiş hücrelerde viral proteinlerin ekspresyonu bir anti-NS1 tavşan antiserumu (Şekil 6B) kullanılarak imüno-deney ile araştırılmıştır. RNA-transfekte edilmiş hücrelerin yüzer maddeleri içinde biriken viral parçacıkların üretimi olan birplak deneyleri (Şekil 6C) tarafından alyzed. Bu deneylerin sonuçları, bir cDNA türevli sentetik RNA'ların rekombinan virüslerin yüksek titresi üreten permisif BHK-21 hücrelerinde enfeksiyon olduğunu açık bir şekilde göstermektedir.

Oligonükleotid	Sekans, bir (5 'ila 3'),	Pozisyon b	Polarite
1RT	TAGGGATCTGGGCGTTTCTG GCAAAT	2578-2603	Antisens
1F	aatcccgggAGAAGTTTATC TGTGTGAACTT	1-22	Duyu
1R	attgcggccgcCCACGTCGT TGTGCACGAAGAT	2532-2553	Antisens
2RT	TTCTGCCTACTCTGCCCCTC CGTTGA	5975-6000	KarıncaISENSE
2F	aatcccgggTCAAGCTCAGT GATGTTAACAT	1800-1821	Duyu
2R	attgcggccgcGATGGGTTT CCGAGGATGACTC	5929-5950	Antisens
3RT	ACGGTCTTTCCTTCTGCTGC AGGTCT	9426-9451	Antisens
3F	aatcccgggGAGGATACATT GCTACCAAGGT	5500-5521	Duyu
3R	attgcggccgcGTAAGTCAG TTCAATTATGGCT	9380-9401	Antisens
4RT	AGATCCTGTGTTCTTCCTCA CCACCA	10.952-10.977	Antisens
4F	aatcccgggAGTGGAAGGCT CAGGCGTCCAA	9200-9221	Duyu
4R	attgcggccgcAGATCCTGT GTTCTTCCTCACC	10.956-10.977	Antisens
SP6F	cataccccgcgtattcccac ta		Duyu
SP6R	ACAGATAAACTTCTctatag tgtcccctaaa	1-14	Antisens
F1F	aggggacactatagAGAAGT TTATCTGTGTG	1-17	Duyu
F1R	TGGATCATTGCCCATGGTAA GCTTA	638-662	Antisens
X1F	CGAATGGATCGCACAGTGTG GAGAG	8403-8427	Duyu
X1R	AAAGCTTCAAACTCAAGATA CCGTGCTCC	9120-9148	Antisens
X2F	GGAGCACGGTATCTTGAGTT TGAAGCTTT	9120-9148	Duyu
X2R	cacgtggacgagggcatgcc tgcag		Antisens
ROF	CCAGGAGGACTGGGTTACCA AAGCC	10.670-10.694	Duyu
ROR	agggcggccgctctagAGAT CCTGTGTTCTTCCTCACCAC	10.954-10.977	Antisens
Bir JEV dizileri büyük harflerle gösterilir ve BAC dizileri küçük harflerle belirtilir. b nükleotid pozisyonu JEV SA 14 -14-2 (Genbank erişim numarası JN604986) tam genom sekansı anlamına gelir.

Tablo 1: cDNA sentezi, PCR büyütmesi ve BAC mutagenezi için kullanılan oligonükleotidler.

