Yöntem makalesi

Çabuk In Situ Melezleme

DOI:

10.3791/53165

⸱

23 Eylül 2015

 ,  ,  , 
1Ross University School of Veterinary Medicine, 2Charles E. Schmidt College of Medicine, Florida Atlantic University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, paraformaldehit preekli beyin için ideal olan hızlı ve basitleştirilmiş bir in situ hibridizasyon yöntemini tanımlar, böylece taze donmuş dokular kullanılırken uzun süreli karmaşık adımlara olan ihtiyacı azaltır. Yöntem, sıçanlarda serotonin 5-HT2A reseptör geni htr2a'nın tanımlanması kullanılarak doğrulanmıştır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

3,4-Metilendioksimetamfetamin (MDMA; ecstasy) toksisitesi, akut serotonin (5-hidroksitriptamin; 5-HT) sendromuna bağlı serotonerjik mRNA ekspresyonunda bölgeye özgü değişikliklere neden olabilir. Bu hipotez, serotonin 5-HT2A reseptör geni htr2a'yı tespit etmek için in situ hibridizasyon kullanılarak test edilebilir. Geçmişte, radyoaktif riboprob kullanan bu tür prosedürler, gerçekleştirilmesi birkaç gün süren karmaşık iş akışı ve tekniğin RNaz içermeyen bir ortamda tutulan taze donmuş dokuların kullanılmasını gerektirmesi nedeniyle zordu. Son zamanlarda, kısa oligonükleotid probların geliştirilmesi, in situ hibridizasyon prosedürlerini basitleştirmiş ve laboratuvarlarda daha yaygın olarak bulunan paraformaldehit preekli beyin bölümlerinin kullanımına izin vermiştir. Burada, önceden eklenmiş beyin dokuları üzerinde radyoaktif olmayan oligonükleotid probları kullanan ayrıntılı bir protokol tarif ediyoruz. Bu çalışma için kullanılan hibridizasyon probları arasında dapB (dihidrodipikolinat redüktaz için kodlayan bir bakteri geni), ppiB (peptidilprolil izomeraz B'yi kodlayan bir temizlik geni) ve htr2a (5-HT2A reseptörlerini kodlayan bir serotonin geni) bulunur. Bu yöntem nispeten basit, ucuz, tekrarlanabilir ve tamamlanması için iki günden az bir süre gerektirir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Serotonin (5-hidroksitriptamin; 5-HT) sendromu, antidepresanlar 1 gibi 5-HT'yi teşvik eden ilaçlarınneden olduğu akut bir nörolojik bozukluktur ve aynı zamanda MDMA'nın eğlence amaçlı kullanımı durumlarında da ortaya çıkar2. Akut sendromla ilişkili olarak ortaya çıkan duygudurum değişimleri, öğrenme ve hafıza eksikliklerinden sorumlu moleküler mekanizmalar iyi anlaşılmamıştır3,4. İn situ hibridizasyon, potansiyel olarak tek hücre düzeyinde eksprese edilen spesifik mRNA'ların saptanmasına ve miktarının belirlenmesine izin veren güçlü bir araştırma aracıdır. İn situ hibridizasyonun gerçekleştirilmesinin geleneksel yolu, ilgilenilen geni spesifik olarak hibritleştiren radyoaktif etiketli bir riboprob kullanmaktır. Bununla birlikte, önemli bir dezavantaj, yöntemin karmaşık ve zaman alıcı prob hazırlama ve hibridizasyon adımlarının yanı sıra RNaz içermeyen bir ortamda tutulan taze donmuş dokulara erişim gerektirmesidir5,6.

Oligonükleotid problar, riboproblar7 için gerekli olanlardan daha kısa RNA fragmanlarını hibritleştirmek için yakın zamanda geliştirilmiştir. Ayrıca, problar, özgüllükten8 ödün vermeden düşük bir arka plan sinyali üretir. Bu yeni geliştirilen prob teknolojisi, immünositokimya laboratuvarlarında yaygın olarak bulunan paraformaldehit preekli beyin dokuları üzerinde yerinde hibridizasyonda kullanılabilir.

