Yöntem makalesi

Membran Enzim Solvent Dynamics Bağlı çözülüyor Entropic Oranı İvme

9.5K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/53168

⸱

16 Ocak 2016

 , 
1Science for Life Laboratory, School of Biotechnology, KTH Royal Institute of Technology

Bu makalede

Özet

Enzimler su moleküllerinin taşınması için kanallar aktif bölge solvasyonu ve kataliz etkilemektedir. Bu yazıda siliko bilgisayar modellemesi ve deneylerde dayanarak bu ek katalitik motiflerin mühendislik için bir protokol mevcut. Bu enzim kataliz üzerindeki çözücü dinamiklerin etkisi anlayışımızı artıracaktır.

Özet

Enzim katalizi sulu bir ortamda evrimleşmiştir. Bununla birlikte, çözücü dinamiklerinin kataliz üzerindeki etkisi şu anda tam olarak anlaşılamamıştır ve genellikle ihmal edilmektedir. Enzimlerdeki su dinamiği ve buna bağlı termodinamik sonuçların incelenmesi oldukça karmaşıktır ve bilgisayar simülasyonları, nükleer manyetik rezonans (NMR) deneyleri ve kalorimetri içerir. Aktif bölgeyi çevredeki solvente bağlayan su tünelleri, solvent yer değiştirmesi ve dinamiğinin anahtarıdır. Buradaki protokol, özgüllüğü, aktiviteyi ve termodinamiği etkileyen su taşımacılığı için bu motiflerin mühendisliğine izin verir. Teori ve deneylere dayanan biyofiziksel bir çerçeve sağlayarak, burada sunulan yöntem, bilgisayar modelleme veya biyofiziksel kimya konusunda daha önce uzmanlığı olmayan araştırmacılar tarafından kullanılabilir. Yöntem, tıkalı su tünellerine sahip enzim varyantları tarafından kataliz ile ilişkili entalpik ve entropik değişiklikleri ölçerek moleküler düzeyde enzim katalizi anlayışımızı ilerletecektir. Protokol, zara bağlı enzimlerin ve diğer karmaşık sistemlerin incelenmesi için kullanılabilir. Bu, katalizde çözücünün yeniden düzenlenmesinin önemine ilişkin anlayışımızı geliştirecek ve aynı zamanda protein tasarımı ve mühendisliğinde yeni katalitik stratejiler sağlayacaktır.

Giriş

Su yaşam 1 kimyasının bir taşını oluşturmaktadır. Su desenleri ve enzim aktif sitelerin çözme entalpisi ve hidrofobik etkisi 2,3 ötesine uzanan oldukça karmaşık bir şekilde 1,2 ve kataliz 3 ligand entropi hem de etkiler. NMR 4, kalorimetre 2 ve çözünmüş proteinlerin moleküler modelleme ligand dernek 5-8, özgüllük ve aktivite 2,9,10 için itici bir kuvvet sağlayan açık su moleküllerinin rolüne ışık tutacak için kullanılır olmuştur. Bu yazıda Enzim kataliz üzerindeki çözücü deplasman termodinamik etkisi (Şekil 1) deneysel değerlendirilmesi için eşsiz bir metodoloji sunuyoruz. Bizim kombine strateji enzim mühendisliği ve termodinamik analizi (Şekil 1) ile uyum içinde bilgisayar simülasyonları kullanarak dayanmaktadır. Bu cata üzerine çözücü dinamiklerin etkisi ek aydınlatan sağlarŞu anda tam olarak anlaşılamamıştır parçalama.

Çözünmüş enzim aktif sitelerde su aracılı hidrojen bağları tarafından sağlanan enthalpic etkileşimleri, stabilize, entropik cezalar 1 mahsup edilebilir. Toplu 5 su ile karşılaştırıldığında bu entropik maliyetler protein boşlukları içinde kalan su molekülleri tarafından görüntülenen serbestlik derecesi azalma ile ilişkilidir. Sipariş su moleküllerinin serbest bırakma ve böylece ligand dernek 1 ve kataliz 3 için entropik itici gücünü sağlayabilir. Solvent dinamiklerinin önemli bir yönü proteinlerin iç ve dış solvent 4 arası su moleküllerinin değiştirmesidir. Aktivasyon enerjisi, entalpi, entropi ve 11 İlişikteki değişiklikler tamamen moleküler düzeyde anlaşılmış değildir. Aktivasyonuna enzimlerin suyun taşınması, çözücü dinamikleri önemi ve katkılarından dolayı sorumlu bireysel tüneller engelleyerekEnerji (Şekil 1) değerlendirilebilir. Ayrıca, farklı sıcaklıklarda tek kap kinetik deneyler yaparak çeşitli alt tabakaların göreli termodinamik aktivasyon parametreler, deneylerin sayısı azaltılmış (Şekil 1, sağ) elde edilebilir. Bizim disiplinlerarası yöntem ömrü 12 yüksek öneme sahip polisiklik terpenler oluşturmak karmaşık zara bağlı triterpen siklaz enzimleri onaylanmıştır. Protokol, standart bir santrifüj kullanılarak membran proteini yüksek miktarda (10-20 mg / L) geri kazanımını sağlar.