Figür 1.0, Strateji BAC olarak JEV SA ₁₄ -14-2 bir tam boy cDNA'dan yapımı için JEV partiküllerden viral RNA'nın (A) izolasyonu.. JEV SA ₁₄ -14-2 genomik RNA bir şematik diyagramı gösterilmiştir. Tüm viral genomu kapsayan (B) dört örtüşen cDNA parçalarının Sentezi (F4 F1). PBAC / F4 pBAC / F1 yaratan bir BAC vektörü içine dört örtüşen cDNA fragmanlarının (C) Altklonlaması. In vitro olarak run-off transkripsiyonu için klonlanmış cDNA'lar (D) modifikasyonu. pBAC / F1 ^SP6 viral 5'-ucunda akış yukarı SP6 başlatıcısı dizisini ihtiva pBAC / F1 bir türevidir. pBAC / F3 ^KO sessiz nokta mutasyonu (T → A ^9134, yıldız) içeren pBAC / F3 bir türevidir. pBAC / F4 ^RO viral 3'-ucunun alt baş yapay Xba I run-off siteyi içeren pBAC / F4 bir türevidir. (E strong>) tam uzunlukta SA ₁₄ -14-2 BAC Meclisi (pBAC / SA ₁₄ -14-2). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

JEV SA ₁₄ -14-2 tam uzunlukta genomik RNA kapsayan Şekil dört örtüşen cDNA fragmanlarının 2. N- (F1 ila F4). Dört RT-PCR ürünleri,% 0.8 agaroz jeli içinde elektroforez ile değerlendirilir. M, 1 kb DNA merdiveni. Dört cDNA fragmanlarının beklenen boyutları jel görüntüsünün altında belirtilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

/ftp_upload/53164/53164fig3.jpg "/>
JEV bir tam boy bir cDNA SA ₁₄ -14-2 ihtiva eden BAC Şekil 3. saflaştırılması. BAC plazmid E. izole edilir SDS-alkalin lisiz yöntemi ile coli DH10B ve ayrıca bir CsCl-EtBr gradyanı şeritleme ile saflaştırılmıştır. 16 × 76 mm yapışmalı polipropilen tüp kullanarak CsCl-EtBr degrade bir örnektir sunulmuştur. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

JEV SA ₁₄ -14-2 cDNA BAC monte tam uzunlukta bir bulaşıcı virüslerin geri kazanımı Şekil 4. bakış., CDNA şablonunun (A) doğrusallaştırılması. JEV BAC ile kesilir tam uzunluktaXba I ve MBN ile muamele edilmiştir. RNA transkriptlerinin (B) Sentezi. Doğrusallaştırılmış cDNA m ⁷ G (5 ') ppp (5'), bir başlık analogunun varlığında, SP6 RNA polimeraz tarafından transkribe edilmektedir. Sentetik JEVs (C) Kurtarma. In vitro transkripsiyonu RNA'lar sentetik bir virüs titresi yüksek üretir elektroporasyon ile BHK-21 hücrelerine transfekte. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Bir cDNA, şablon olarak tam boyda JEV BAC kullanılarak in vitro transkripsiyon Şekil RNA'lar 5. sentezi. Linearize tam uzunlukta JEV BAC, pBAC / SA ₁₄ -14-2 (A) üretimi. PBAC İki bağımsız klon/ SA ₁₄ -14-2 (Cl.1 ve CL.2) MBN ile Xba I ile sindirim ve daha sonra tedavi ile lineerleştirilebilir edilir. Doğrusallaştırılmış BAC% 0.8 agaroz jeli içinde elektroforez ile incelenmiştir. Çoğaltma transkripsiyonu ayrıca, sentetik RNA'ların (B) üretimi. İki linearize BAC'lerin her SP6 RNA polimeraz Çoğaltma transkripsiyonu için bir şablon olarak kullanılır. İki transkripsiyon reaksiyonları alikoları% 0.6 agaroz jeli üzerinde çalıştırılır. M, 1 kb DNA merdiveni. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tam uzunlukta bir JEV BAC ve sentetik virüsün geri transkribe sentetik RNA'ların Şekil 6. Belirli enfeksiyon. BHK-21 hücreleri, fr türetilmiş RNA transkriptleri ile (Mock), elektroporasyona-sahte veya elektroporasyona olantam uzunlukta JEV BAC (Cl.1 ve CL.2) iki bağımsız klon, her om. (A) RNA enfekte. Hücreler agaroz ile örtüldü ve post-transfeksiyon 4 gün sonra kristal mor ile boyandı. RNA enfekte hücrelerin (sol panel), elektroporasyona enfeksiyöz RNA miktarını tahmin etmek için enfeksiyöz merkezi deneyleri ile belirlenir. Ayrıca enfeksiyonlu merkezlerden temsili görüntüleri (sağ panel) gösterilmiştir. (B) Protein ifadesi. Hücreler 4 oyuklu oda slaytlar kültürlenir. 