Burada, paraformaldehit önceden sabitlenmiş sıçan beyninde oligonükleotid probları kullanarak yerinde hibridizasyon için bir protokol açıklıyoruz ve bulguları taze donmuş beyinde belirtilenlerle karşılaştırıyoruz5,6. Bu protokol, MDMA madde kötüye kullanımının beyindeki 5-HT2A reseptör geni htr2a mRNA'da değişikliklere neden olduğu hipotezini test etmek için kullanılır. Prosedüre MDMA tedavisi ile başladık, ardından hayvanın paraformaldehit doku perfüzyonu, thr2a probunun in situ hibridizasyonu, veri analizi yapıldı. DapB'nin (dihidrodipikolinat redüktazı kodlayan bakteri geni) negatif kontrol olarak ve ppiB'nin (peptidilprolil izomeraz B'yi kodlayan temizlik geni) pozitif kontrol olarak kullanıldığını unutmayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aşağıda açıklanan Hayvan kullanım prosedürleri Veteriner Ross Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) ve Florida Atlantic University tarafından onaylanmıştır. Steril teknikler ve eldiven gerekli olmasına rağmen, bu protokolü kullanarak, RNaz içermeyen ortamda gerekli değildir.

1. Hazırlık

  1. Doku hazırlanması ve kesit
    1. Üç gruba rastgele Fareleri atama:;, SAL / öneki ve / 3,4-metilendioksimetamfetamin önüne taze / tuz (% 0.9 NaCI SAL) (MDMA, Tablo 1'de ayrıntıları bakınız).
    2. 2 saat aralığında SAL ve MDMA grupları, intraperitonal, sırası ile 1 ml / kg SAL ve 10 mg / kg MDMA üç doz uygulayın. Hayvanlar 6 gün boyunca tedavi hayatta izin verin.
    3. 7. günde, 5 mg kombinasyon halinde 100 mg / kg ketamin uygulama / periton içine derin bir anestezi için sıçanlarda (kadar ksilazin kg, yani kornea yanıp sönme ve ta kaybıil) refleksleri çimdik.
    4. Taze / SAL grubunda, hızlı fareleri başını kesmek ve (referans 5 detaylarını görmek) taze beyin testi için beyin kaldırmak.
    5. SAL / öneki ve öneki / MDMA grupları için, sternum yaklaşık 10 -12 cm boyunca bir kesim yapmak ve daha sonra sternum sonunu maruz.
    6. Hemostatla sternum ucunu tutun ve keskin bir makas ile her iki tarafta yanal diyafram kesilmiş ve sonra akciğerlere kaburga ve paralel boyunca yukarı kesti.
    7. Tek bir el ile, küçük forseps ile kalbin ventral ucunu tutun. Öte yandan ile, 18 G şırınga iğnesiyle sol ventrikül delmek (buz soğukluğunda SAL ve paraformaldehit konteyner ve peristaltik pompa için bir Y-şekilli silikon hortum ile bağlantılı olan iğne bağdaştırıcı yönüne dikkat edin, bakınız, referans 9).
    8. Akış hızı (~ 5 ml / dk) orta düzeyde SAL pompası açın ve getiri circ kaçmasını sağlamak için forseps ile sağ atrium delinmeulation. 30 dakika boyunca SAL perfüzyon koruyun.
    9. Orta düzeyde paraformaldehid pompası açın ve buz gibi soğuk% 4 paraformaldehid 30 dakika süreyle hayvan serpmek için izin verir.
    10. Perfüzyon aleti çıkarın ve hayvan başını kesmek. Kafatası orta hat boyunca kesilmiş bir posteroanterior yapın ve sonra kafatası boşluğu 10 maruz kafatası flap.
    11. Kafatası boşluğundan bir spatula ile beyin çıkarın ve 25 ml% 4 paraformaldehid içeren 50 ml'lik bir santrifüj tüpüne beyin yerleştirin. 24 saat süreyle 4 ° C buzdolabı da paraformaldehid içeren tüp içinde beyin tutun.
    12. 3 gün boyunca 4 ° C'de% 30 sukroz çözeltisi 25 ml içeren 50 ml'lik bir santrifüj tüpü içine beyin taşıyın. Son olarak, kullanıcı kadar -80 ° C'de plastik torbalar içinde beyin saklayın.
    13. Gömme medya ile bir aynanın üzerinde beyin takın ve -26 ºC sıcaklıkta bir kriyostat beyin içeren gömme medya dondurma. Taze dondu Cutn 20 mikron bölüme beyin ve 10 mikron bölüme beyin paraformaldehid-öneki. Bölümüne slayt dokunarak RT mikroskop lamı bölümü aktarın.
    14. Hava, kuru 4 saat oda sıcaklığında karıştırıldı. Kullanım kadar -80 ° C'de sıkı kapatılmış torbaya bölümü slaytlar saklayın.
  2. Dehidrasyon
    1. -80 ° C derin dondurucuda slaytları alın ve üç testleri içine bölümleri atayın: HT2A, ppiB (pozitif kontrol) ya da dapB (negatif kontrol); işareti ve bir tükenmez kalem ile etiket bölümleri (kalem kullanmayın). 5 dakika boyunca oda sıcaklığında% 100 alkol slaytlar daldırın. Davlumbaz 5 dakika boyunca slaytlar kurulayın.
  3. Tedavi öncesi
    1. Pipet slaytlar bölümlerine Tedavi öncesi-1 reaktif 20 ul (alkalin fosfataz inaktivasyonu). Bir nem tepsisine bir raf ray üzerinde slaytlar yerleştirin (tepsi reaksiyon solutio buharlaşma önlemek için yüksek nem korumak için bir kapak ile örtülü olduğuna dikkatn).
    2. Yavaşça 10 dakika için düşük hızda yatay çalkalayıcı üzerinde nem tepsisini sallayın. 2 dakika boyunca iki kez damıtılmış su (GKD 2 O) ile iki kez slaytlar yıkayın. (Paraformaldehid sabitleme ile indüklenen çapraz-bağların kırılması) ön tedavi-2 reaktifin 150 ml içeren 200 ml'lik bir cam slayt daldırın. 100 ° C (RNA yapısı 11 ısı ile indüklenen restorasyonu) 5 dakika toplam slaytlar kaynatılır.
    3. 2 dakika boyunca GKD 2 O ile iki kez slaytlar yıkayın. 5 dakika boyunca% 100 alkol slaytlar yerleştirin. Bir çeker ocak içinde 5 dakika için slaytlar kurutun. Doku bölümünde seçilen alanın etrafında bir daire çizmek için bir hidrofobik kalem kullanın (örneğin, Şekil 2'de belirtildiği gibi talamus ve hipotalamus dahil olmayan kortikal yapılar).
    4. Pipet Ön İşlem-3 reaktifi Seçilen her alana (prob penetrasyon artış) 10 ul ve kapaklı nem tepsisini kapatın. Hibridizasyon fırında tepsi yerleştirinYatay çalkalayıcı ile donatılmış ve 40 ºC de fırın sıcaklığını ayarlamak; yavaşça 30 dakika süreyle tepsiyi sallayın. 2 dakika boyunca GKD 2 O ile iki kez slaytlar yıkayın.