Enzimler, su gelişti rağmen, kataliz teşvik çözücü rolü genellikle ihmal edilir. Şekil geçiş durumuna 15 elektrostatik tamamlayıcılık aktif siteler önceden organize protein dinamikleri 13,14 ek olarak, su dinamiği, verimli enzim kataliz için yüksek öneme sahip olabilir. Birkaç disiplinlerarası teknikleri dövme, bizimAmaç su dinamikleri ve termodinamiğin son derece karmaşık bir çalışma kolaylaştırmaktır. Bilimsel topluluk bu araçları daha erişilebilir hale değişmiş faaliyetleri ve özellikleri için enzim mühendisliği ve protein tasarımında yeni stratejilerin geliştirilmesine yol açacaktır.

Protokol

1. Giriş Silico Bilgisayar Modellemesi

  1. Protein veri bankası (PDB) ilginin bir protein PDB yapısı indirin. Aşırı alt birimleri kaldırılması ve ardından "Hücre Nötralizasyon ve p K tahmin" YASARA 16 deney kullanarak eksik hidrojen atomlarını ve açık solvent ekleyerek yapıyı hazırlayın. Membrana bağlı triterpen siklazlar için, su kutusu uygun boyutları 91x67x77 Å bulunmaktadır. El katalitik olarak aktif amino asitler protonlanma durumunu ayarlayın.
    Not: PDB dosyasında bir alt-tabaka analog "Edit | takas | atom" kullanarak gerçek bir alt-tabaka için değiştirilebilir Gerekirse komutu.
  2. AMBER kuvvet alan suite 17 ile "Enerji minimizasyonu" komutu ile yapısını en aza indirin. Uzun menzilli elektrostatik etkileşimler için hesap parçacık örgü Ewald yaklaşımı (PME) 18 kullanın. Göre van der Waals etkileşimleri için cut-off Setstandart ayarlara.
    Not: yakınsama ulaşılana kadar "Enerji minimizasyonu" komutu sonra kısa dik iniş minimizasyonu, bir tavlama benzetimi ile yapısal stres ortadan kaldırır (timestep 2 FSEC, 0.9 her 10 inci adım tarafından küçülttüm atom hızları) gerçekleştirilir (yani, enerji gelişme ) 200 adımları sırasında atom başına en az 0.012 kcal / mol olarak.

Aktif Sitesi çözme ve Su Erişim 2. Model

  1. Tavlama benzetimi sonra, 20 NSEC moleküler dinamik (MD) yörüngesini çalıştırın ve "Dosya | Kaydet | Simülasyon Snapshot" en az 10 enstantane oluşturmak "Simülasyon On" izledi komuta. Kanonik toplulukta altında periyodik sınır koşulları ile standart bir bilgisayarda simülasyonlar çalıştırın. Bir Berendsen termostat kullanılarak 298 K sıcaklık koruyun.
  2. Tüm su molekülleri ve nihai ligandlar / maddeleri kullanarak silerek 2.1 elde edilen anlık hazırlayın4; Düzenle | Sil | Üst üste Kalıntı "orijinal PDB-yapısına ayrı komut Üst üste her anlık." | Object "komutu tüm yapıların aynı uzaysal konumunu paylaşan sağlamak, yeni bir PDB Bu şekilde hazırlanan her anlık kaydet. -dosya (kullanarak "Dosya | Farklı kaydet | PDB" komutu).
    Deneyimli modelleyicileri için: Not Ek Kod Dosya 1'de verilen şablona göre bu işlemi otomatik hale getirmek için bir komut dosyası yazın.
  3. Yazılım caver 3.0 19 girdi olarak 3D uzayda hizalanmış olan 2.2 den hazırlanan fotoğraf (PDB) kullanın. Anlık sınırlı sayıda analizi için, standart bir bilgisayar üzerinde Caver çalıştırın. Su moleküllerinin taşınması için özel olan tünellerin saptanmasını sağlamak için 0,7 Å 19 bir sonda yarıçapı kullanın.
  4. Bir moleküler grafik yazılımı Caver 3.0 tarafından oluşturulan tüneller gözünüzde canlandırın. Tünellerin kolay görsellik için, Ek Kod Fil gösterilen makro kullanmake 2.

Silico Enzim Mühendisliği 3. Su Desenleri ve Su Dynamics Değiştir

  1. Caver 3.0 yazılımından üretilen çıktı dosyası "Summary.txt" bölümünde listelenen başlığı "ID" göre yüksek sıralamadaki tünelleri tanımlayın.
  2. En üst sırada yer tüneller (3.1) ve bu ekran (2.4 elde edilen modeli kullanarak) görsel inceleme yoluyla kanal içine doğru bakan bir küçük yan zincir astar amino asitler tanımlayın. "Takas Kalıntı" komutunu kullanarak artan sterik engelleme ile tünel engeller tek amino asit yer değiştirmelerini tanımlayın. Tünel adımları protokolün 1.2-3.1 tekrarlayarak sonra görsel inceleme ile tıkalı ve emin olun.