20 saat post-transfeksiyon (hpt) RNA-elektroporate edilmiş hücrelerde viral protein ifadesi, bir birincil anti-NS1 tavşan antiserumu ve ikincil bir Cy3-konjüge edilmiş keçi anti-tavşan IgG (kırmızı) ile imüno-tahlilleri ile analiz edilir. Çekirdekleri 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (mavi) ile ters. Immunofloresan görüntüleri bunlara karşılık gelen diferansiyel girişim kontrast görüntülerde üst üste. (C) Virüs verimi. Hücreler 1 kültürlenir50 mm kültür yemekleri. 22 ve 40 hpt RNA-electroporated hücrelerinin kültür yüzer biriken enfeksiyöz virionlann üretim plak tahlilleri tarafından incelenir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışma

Mevcut protokolü başarılı bir şekilde, iki farklı suşları (CNU / LP2 ²⁷ ve SA ₁₄ -14-2 ²⁸⁾ JEV,, fonksiyonel cDNA kanıtlamıştır oluşturmak için doğal zor bir flavivirüs ve tam uzunlukta enfeksiyon cDNA klonlarının üretilmesi için kullanılmıştır Çünkü konakçı hücre toksisitesi ve klonlanmış cDNA'dan genetik instabilitesi yaymak ^8,74-76 Bu protokol, üç ana bileşeni içerir:. yüksek kalitede ters transkriptaz kullanılarak viral RNA'nın bir cDNA sadık bir kopyasının sentezi / amplifikasyon maksimize, birinci / bir DNA polimerazı; ikinci olarak, son, tam uzunlukta cDNA takımı adımları alt klonlama başlangıç ​​cDNA'dan çok düşük kopya sayılı vektör BAC (yayınlanmamış veriler), toksik sekanslar ihtiva eden viral prM-E kodlama bölgesini ^74,77,78 klonlanması; ve üçüncü, görünüşe göre daha büyük bir DNA INSE tolere 120-350 kb, ^19-21 arasında bir ortalama boyutu olan bir yabancı DNA için uygun bir klonlama vektörü kullanılarak BACdaha rts başka klonlama vektörleri yapmak. Bu klonlama yaklaşımı birçok pozitif sarmallı RNA virüsleri, ~ 10 ila 32 kb'lik bir büyük RNA genomu olan, özellikle de genel olarak geçerli olacaktır. Genom konukçu hücre ribozomlar tarafından proteinler çevrilir viral mRNA görür, çünkü enfeksiyon cDNA klonunun Generation, özellikle de pozitif sarmallı RNA virüsleri için, RNA virüs bir karşıt genetik sistem geliştirilmesi önemli bir adımdır. Bu durumda, viral replikasyon duyarlı bir konakçı hücreye bir cDNA kaynaklı genom uzunlukta RNA molekülünün yerleştirilmesi suretiyle başlatılabilir. Bulaşıcı JEV cDNA klonunun durumu, yeniden birleştirici DNA teknolojisi ile birlikte kullanıldığında, bu tip gen ekspresyonu ^73,79 ve genom replikasyonu gibi, moleküler seviyede viral yaşam döngüsünün çeşitli yönlerine ilişkin anlaşılmasını artmıştır. ^63,64 Ayrıca, tam uzunluktaki cDNA klonu JEV antiviral aşı ²⁸ ve gen iletim vektörleri gelişimi için değerli bir alet olduğu kanıtlanmıştır. ^80,81