2. Hibridizasyon ve amplifikasyon

  1. Pipet seçilmiş alanlarda sırasıyla htr2a ppiB ve dapB prob reaktifler 10 ul,. Reaktifin buharlaşmasını önlemek için kapaklı nem tepsisini örtün. Yavaşça düşük hızda ayarlanmış yatay çalkalayıcı üzerinde sallayın. 2 saat boyunca fırında 40 ºC 'de slaytlar inkübe edin.
  2. 2 dakika için bir yıkama tamponu ile iki kez slaytlar yıkayın. Pipet seçilen her alanda Amplifikasyon-1 reaktif 10 ul, sallamak ve 30 dakika boyunca 40 ºC de slaytlar kuluçkaya yatmaktadır.
  3. 2 dakika için bir yıkama tamponu ile iki kez slaytlar yıkayın. Pipet seçilen her alanda Amplifikasyon-2 reaktif 10 ul, sallamak ve 15 dakika boyunca 40 ºC de slaytlar kuluçkaya yatmaktadır.
  4. İki kez w slaytlar yıkayın2 dakika için bir yıkama tamponu i. Pipet seçilen her alanda Amplifikasyon-3 reaktif 10 ul, sallamak ve 30 dakika boyunca 40 ºC de slaytlar kuluçkaya yatmaktadır.
  5. 2 dakika için bir yıkama tamponu ile iki kez slaytlar yıkayın. Pipet seçilen her alanda Amplifikasyon-4 reaktif 10 ul, sallamak ve 15 dakika boyunca 40 ºC de slaytlar kuluçkaya yatmaktadır.
  6. 2 dakika için bir yıkama tamponu ile iki kez slaytlar yıkayın. Pipet seçilen her alanda amplifikasyonu-5 reaktifi 10 ul sarsıntı ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe slaytlar.
  7. 2 dakika için bir yıkama tamponu ile iki kez slaytlar yıkayın. Pipet seçilen her alanda amplifikasyonu-6 reaktifi 10 ul sarsıntı ve 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe slaytlar. 2 dakika için bir yıkama tamponu ile iki kez slaytlar yıkayın.