Mutasyona uğramış genlerin 4. İfade

  1. Örtüşmeyen primerler 20 ile mutagenezi, PCR ile, vahşi tip gen mutasyonu tanıtmak.
  2. Tüpe ilgili geni içeren plazmid DNA eklemeuygun bir klonlama soyunun güçlü hücrelerle s ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. 42 ° C olarak ayarlandı sıcaklıkta bir su banyosu içinde 45 sn için bir ısı şoku dönüşümü gerçekleştirir. Taze zengin ortamdan 500 ul ekle (2YT, 16 g / L tripton, 10 g / L maya ekstresi, 5 g / L NaCl), 37 ° C'de inkübe, 45 dakika boyunca 200 rpm. Uygun antibiyotik ile takviye agar plaklarına dönüştürülmüş hücreleri kaplama ile bir seçim yapın.
  3. Mutasyona uğramış genin DNA dizisini doğruladıktan sonra, yukarıda tarif edildiği gibi, ısı şoku kullanılarak bir ekspresyon suşu plazmid DNA dönüşümü. Membrana bağlı triterpen siklaz ekspresyonu için, BL21 (DE3) kullanın.
  4. Uygun antibiyotikler ile takviye edilmiş ortam içinde 2YT-sentezleme suşu 37 ° C'de 5 ml O / N kültür başlatın.
  5. 0.05-0.09 nihai OD, uygun antibiyotik ile takviye edilmiş 300 ml 2YT ortam-ihtiva eden bir 2 L'lik bölmeli bir çalkalama şişesi inoküle (600 nm 'de ölçülür). 0.6-0 bir OD indüksiyon sonrası.8 ve protein ifadesi, 80 ° C'de hücre pelletini ve mağaza dondurma.
    1. Bir pD861 vektörü içinde zara bağlı triterpen siklazlar için, protein 21, yüksek verim elde etmek için 37 ° C'de 0.5 saat ifade mM ramnoz 2 ve 4 ile neden olur.

Normal Santrifüj ve Protein Saflaştırılması Kullanılması 5. Membran Ekstraksiyon

  1. Aşağıdaki tamponlar hazırlayın: Tekrar süspansiyona, tampon (100 mM potasyum fosfat, proteas engelleyici tabletleri ile takviye edilmiş, pH 7.5), deterjan tamponu (% 1 (v / v) Triton X-100, 50 mM potasyum fosfat, pH 7.5) eklendi ve reaksiyon tampon maddesi (0.2 % Triton X-100, 50 mM potasyum fosfat, pH 7.5).
    1. Skualen siklaz hopene veya daha düşük bir pH optimumuna sahip, diğer zara-bağlı enzimler için, sitrat ile yeniden süspansiyon haline getirme tamponu içinde potasyum fosfat değiştirin. Deterjan tamponu (% 1 Triton X-100: Bu tür enzim için, aşağıdaki tamponlar, 60 mM sitrat, pH 6.0) eklendi ve reaksiyon tampon maddesi (% 0.2 Triton-X 100, 60 mM sitrat, pH 6.0).
      Not: His-tag saflaştırılması için kullanılırsa, 20 mM imidazol (nihai konsantrasyon) ile yeniden süspansiyon haline tampon tamamlar.
  2. Bir cam beher içinde, bir donmuş hücre topağı tartılır. / Ml 0,3 g hücrelerin nihai bir konsantrasyona kadar bir homojenleştirici kullanılarak yeniden süspansiyon tamponunda tekrar süspansiyon hücreleri. % 80 genlik ve 1 saniye ve 1 saniye kapalı bir darbe ile ultrasonication tarafından Lyse yeniden süspanse hücreleri. 50 sn her üç tekrarlanan döngülerini kullanın.
  3. % 0.2 (h / h) deterjan nihai bir konsantrasyona kadar tampon, deterjan ekleyin. 1 saat süre ile 4 ° C 'de, karıştırma ucu-üzerinde-sonuna dengelenmesi. 4 ° C'de 50 dakika boyunca 39.000 x g'de tek bir santrifüj aşamasında sonra süpernatant kaydederek membran proteini fraksiyonu yeniden elde.
    Not: His-tag saflaştırma kullanılırsa, agaroz / g hücre, yaklaşık 1.5 ml Ni-NTA ekleyin ve 1 saat kuluçkada bırakın.
  4. Bir birinci arıtma işlemleriniiyon değişimi veya His-tag arıtma 21 ya adım. % 0.2 Triton X-100 ile dengeleme ve elüsyon tamponlarının Ek. Saflaştırılmış proteini 10 kDa'lık bir kesim ile Santrifüj Filtre Birimleri kullanılarak beş kez konsantre edilir.
    Not: deterjan konsantrasyonunda Triton X-100 miseller sonuçlar büyüklüğü yaklaşık olarak% 1 bir son konsantrasyona seyreltildi.
  5. . 10 6 × 2 × 10 4 -8 arasında küresel proteinler için bir fraksiyon aralığı ile uyumlu konsantre protein ve bir matris kullanılarak jel süzme parlatma adım arınma tamamlayın tampon olarak çalışan reaksiyon tamponu kullanın. Üreticinin protokolüne uygun olarak Bradford Ultra kiti kullanılarak saflaştırılmış protein miktarını ölçün.