Tüm pozitif sarmallı RNA virüsleri gibi, yüksek derecede bulaşıcı RNA'lar, in vitro olarak sentezlenebilir olan JEV için güvenilir bir fonksiyon cDNA'yı oluşturmak birden çok kritik adım vardır. İdeal olarak, tam uzunluktaki cDNA klonu transkribe sentetik RNA'ların dizisi viral genomik RNA, viral RNA replikasyonunun başlatılması için gerekli olan, özellikle 5'- ve 3'-terminal dizilerinin aynı olmalıdır . ^60-62 mevcut protokol otantik 5 've 3-uçları geçen alt baş viral genomunun birinci adenin nükleotid üst akışında SP6 promotör sekansını yerleştirilmesi ve yapay benzersiz Xba I sınırlama sitesi konumlandırılması sağlanmıştır sırasıyla, viral genomun timin nükleotid. Bir Xba I ile doğrusallaştırılmış ve MBN ile tedavi edilen cDNA te run-off transkripsiyonu ile üretildi otantik 5 've 3' uçları olan sentetik RNA'ların Kapaklımplate m ⁷ G (5 ') ile prime SP6 RNA polimerazı ppp (5'), bir başlık kullanarak analog. Bu protokol, çeşitli şekillerde değiştirilebilir. Bu içinde mevcut değilse, in vitro transkripsiyon için, bir bakteriyofaj RNA polimeraz (örneğin, T3 ya da T7) iyi tanımlanmış promotör sekansı ile bağlantılı olarak kullanılabilir. ^27, bir çalışma-dışı sitesi olarak, farklı bir kısıtlama alanı kullanılabilir doğrusallaştırılmış cDNA'dan viral genom ve eğer sentetik RNA otantik 3 'ucu ile biter. Sentetik RNA, 3 'ucunda üç veya dört virüs ilişkisiz nükleotidini ihtiva ettiği zaman, 3'-ucu nükleotid dizisinin önemi RNA enfekte bir ~ 10 kat azalma ile gösterilmiştir. Bir in vitro transkripsiyon reaksiyonunda ^27, her iki m ⁷ G (5 ') ppp (5'), A ve m ⁷ G (5 ') ppp (5') G kap analog 5 viral ikinci yerleri ne kadar alakasız bir ekstra G nükleotid yukarı aynı kalitede kullanılabilir '-end, ancakİlave enfeksiyon veya sentetik RNA replikasyonunu değiştirmez. ²⁷ Ayrıca, DNase I sindirimi ile RNA transkriptlerinden cDNA şablonu çıkarılması RNA enfekte testler için gerekli değildir, cDNA şablonu kendisi bulaşıcı değildir, çünkü. ²⁷

BAC teknolojisi artık pozitif sarmallı RNA virüslerinin, yani, iki JEVs, CNU / LP2 ²⁷ ve SA ₁₄ -14-2 ²⁸ (genom boyutu, ~ 11 kb) bir avuç enfeksiyon cDNA klonlarının oluşturulması uygulanmıştır; İki dang virüs, BR / 90 ²⁶ ve NGC ²⁹ (~ 11 kb); sığır viral diyare virüsü, SD1 (~ 12 kb) ²⁵ iki domuz vebası virüsleri, C ve Paderborn (~ 12 kb) ²⁴ sınır hastalığı virüsü, Gifhorn (~ 12 kb) ²⁴ domuz üreme ve solunum sendromu virüsü , PL97-1 / LP1 (~ 15 kb) ³⁰ bulaşıcı gastroenterit virüsü, PUR46-MAD (~ 29 kb) ¹⁶ kedi bulaşıcı peritonit virüsü,DF-2 (~ 29 kb) ³² ağır akut solunum sendromu coronavirus, Urbani (~ 30 kb) ⁹ MERS-CoV, EMC / 2012 (~ 30 kb) ¹⁷ ve insan koronavirüsü, OC43 (~ 31 kb) ³¹ cDNA yapımı için BAC'ler kullanılarak ana avantajı, büyük, 1- ya da 2-kopyalama BAC plazmidlerin yüksek genetik stabilitesidir.; Bununla birlikte, son derece düşük kopya sayısı iç yapısı nedeniyle BAC DNA ve kromozomal DNA'yı barındıran göre BAC DNA saflıkta azalmasının çok düşük verimleri, aynı zamanda büyük bir dezavantaj teşkil etmektedir. Geçerli protokolde, BAC DNA verimi E. büyüyen maksimize edilir coli DH10B bir besin açısından zengin bir ortamda, 2xYT içinde / bulaşıcı BAC pBAC ile SA ₁₄ -14-2 dönüştürdü. Bu çabaya rağmen, ortalama verim sadece ~ 15 ug 2xYT suyu 500 ml BAC DNA taşımaktadır. Ayrıca, BAC DNA saflığı en iyi temizleme için CsCl-EtBr yoğunluk gradyan santrifüj ile elde edilirOldukça yaygın olarak kullanılan kolon bazlı plazmid izolasyon daha. Ancak, akılda tutulması gereken önemli olduğunu BAC-dönüştürülmüş E. klonlanmış cDNA genetik istikrarı tehlikeye olabilir çünkü coli sarmak olmamalı ve yüksek büyüme mutlaka büyük verimleri veya daha yüksek saflıkta BAC DNA yol açmaz.