3. Sinyal Algılama

  1. Seçilen her alana Kırmızı reaktif Pipet 10 ul (reaktif kırmızı-B ve Kızıl-A karışımı bir 1:60 oranında ve i kullanılması gerektiğini unutmayınmmediately). RT'de yatay çalkalayıcı üzerinde nem tepsisine slayt yerleştirin ve 10 dakika boyunca düşük bir hızda yavaşça sallayın.
  2. 10 dakika boyunca (GKD 2 O) ile iki kez slaytlar yıkayın. 15 dakika fırında 60 ºC 'de slaytlar kurulayın. 5 dakika boyunca davlumbaz altında ksilen slaytlar yerleştirin. Pipet 20 Seçilen her alanda ksilen bazlı montaj medya ul ve bir lamel ile kaplayın.

4. Görüntü Yakalama

  1. 4 × ve 20 × objektif lens büyütme ile seçilmiş alanlarda (örneğin, hipotalamus, 1 ve 3 Şekiller) dijital Mikro fotoğraflar çekin. Görüntü dosyasını kaydedin.

5. Görüntü Parçacık Analizi

  1. Sürükle ve ana ImageJ penceresinin içine görüntü dosya açılır. Menü çubuğuna gidin ve 'Resmi' seçeneğini, yanındaki açılır menüden 'Tip' seçin ve '8-bit' seçeneğini seçin.
  2. Seçin 'Thr seçin' ayarlama 'eshold 'iletişim kutusunu açmak için. Istenmeyen arka plan çıkarılır, böylece iletişim kutusunda alt bar değerini ayarlayın. Daha sonra ikinci bir iletişim kutusunu açmak için 'Parçacıklar Analiz' seçeneğini menü çubuğuna gidin ve 'Analiz' seçeneğini seçin.
  3. 10'da partikül boyutunu ayarlama, yanındaki 'Show özetliyor' seçin ve 'sonuçlarını görüntüle "ve" özetlemek' kutularını seçin. Son olarak, iletişim kutularındaki parçacık verileri görüntülemek için 'Tamam' ı tıklatın.

6. Çizelge Hesaplama

  1. Excel sayfası içine verileri girin ve bir başlangıç ​​olarak SAL grubundaki parçacıkların sayıları ortalama. Her bölümün yüzde düzeyini hesaplamak ve bir grafik buna göre (Şekil 4) yapmak.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oligonükleotid RNA sondaları (<25 nt) kullanılarak, hibridizasyon paraformaldehit önekli ve taze dondurulmuş beyinlerinden hazırlanan hipotalamik hücrelerde kırmızı noktalar halinde tespit edilebilir. Htr2a mRNA molekülleri (bir katı oklar ile gösterilmektedir), bazı hücrelerde mevcut olan, ancak diğerleri (açık oklar) görülmektedir. Biz paraformaldehıt-öneki ve taze donmuş dokular (Şekil 1) arasında hiçbir fark olmadığını gözlemledik. Başarılı bir melezleşme çıplak gözle (Şekil

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İn situ hibridizasyon testinin en büyük endişelerinden biri, RNaz enzimleri nedeniyle RNA'nın korunması için kullanılan uygun tekniklerin seçilmesidir. Bu enzimlerin hücrelerde ve çevrede yaygın olarak bulunduğu ve sonuçları etkileyebileceği iyi bilinmektedir. Bununla birlikte, enzim aktivitesi, dokuyu kuru buz/alkol çözeltisine5,12 yerleştirerek hızlı bir şekilde ayırt edilebilir. Bir riboprob13 kullanılarak hibridizasyon için hızlı koruma kritik öneme sahip olsa da, oligonükleotit problar...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını var olduğunu beyan ederiz.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma NIH hibe (R15DA029863) tarafından desteklenmiştir, Florida Atlantic Üniversitesi lisans araştırma bursu (M30014) ve Veterinerlik Araştırma hibe Ross Üniversitesi. Biz bu iş için (±) 3,4-metilendioksimetamfetamin (± MDMA) sağlamak için Uyuşturucu Bağımlılığı Ulusal Enstitüsü (Rockville, MD) teşekkür etmek istiyorum.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
RNAscope Negatif Kontrol Probu-DapBGelişmiş hücre teşhisi, INC310098
RNAscope Pretreat 4İleri hücre teşhisi, INC320046
RNAscope 2.0 HD Reaktif Kiti - KırmızıGelişmiş hücre teşhisi, INC310036
RNAscope Probu - Rn-Ppibİleri hücre teşhisi, INC313921
Rat Htr2aGelişmiş hücre teşhisi, INC300031
KriyostatLeicaCM 1850
Yatay çalkalayıcıVWR88032-088
Hibridizasyon fırınıThermo Fisher Scientific222000
Superfrost Plus mikroskop lamıFisher Scientific12-550-15
Hidrofobik kalemVektörH-4000
MikroskopOlympusProvis AX70