6. Kinetik

  1. Reaksiyon tampon maddesi içinde alt-tabaka taze 5 mM stok solüsyonu olun. 2-5 dakika boyunca% 30 genliğinde ultrasonikasyon ile homojen bir emülsiyon elde edilir.
  2. Bir termomikser dengelenmesiistenen reaksiyon sıcaklığında gerçekleştirilir. Harici termometre ile cam şişe su içeren içindeki sıcaklığı kontrol edin.
  3. Tek substrat kinetikleri, aynı nihai alt yapı konsantrasyonu en az beş cam şişelere emülsiyon haline alt-tabakanın seyreltin.
    1. Birden fazla alt-tabakalar ile tek-kap göre kinetiği için, her bir küçük şişe içinde, tüm tabakaları karıştırarak en az beş eşit cam gibi tüp hazırlanır. Hidrofobik triterpenler için, 10-200 uM aralığı içinde son substrat konsantrasyonları kullanırlar.
  4. 10 dakika termomikser cam şişeleri Preincubate. Enzim ilave ederek reaksiyonu başlatın. 1 ml'lik bir toplam reaksiyon hacmi uygundur. En az 1200 rpm çalkalama hızı kullanın.
  5. 500 ul etilasetat ekleyerek farklı zaman noktalarında reaksiyonlar durdurun entegrasyon standart olarak 100 uM dekanol ile çivili.

7. Ekstraksiyon ve Termodinamik Analizi

  1. Ile reaksiyon karışımları ekstraktevorteks elle 1 dakika boyunca güçlü bir şekilde cam gibi tüp çalkalanarak. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca masa üstü bir santrifüj içerisinde 9600 xg'de cam şişeleri santrifüjleyin. Boş bir tüp üst tabaka (organik faz) aktarın. Reaksiyon tüplerine özütleme çözücüsü ilave bir 500 ul ilave edin ve ekstraksiyon prosedürü tekrarlayın.
  2. Na 2 SO 4 ile ekstre Reaksiyon karışımları kurutun. 5 saniye Vortex ve tüpler 10 dakika dinlenmeye bırakın. Bir masa üstü santrifüj kullanılarak oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 9600 x g'de santrifüj adımı nihai gerçekleştirin. Gaz kromatografisi (GC) flakon ayıklanır örnekleri aktarın.
  3. (Tek alt-tabaka kinetiklerinin) alt-tabakanın, en az dört farklı başlangıç ​​konsantrasyonuna ve (tek alt-tabaka ve rekabetçi kinetiği her ikisi için), dört farklı sıcaklıklarda, ilgi konusu her bir enzim varyantı için 6.1-7.2 altındaki adımları tekrarlayın.
  4. Daha önce 3 açıklandığı gibi GC-analiz gerçekleştirin. Hidrofob analizi için polar olmayan bir sütun kullanarakic pentasiklik ürünleri. Ürünleri ve sütun bağlı olarak, 120 ° C, başlangıç ​​fırın sıcaklığı ayarlamak ve 5 ° C / dakikalık bir sıcaklık gradyanı kullanılır.
  5. Ürün (ler) in entegre pik alanları ve (100 uM karşılık gelen) entegrasyonu standart alana sahip karşılık gelen bir ürün konsantrasyonlara ürün zirve alanları dönüşümü. Reaksiyon süresi (t) karşı her bir ürün ([P]) konsantrasyonunu çizilir. % 10'dan daha az dönüşüm tekabül eden veri noktalarının doğrusal regresyonu gerçekleştirin. Başlangıç ​​reaksiyon hızı (V 0) 'e göre, uydurulmuş çizginin eğimini ile elde edilir:
    figure-protocol-1
    Not: birden çok malzeme ile tek-kap göre kinetiği için, V 0, diğer alt-tabakaların etkisi altında, belirli bir alt-tabaka ilk oranıdır.
  6. Tek substrat kinetiği, arsa V 0 İçin / [E]. Belirgin k cat / K M değerine göre grafik doğrusal parçası eğimi ile verilir:
    figure-protocol-2
    [S] substrat ve konsantrasyonudur [E] dönüşüm. K cat kullanılan son enzim konsantrasyonu / K M, Michaelis sabiti üzerinde katalitik katsayısına denk gelmektedir. Her sıcaklık ve her enzim çeşidi için analiz tekrarlayın.
  7. Tek substrat kinetiği için, geçiş durumu teorisi 22 uygun bir termodinamik analizi gerçekleştirmek
    figure-protocol-3
    k b Boltzmann sabiti, h Planck sabiti, T Kelvin sıcaklık ve gaz sabiti R. K ((ln arsa bir lineer regresyon analizi yapın Kedi / K M) / ((k b * T) / h))) 1 / T karşı. Aktivasyon entalpisi (Δ H ‡) (-slope) * R ve aktivasyon entropi (Δ S ‡) (kesişme) * R tarafından verilen tarafından verilir.
    Not: Benzer şekilde, alt-tabaka saturasyon konsantrasyonu altındaki bir analiz denklem 3 sabit oran olarak k cat kullanılarak gerçekleştirilebilir.
  8. Birden substratları ile tek pota göreli kinetik için, bağıl belirgin elde
    k cat / 23 K M değerleri:
    (K cat / K M) A / (k cat / K M) B = V 0, A / V 0, B * [B] / [A] (4)
    ki burada V 0, bir alt tabaka, B ile rekabet alt tabaka A için, ilk oran değinmektedir
  9. Tek pota göreli ki'nin içinBirden substratları ile davi s, doğrusal olmayan regresyon ile, A olarak referans ile karşılaştırıldığında, B aktivasyon göreceli termodinamik parametreleri edinin:
    figure-protocol-4
  10. Aktivasyon entalpisi ve referans bileşik A entropi substrat B mutlak aktivasyon parametreleri hesaplamak:
    figure-protocol-5