Burada açıklanan protokol JEV bir BAC olarak genetik olarak stabil, tam uzunlukta enfeksiyon cDNA klonunun inşaat ve yayılması için optimize edilmiş, etkili ve akıcı bir yöntemdir, bir prosedür bir kez pratik olarak imkansız düşünülmektedir. Bu, aynı klonlama stratejisi aynı zamanda pek çok diğer pozitif sarmallı RNA virüsü tatbik edilebilir. Genel olarak, bulaşıcı cDNA klonları, viral replikasyon ve patogenezinde biyolojik fonksiyonlarını incelemek için, bir viral RNA genomu içine mutasyon (örneğin, silmeler, girmeler ve nokta mutasyonları) çeşitli tanıtmak için olanak sağlar. Bu cDNA tabanlı ters genetik sistemi geliştirmek mümkün ve tes kılart aşısı ve belirli bir ilgi pozitif sarmallı RNA virüsü oluşturma faktörünü (ler) hedefleyen terapötik aday. Buna ek olarak, bu bulaşıcı cDNA'dan teknolojisi de biyomedikal araştırmalarda birçok uygulama için, ilgili bir yabancı gen (ler) ifade edebilen bir virüs vektörü olarak kullanılabilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1. Moleküler Klonlama
2xYT Et	Suyu Sigma-Aldrich	Y2377
[3H]UTP	PerkinElmer	NET380250UC	Radyoaktif
50 ml Tüp	Thermo Scientific (Nalgene)	3114-0050
250 ml Şişe	Beckman Coulter	356011
Agaroz	Lonza	50004
Agaroz (Düşük Erime Noktası)	Yaşam Teknolojileri (Invitrogen)	16520-100
AvaI	New England BioLabs	R0152S
AvrII	New England BioLabs	R0174S
BamHI	New England BioLabs	R0136S
BsiWI	New England BioLabs	R0553S
BsrGI	Yeni İngiltere BioLabs	R0575S
Butanol	Fisher Scientific	A399-1 & nbsp;
Sezyum	Klorür Fisher Scientific	BP1595-1
Kloramfenikol	Sigma-Aldrich	C0378
Kloroform	Sigma-Aldrich	C2432	Kanserojen
DE-81 Filtre Kağıdı	GE Healthcare Yaşam Bilimleri	3658-023
dNTP karışımı	Yaşam Teknolojileri (Invitrogen)	18427-088
E. coli DH10B	Yaşam Teknolojileri (Invitrogen)	18297-010
EDTA	Sigma-Aldrich	E5134
Etanol	Sigma-Aldrich	E7023
Etidyum Bromür	Sigma-Aldrich	E7637	Toksik ve yüksek mutajenik
Filtre Sütunu (Plazmid Maxiprep Kiti)	Yaşam Teknolojileri (Invitrogen)	K2100-26
Buzlu Asetik Asit	Sigma-Aldrich	A6283	Tahriş
Edici Glikoz	Sigma-Aldrich	G5400
Glikojen	Roche	10901393001
Yüksek Kaliteli DNA Polimeraz	New England BioLabs	M0491S
İzoamil Alkol	Sigma-Aldrich	I9392	Yanıcı
İzopropanol	Amresco	0918	Yanıcı
LB Et Suyu	Yaşam Teknolojileri (Invitrogen)	12795-027
Lityum Klorür	Sigma-Aldrich	L9650
Lizozim	Amresco	0663
Magnezyum Klorür	Sigma-Aldrich	M8266
M-MLV Ters Transkriptaz	Yaşam Teknolojileri (Invitrogen)	18080-044
Maş Fasulyesi Nükleaz	New England BioLabs	M0250S
İğne (18G, 20G)	BD	305196, 305175	Biyolojik Tehlikeli (Kesici alet atıkları)
NotI	New England BioLabs	R0189S