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Muzyk, A. J., Jakel, R. J., Preud'homme, X. Serotonin syndrome after a massive overdose of controlled-release paroxetine. Psychosomatics. 51, 437-442 (2010).
  2. Davies, O., Batajoo-Shrestha, B., Sosa-Popoteur, J., Olibrice, M. Full recovery after severe serotonin syndrome, severe rhabdomyolysis, multi-organ failure and disseminated intravascular coagulopathy from MDMA. Heart Lung. 43, 117-119 (2014).
  3. Bosch, O. G., et al. Verbal memory deficits are correlated with prefrontal hypometabolism in 18FDG PET of recreational MDMA users. PLoS On. 8, e61234(2013).
  4. Smithies, V., Broadbear, J., Verdejo-Garcia, A., Conduit, R. Dysfunctional overnight memory consolidation in ecstasy users. J Psychopharmaco. 28, 751-762 (2014).
  5. Winzer-Serhan, U. H., Broide, R. S., Chen, Y., Leslie, F. M. Highly sensitive radioactive in situ hybridization using full length hydrolyzed riboprobes to detect α2 adrenoceptor subtype mRNAs in adult and developing rat brain. Brain Res Brain Res Proto. 3, 229-241 (1999).
  6. Zoeller, R. T., Fletcher, D. L., Butnariu, O., Lowry, C. A., Moore, F. L. N-ethylmaleimide (NEM) can significantly improve in situ hybridization results using 35S-labeled oligodeoxynucleotide or complementary RNA probes. J Histochem Cytoche. 45, 1035-1041 (1997).
  7. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diag. 14, 22-29 (2012).
  8. Wang, H., et al. RNAscope for in situ detection of transcriptionally active human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma. J Vis E. , (2014).
  9. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis E. , (2012).
  10. Mishra, A., et al. Imaging pericytes and capillary diameter in brain slices and isolated retinae. Nat Proto. 9, 323-336 (2014).
  11. Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval techniques: current perspectives. J Histochem Cytoche. 49, 931-937 (2001).
  12. Qin, Y., Heine, V. M., Karst, H., Lucassen, P. J., Joels, M. Gene expression patterns in rat dentate granule cells: comparison between fresh and fixed tissue. J Neurosci Method. 131, 205-211 (2003).
  13. Carter, B. S., Fletcher, J. S., Thompson, R. C. Analysis of messenger RNA expression by in situ hybridization using RNA probes synthesized via in vitro transcription. Method. 52, 322-331 (2010).
  14. Mijnster, M. J., et al. Regional and cellular distribution of serotonin 5-hydroxytryptamine2a receptor mRNA in the nucleus accumbens, olfactory tubercle, and caudate putamen of the rat. J Comp Neuro. 389, 1-11 (1997).
  15. Li, Q., et al. Brain region-specific alterations of 5-HT2A and 5-HT2C receptors in serotonin transporter knockout mice. J Neuroche. 84, 1256-1265 (2003).
  16. Horner, K. A., Gilbert, Y. E., Noble, E. S. Differential regulation of 5-HT2A receptor mRNA expression following withdrawal from a chronic escalating dose regimen of D-amphetamine. Brain Re. 1390, 10-20 (2011).
  17. Mocci, G., Jimenez-Sanchez, L., Adell, A., Cortes, R., Artigas, F. Expression of 5-HT2A receptors in prefrontal cortex pyramidal neurons projecting to nucleus accumbens. Potential relevance for atypical antipsychotic action. Neuropharmacolog. 79, 49-58 (2014).
  18. Reneman, L., et al. The acute and chronic effects of MDMA ('Ecstasy') on cortical 5-HT2A receptors in rat and human. 26, 387-396 (2002).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Paraformaldehit ile Tespit Edilmi BeyinHTR2A Gen Ekspresyonun lem ReaktifleriAmplifikasyon BasamaklarH zl K rm z SaptamaImage J AnaliziRNA Kantifikasyonu

İlgili makaleler