Sonuçlar

Enzimatik polycyclization kataliz su dinamiklerinin önemi siliko analizi ve tespit edilen tünellerin sonraki görselleştirme (2 File Ek Kanununda komut dosyası kullanarak) tarafından alakalıdır. Protokol bölümünde 3 ardından, S168 Alicyc acidocaldarius gelen triterpen siklaz enziminin içinde tünellerin biri astar bir "sıcak nokta" amino asit kalıntısının (Şekil 1, sol orta) olarak bulunmuştur. Görsel denetim (Şekil 1, sol altta) tarafından görüldüğü gibi silico mutasyon S168F tanıştırarak, tünel tıkanmış.

Triterpen siklaz enzimi ile gösterildi: polisiklik ürünlerinin oluşumu için reaksiyon hızı sıcaklığı (Şekil 2A) için yüksek ölçüde duyarlıdır. Protokolü (bölüm 4-7) ardından, bulunan belirgin k cat / K o (Şekil 2A) ile yükseltildiğinde b> pentasiklik ürünlerinin oluşumu için, vahşi tip enzimin tarafından görüntülenen M elli misli arttırmaktadır. Tek bir nokta mutasyonu tek tek tüneller engelleme deneysel olarak belirlenen mutlak belirgin k cat / K M değerleri üzerinde önemli bir etkisi vardır, yanı sıra sıcaklık bağımlılığı (Şekil 2A) ile.

Deneysel olarak belirlenen kinetik parametreleri, doğrusal termodinamik araziler denklemi 3 ile ve tek substrat kinetiği (Şekil 2B) için protokol bölüm 6-7 aşağıdaki tarafından üretilir. Engellenen tüneller barındıran varyantlar için gözlenen aktivasyon entropi ve entalpi çok büyük değişiklikler (Şekil 2B dayalı Şekil 2C, hesaplamalar) önemli bir polycyclization kaskad teşvik su dinamikleri için rol ima eder. DahasıDeğişmiş su tünelleri aktivasyon bir değiştirilmiş Gibbs serbest enerjisi görüntüler ile varyantları (Δ G ‡ = Δ H ‡ - T * Δ S ‡ Şekil 2B-C). Örneğin, 303 K S168F tünel varyantı, yabani tip enzim için 16 kcal / mol ile karşılaştırıldığında 14 kcal / mol aktivasyon Gibbs serbest enerjisi gösterir.

Bölüm 7 protokolü sonrasında, denklem 4 tek pota kinetik deneyler ek yüzeylerde (Şekil 3A) için belirgin k cat / K M değerlerinin hesaplanması için izin verir. Ayrıca, doğrusal bir termodinamik arsa (Şekil 3B), farklı sıcaklıklarda (denklem 5) yarışma kompozisyon çalıştırarak yapılabilir. Tek substrat kinetikleri benzer bir şekilde, bir referans bileşiği ile karşılaştırıldığında daha fazla yüzeyler için göreceli aktivasyonu entalpi ve entropi readil olandoğrusal kesişim ve yamaç erişilebilir y deneysel verilere uyuyor. Aktivasyon termodinamik parametrelerin mutlak değerleri, referans bileşiği (denklem 6) ile ilişkili termodinamik veriler kullanılarak aritmetik ilave edilmesinden değerlendirilebilir. Burada protokolü kullanarak, sonuçlar açıkça engellenen su tünelleri farklı boyutlarda (Şekil 3C) ve alt tabakalar için aktivasyon temelde farklı termodinamik parametreleri görüntülemek membran enzimi varyantları olduğunu göstermektedir üretti.

figure-results-1
Şekil 1. Protokol özeti:. Deneysel protein tasarımı ve termodinamik analiz ile uyum içinde silico bilgisayar modelleme enzim kataliz üzerindeki çözücü dinamiklerin etkisiyle gelişmiş bir anlayış sağlar tıklayınızBurada bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için.