Oligonükleotid	Entegre DNA Teknolojileri	Özel Oligonükleotid Sentezi
PacI	New England BioLabs	R0547S
pBeloBAC11	New England BioLabs	ER2420S (E4154S)
Fenol (Tampon-Doymuş)	Yaşam Teknolojileri (Invitrogen)	15513-039	Toksik ve oldukça aşındırıcı
Fenol: Kloroform: İzoamil Alkol	Yaşam Teknolojileri (Invitrogen)	15593-031	Toksik ve yüksek derecede aşındırıcı
Fenol: Guanidin İzotiyosiyanat	Yaşam Teknolojileri (Ambion)	10296-010	Toksik, aşındırıcı ve tahriş edici
Pme I	New England BioLabs	R0560S
Potasyum Asetat	Amresco	0698
RNaz İnhibitörü	Yaşam Teknolojileri (Invitrogen)	10777-019
rNTP Seti	GE Healthcare Yaşam Bilimleri	27-2025-01
Sızdırmaz Polipropilen Tüp (16 & kez; 76 mm)& nbsp;	Beckman Coulter	342413
SfiI	New England BioLabs	R0123S
Sma I	New England BioLabs	R0141S
Sodyum Asetat	Sigma-Aldrich	S2889
Sodyum Dodesil Sülfat	Amresco	0227
Sodyum Hidroksit	Sigma-Aldrich	S5881
SP6 RNA Polimeraz	New England BioLabs	M0207S
Spin Kolonu (Plazmid Miniprep Kiti	)Yaşam Teknolojileri (Invitrogen)	K2100-11
Şırınga	HSW NORM-JECT	4200.000V0
T4 DNA Ligaz	New England BioLabs	M0202S
Tris	Amresco	0826
tRNA (maya)	Yaşam Teknolojileri (Invitrogen)	15401-011
XbaI	New England BioLabs	R0145S
Name	Company<	strong>Katalog Numarası	Comments
2. Hücre Kültürü
Alfa Minimal Esansiyel Orta	Yaşam Teknolojileri (Gibco)	12561-049
Konik Tüp (50 mL)	VWR	21008-242
Kristal Menekşe	Sigma-Aldrich	C0775
Kültür Kabı (150 mm)	TPP	93150
Küvet (2 mm Boşluk)	Harvard Aparatı	450125
Fetal Sığır Serumu	Yaşam Teknolojileri (Gibco)	16000-044
Formaldehit	Sigma-Aldrich	F1635	Toksik ve kanserojen
Glutamin	Yaşam Teknolojileri (Gibco)	25030-081
Minimal Esansiyel Orta Ömür	Teknolojileri (Gibco)	61100-061
Penisilin / Streptomisin	Yaşam Teknolojileri (Gibco)	15070-063
Potasyum Klorür	Sigma-Aldrich	P3911
Potasyum Fosfat Monobazik	Sigma-Aldrich	P9791
Altı Kuyulu Plaka	TPP	92006
Sodyum Klorür	Sigma-Aldrich	S3014
Sodyum Fosfat Dibazik	Sigma-Aldrich	S3264
Tripsin-EDTA (%0.25)	Yaşam Teknolojileri ( Gibco)	25200-056
Vitaminler	Sigma-Aldrich	M6895
İsim< / güçlü >	< güçlü > Şirket< güçlü >	< güçlü > Katalog Numarası< / güçlü >	< güçlü > Yorumlar< / güçlü >
< güçlü >3. Ekipman< / güçlü >
Agaroz Jel Elektroforez Sistemi	Mupid	MPDEXU-01
CO2< / sub> İnkübatör	Thermo Scientific	Heracell 150i
Masaüstü Santrifüj ve nbsp;	Thermo Scientific	ST16R Elektroporatör
	Harvard Aparatı	ECM 830
Uzun Dalga Ultraviyole Lambalar (El Tipi)	UVP	UVGL-58
Masaüstü Santrifüj	Beckman Coulter	368826
Thermocycler	Yaşam Teknolojileri (Uygulamalı Biyosistemler)	GeneAmp PCR Sistemi 9700
Vortekser	Bilimsel Endüstriler	G-560
Su Banyosu	Jeio Tech	WB-10E