figure-results-2
Tek substrat kinetik yabani tip ve tünel varyantları aktivasyon Şekil 2. Termodinamik parametreler. (A) Görünür k cat / deneysel verilerden ve geçiş hali teorisi kullanılarak denklemler 1 ve 2 (B) Termodinamik analiz kullanılarak elde K M değerleri ve deneysel verilerinin doğrusal uygun (B) 'de işaretlerinden hesaplandı aktivasyon 3. (C) Termodinamik parametreleri denklem. Önceden katlanmış skualen substrat tahvilleri ile gösterilir oluşturulan / noktalı çizgiler olarak kırık. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-3
Farklı alt tabakalar için, vahşi tip ve tünel varyantlarının aktivasyon Şekil 3. termodinamik parametreler (A). Nispi k cat / denklemi 4. (B) kullanarak, tek-kaplı bir kinetik elde edilen K M değerleri farklı kinetik verilerin Termodinamik araziler denklem 5. (C) denklemi 6 ile ve referans olarak Şekil 2'de substrat skualen kullanılarak hesaplanan aktivasyon Mutlak termodinamik parametreleri kullanılarak sıcaklıkları. Oluşturulan / yüzeylerde kırık Tahviller noktalı çizgiler olarak gösterilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışma

Yabani tip membran enzimi ve tünel varyantlar için yüksek kaliteli, deneysel termodinamik verileri ulaşmada en kritik adımlar şunlardır: Bilgisayarınızın modeline 1) nesil; 2) homojen saflaştırılmıştır proteinler; 3) emülsifiye substrat stokları; 4) kinetik sırasında sıcaklığın kontrolü; Iç standart kullanılarak tepkime karışımlarından 5) elde edilmesi.

Bilgisayar modeli nesil ölçüde platformlarda çeşitli destekler kullanıcı dostu arayüzü ile bir yazılımın kullanımı kolaylaştırılmıştır. Dolayısıyla, bu protokol bile olmayan uzmanlar modelleme bizim strateji erişilebilir hale getirmek için YASARA modelleme paketi 16 yapılanır. Su tüneli tanımlanması için bir bilgisayar modelinin, ilgi 24 enzimin bir kristal yapısı dayanmalıdır. Bu amaç için, protein veri bankası uygun kristal yapılarının zenginliği çok faydalıdır. Bizim deneyim, tem başarılı hazırlanmasında önemli bir yönüyleTünel tanımlanması için plakalar kristalografik suları tutmaktır. Bu normal bir bilgisayarda çalıştırılabilir moleküler dinamik simülasyonları, yaparken bir çözülmüş enzim kutusunu kullanın eşit öneme sahiptir. Alicyc acidocaldarius gelen triterpen siklaz MD simülasyonları 3 esnasında su stabildir. Bununla birlikte, kristalografik deterjanlar tutmak ve / veya hücre membranı taklit eder kullanılarak belki de uzun bir MD simülasyonlar için izin vermek için potansiyel olarak kararsız enzimler için gerekli olacaktır. Bu tünel örgütün dinamik yönlerini ele olmaz, ancak son derece zorlu hedeflerin minimize kristal yapısı, protokolü kullanılarak önemli mekanik fikir verebilir öngörülmektedir.

Tek veya girdi olarak anlık sınırlı sayıda temel modda Caver 19, standart bir dizüstü bilgisayarda olmayan uzmanlar tarafından da kullanılabilir. Bizim deneyim 3, bir darboğaz yarıçaplı tüneller (yani, yarıçap dayanaraken dar noktasında) 1'den küçük Å kristalografik su molekülleri sol orta), tahmin edilen tünelin (Şekil 1 içinde ikamet, özellikle su son derece alakalı olabilir. Diğer yandan, daha büyük bir dar boğaz çapı ve aktif sitenin 10 üzerinden alt-tabakanın taşınması için bir tünel anlamına gelebilir. Tamamlayıcı Kodu komut 2. öngörülen tünellerin görünüm için olmayan uzmanlar tarafından kullanılabilir Dosya. Gelecek deneyler homoloji modelleri, su şebekeleri ve dinamikleri atomistik çalışma için izin yeterince yüksek çözünürlük olup olmayacağını ortaya koyacaktır. Ve aktif bölgede bulunan bir bağ olmadan, moleküler dinamik simülasyonları performans nasıl ışık tutan, tünel tanımlama süreci de önemli olacağını etkiler.

Membran proteinlerinin Kinetik zorlu bir 25 teşkil edebilir. Protokol, burada basit bir zar çıkarma protokolüne dayalıörneğin, bir ultra santrifüj gibi pahalı ekipman kullanılmaksızın membran enzim elde edildi. Son cilalama aşaması olarak jel filtrasyonu kullanımı potansiyeli artık zar partikülleri temizler ve uygun bir deterjan ortamı 25 tanımlamak için izin verir.

Protokolden tekrarlanabilir kinetik sonuçlar elde önemli bir yönü ultrasonication substrat stok çözelti emülsifiye etmektir. Reaksiyon tampon maddesi içinde seyreltilmiş, hidrofobik yüzeylere basit vorteksleme homojen olmayan alt tabaka, deterjan karışımları vermektedir. Olmayan emülsifiye edilmiş alt-tabaka çözeltilerinin pipetleme başlangıç ​​hızları doğru belirlenmesini önler (kantitatif GC ile teyit) 'tekrarı konsantrasyonlarına yol açar. Buna karşılık, doğru emülsiyon haline Stok çözeltilerin pipetleme 0.98-0.99 aralığında R 2 ile başlangıç ​​hızları lineer regresyon analizi ile sonuçlanmalıdır. Hidrofobik alt-tabakaların bir diğer önemli yönü görünür substrat çözünürlüğüdürve alt tabaka-deterjan karışımlarında kullanılabilirlik. Aslında, bu referans substrat skualen ile Triterpen siklaz doyurmak mümkün değildi. Bu nedenle belirgin k kedi / K M değerleri hem bağlayıcı ve kimya katkıları içerebilir hangi burada sunulmuştur. Ancak, kimya k kedi için sınırlayıcı hızı olduğu görülmüştür / triterpen siklazlar 3 tarafından yürütülen polycyclization kaskad K M.

Harici bir termometre ile bir reaksiyon cam bir şişe içindeki gerçek sıcaklık kontrol etmek için büyük önem taşımaktadır. Yine de, doğrusal uyan farklı sıcaklıklarda temel sabit görünen k cat / K M değerlerine sahip varyantlar için kötü olabilir. Bu sıfır (Şekil 2B ve 2C) yakın bir aktivasyon entalpisi ile S168F varyantı burada (Şekil 2A) için olduğunu vurguladı. Çok smalbelirgin k kedi l sıcaklığa bağlı değişimleri / K M, gözlenen aktivasyon entropi belirsizlik neden olabilir Δ S ‡ (yani, Şekil 2B'de doğrusal araziler kesişimi). Prensip olarak, gözlemlenen aktivasyon entropi aynı zamanda protein konsantrasyonu ölçülerek tespit olmaz farklı türevleri aktif enzim, farklı bir bolluk etkilenebilir. Bu tek bir kapta birden fazla alt-tabakaların karıştırırken deneysel hatalar azaltılır beklenmektedir. Farklı alt-tabakalar, bu, tüm koşullar altında enzim aynı miktarda (denklem 4) ile etkileşim olmasıdır. Bir ekstraksiyon çözücünün kullanımı, bir iç standart ekstre etme ve / veya GC-enjeksiyon sırasında farklılıkları hesaba önemlidir ile çivili.

Geçiş devlet teorisi başarıyla enzimoloji 26 kullanılmıştır. Bu önemli teorik çerçeve başlangıçta de oldugaz fazında tek moleküllü reaksiyonlar için veloped. Bununla birlikte, enzimlerin çoğu klasik aktivasyon enerji bariyerini 26 düşürerek çalışması gösterilmiştir. Tek, burada olduğu varsayılır iletim katsayısı ölçülen aktivasyon entalpisi ve / veya entropi etkileyebilir. Tünel katkısı ve bu geçiş halinin recrossing gibi diğer klasik olmayan etkiler, kabaca enerjide yaklaşık 4 kcal / mol tekabül kataliz 26 1000 kat katkıda bulunabilirsiniz. Bu (328 K, Şekil 2C, 16 kcal / mol), vahşi tip enzimin tarafından görüntülenen aktivasyon entropi muntazam olmayan bir aktarım katsayısı nedeniyle örneğin klasik olmayan etkileri çok daha büyük olduğu görülebilir. Protokolünü kullanarak vahşi tip ve tünel türevleri için aktivasyon termodinamik parametreleri karşılaştırırken iletim katsayısının etkisi azaltmak gerekir.

Aktivasyon Gibbs serbest enerjisi (Δ G ‡) bileşim olupBir enthalpic (Δ H ‡) ve Entropic hem sed (- T * Δ S ‡) terim. Kataliz sırasında enzimlerin Solvent yeniden yapılanma hem parametreleri etkileyebilir. Mevcut protokol gerekli biyofiziksel deneysel çerçeve ile ilgili ve silico kullanıcı dostu hesaplama araçları araç kutusu monte ederek bu olayların incelenmesini kolaylaştırmak bekleniyor. Yöntem, membrana bağlı enzimler ile kataliz içeren enzimatik yöntemlerle, bir bolluk çalışmak için faydalı olduğu düşünülmektedir.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

İsveç Araştırma Konseyi (VR), genç bir araştırmacı hibe #621-2013-5138 tarafından bu çalışmaya mali destek için büyük ölçüde kabul görmektedir. KTH Kraliyet Teknoloji Enstitüsü'ndeki PDC Yüksek Performanslı Bilgi İşlem Merkezi, hesaplama desteği sağladığı için kabul edilmektedir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
YASARAYASARA Bioscienceshttp://www.yasara.org/Moleküler modelleme ve simülasyon programı 
MAĞARACI CaverSofthttp://caver.cz/Proteinlerdeki tünellerin analizi için araç, akademik kullanım için ücretsiz lisans
Bradford UltraExpedeonBFU1L, BFU05L%1'e kadar deterjan içeren çözeltilerde protein kantitasyonu
Potter-Elvehjem homojenizatörVWR432-0205, 432-0217Donmuş hücre peleti
Proteaz İnhibitörü Kokteyl TabletlerininRoche4693159001Proteaz inhibitörü
Santrifüj Filtre ÜniteleriMiliporeUFC901008Protein konsantrasyonu için santrifüj filtre üniteleri, MWCO 10 kDa
Termomikser ve nbsp;Numune inkübasyonu içinEppendorf5382000015
homojenizasyonu Thermomixer

Kaynaklar

  1. Ball, P. Water as an active constituent in cell biology. Chem. Rev. 108 (1), 74-108 (2008).
  2. Snyder, P. W., et al. Mechanism of the hydrophobic effect in the biomolecular recognition of arylsulfonamides by carbonic anhydrase. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (44), 17889-17894 (2011).
  3. Syren, P. O., Hammer, S. C., Claasen, B., Hauer, B. Entropy is Key to the Formation of Pentacyclic Terpenoids by Enzyme-Catalyzed Polycyclization. Angew. Chem., Int. Ed. 53 (19), 4845-4849 (2014).
  4. Persson, F., Halle, B. Transient Access to the Protein Interior: Simulation versus NMR. J. Am. Chem. Soc. 135 (23), 8735-8748 (2013).
  5. Abel, R., Young, T., Farid, R., Berne, B. J., Friesner, R. A. Role of the Active-Site Solvent in the Thermodynamics of Factor Xa Ligand Binding. J. Am. Chem. Soc. 130 (9), 2817-2831 (2008).
  6. Michel, J., Tirado-Rives, J., Jorgensen, W. L. Energetics of Displacing Water Molecules from Protein Binding Sites: Consequences for Ligand Optimization. J. Am. Chem. Soc. 131 (42), 15403-15411 (2009).
  7. Pearlstein, R. A., Sherman, W., Abel, R. Contributions of water transfer energy to protein-ligand association and dissociation barriers: Watermap analysis of a series of p38α MAP kinase inhibitors. Proteins: Struct., Funct., Bioinf. 81 (9), 1509-1526 (2013).
  8. Young, T., Abel, R., Kim, B., Berne, B. J., Friesner, R. A. Motifs for molecular recognition exploiting hydrophobic enclosure in protein-ligand binding. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (3), 808-813 (2007).
  9. Matsuoka, S., et al. Water-Mediated Recognition of Simple Alkyl Chains by Heart-Type Fatty-Acid-Binding Protein. Angew. Chem., Int. Ed. 54 (5), 1508-1511 (2014).
  10. Pavlova, M., et al. Redesigning dehalogenase access tunnels as a strategy for degrading an anthropogenic substrate. Nat. Chem. Biol. 5 (10), 727-733 (2009).
  11. Breiten, B., et al. Water Networks Contribute to Enthalpy/Entropy Compensation in Protein-Ligand Binding. J. Am. Chem. Soc. 135 (41), 15579-15584 (2013).
  12. Oldfield, E., Lin, F. Y. Terpene biosynthesis: Modularity rules. Angew. Chem., Int. Ed. 51 (5), 1124-1137 (2012).
  13. Henzler-Wildman, K. A., et al. A hierarchy of timescales in protein dynamics is linked to enzyme catalysis. Nature. 450 (7171), 913-916 (2007).
  14. Tzeng, S. R., Kalodimos, C. G. Protein activity regulation by conformational entropy. Nature. 488 (7410), 236-240 (2012).
  15. Warshel, A. Electrostatic origin of the catalytic power of enzymes and the role of preorganized active sites. J. Biol. Chem. 273, 27035-27038 (1998).
  16. Krieger, E., Darden, T., Nabuurs, S. B., Finkelstein, A., Vriend, G. Making optimal use of empirical energy functions: Force-field parameterization in crystal space. Proteins: Struct., Funct., Bioinf. 57 (4), 678-683 (2004).
  17. Duan, Y., et al. A point-charge force field for molecular mechanics simulations of proteins based on condensed-phase quantum mechanical calculations. J. Comput. Chem. 24 (16), 1999-2012 (2003).
  18. Essmann, U., et al. A smooth particle mesh Ewald method. J. Chem. Phys. 103, 8577-8593 (1995).
  19. Chovancova, E., et al. CAVER 3.0: a tool for the analysis of transport pathways in dynamic protein structures. PLoS Comput. Biol. 8 (10), e1002708(2012).
  20. Zheng, L., Baumann, U., Reymond, J. L. An efficient one-step site-directed and site-saturation mutagenesis protocol. Nucleic Acids Res. 32 (14), e115/1-e115/5 (2004).
  21. Kürten, C., Uhlen, M., Syren, P. O. Overexpression of functional human oxidosqualene cyclase in Escherichia coli. Protein Express. Purif. , (2015).
  22. Eyring, H., Stearn, A. E. The application of the theory of absolute reaction rates to proteins. Chem. Rev. 24 (2), 253-270 (1939).
  23. Fersht, A. Structure and mechanism in protein science: a guide to enzyme catalysis and protein. , W.H. Freeman. (1999).
  24. Wendt, K. U., Poralla, K., Schulz, G. E. Structure and function of a squalene cyclase. Science. 277 (5333), 1811-1815 (1997).
  25. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim. Biophys. Acta, Biomembr. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
  26. Garcia-Viloca, M., Gao, J., Karplus, M., Truhlar, D. G. How enzymes work: analysis by modern rate theory and computer simulations. Science. 303 (5655), 186-195 (2004).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Enzim KataliziSu T nelleriCAVER 3 0Molek ler DinamikGe i Durumu TeorisiGaz KromatografisiEnzim Kineti iProtein M hendisli i
Membran Enzim Solvent Dynamics Bağlı çözülüyor Entropic Oranı İvme
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.