Microtoroid Optik Rezonatörler Kullanarak Etiket serbest Tek Molekül Algılama

Summary

Çözeltideki tek molekülleri tespit edebilen Frekans Kilitlemeli Optik Fısıldayan Evanescent Rezonator (FLOWER) olarak bilinen optik rezonatör teknolojisine dayalı, etiketsiz bir biyoalgılama sistemi geliştirdik. Burada bu çalışmanın arkasındaki prosedürler açıklanmakta ve sunulmaktadır.

Abstract

Aşağı tek bir molekül sınırına moleküllerinin küçük konsantrasyonlarını algılama gibi Hastalığın erken teşhisi ve moleküllerin davranışına temel çalışmaları gibi alanlarda bir etkiye sahiptir. Tek molekül algılama teknikleri yaygın, ancak etiket maliyeti ve karmaşıklığı artırmak, her zaman mevcut değildir ve olaylar çalışılan perturb böyle floresan etiket veya kuantum noktaları gibi etiketler kullanır. Optik rezonatörler ve etiket kullanılmaksızın tek moleküllerin tespit için umut verici bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Şu anda çözelti içinde olmayan plasmonically geliştirilmiş çıplak optik rezonatör sistemi tarafından tespit edilen en küçük parçacık 25 nm polistiren küre ^1'dir. Biz Optik Whispering Evanescent Resonator sulu çözelti ² etiket içermeyen tek bir molekül algılama bu sınırı aşmak ve elde edebilirsiniz (ÇİÇEK) Kilitleme Frekans olarak bilinen bir teknik geliştirdiler. Sinyal gücü partikül hacmi ile ölçekler gibi, bizim çalışma> 100x improveme temsilnt sanatın mevcut durumu üzerinde gürültü oranı (SNR) sinyalde. İşte ÇİÇEK arkasında prosedürleri alanındaki kullanımını artırmak amacıyla sunulmuştur.

Introduction

Tek moleküllü saptama deneyleri Hastalığın erken teşhisi için biyosensörler kullanılan analit miktarının azaltılması için faydalıdır, ve moleküllerin ³ temel özelliklerini incelemek için. Bu tür deneyler, tipik olarak etiketler, bununla birlikte, etiketler her olay üzerinde çalışılan yapabilirliğini bozmakta ve bu, maliyet artışı, belirli bir protein için elde etmek mümkün değildir, ve özellikle de bünyesinde deneyleri veya nokta-of, gerçek süre, rahatsız edici olabilir kullanılarak gerçekleştirilir bakım teşhis.

Etiket içermeyen biosensörleme şu anki altın standart Ancak, ticari yüzey plazmon rezonans sistemi tipik haliyle nM mertebesinde tespit tipik bir alt sınırı, yüzey plazmon rezonans ^4'tür. Son zamanlarda, optik rezonatörler etiket içermeyen tek bir molekül biodetection ⁵ için umut verici bir teknoloji olarak ortaya çıkmıştır. Uzun vadeli (ns) dayalı optik rezonatörler çalışma ışığı ^6,7 hapsi. Işık evanescently olduğunutipik bir fiber optik aracılığıyla bu cihazların içine birleştiğinde. Fiber geçiyor ışığın dalga boyu rezonatör rezonans dalga boyu eşleştiği zaman, verimli rezonatör çiftler yanar. Bu birleştirilmiş ışık tamamen dahili rezonatörün çevresinin yakınında genliği azalan bir alan üreten rezonatörün en boşluk içinde yansıtır. Parçacıklar rezonatör, parçacığın ⁸ hacmi ile orantılı olarak rezonatör değişiklikleri rezonans dalgaboyu kaybolan alan ve bağlayıcılığı girerken.

Algılama yeteneği açısından mikrosfer rezonatörler daha önce tek bir influenza A virüs partiküllerini (100 ^{nm), 9,10} tespit etmek için kullanılmıştır. Son zamanlarda, plasmonically geliştirilmiş mikroküre optik rezonatörler Ancak bu yaklaşım de yüzde 0.3 um ^{ila 2} tane çekim alanı sınırlar molekülleri ^{11 ve} 8-mer oligonükleotitlerin ¹² albumin, tek sığır serumu tespit etmek için kullanılmaktadıryardımcısı. Büyük çekim alanı biyosensörler parçacık algılama şansını maksimize etmek için idealdir. Büyük (> 100 mikron ²⁾ yakalama alanları ile Güncel çözüm tabanlı etiket içermeyen biyoalgı teknolojileri polistiren tanecikleri ≥ 25 nm tespit sınırlı kalmıştır.

Bu çözelti içinde tek moleküllerin zamana bağımlı algılama kapasitesine sahip optik Whispering Evanescent Resonator (çiçek) ¹³ (Şekil 1) kilitleme Frekans olarak bilinen optik rezonatör teknolojisine dayalı bir etiket içermeyen biyo-algılayıcı sistemi geliştirmiştir. ÇİÇEK frekans kilitleme geri besleme kontrolü, dengeli algılama ve tek bir protein molekülleri aşağı küçük partikülleri tespit etmek için hesaplamalı filtreleme ile birlikte microtoroid optik rezonatörlerin uzun foton ömrünü kullanır. Frekans kilitleme kullanımı süpürüp veya lazer dalga boyu üzerinden tarama gerek kalmadan, parçacıklar bağlamak gibi sistem daima microtoroid kayması rezonans izlemenize olanak sağlarBüyük aralığındadır. Çiçeğin ilkeleri plasmonik geliştirilmesi de dahil olmak üzere diğer tekniklerin algılama yeteneklerini geliştirmek için kullanılabilir. Aşağıda, ÇİÇEK gerçekleştirmek için prosedürler açıklanmaktadır.

Protocol

1. Deneysel Kurulum ve Numune Hazırlama

1. , Litografi kullanarak gravür ve daha önce ⁶ açıklanan prosedür erime microtoroids Üretiyor. Tipik olarak 80-100 um büyük bir çapa ve 2 um küçük bir çapa sahip olan, bir silikon göbek (çip) üzerinde microtoroids üretmektedirler.
2. Kabaca kendi fiber makaradan tek modlu fiber optik (125 mikron kaplama, 4.3 mikron mod alan çapı) bir metre gevşeyin.
3. Fiber optiğin çözülür bölümünün ortasında, tel şeritler kullanılarak optik elyafın yaklaşık polimer kaplama gibi küçük bir bölümünü (2.5 cm) şerit. Not: Bu microtoroid içine evanescently birkaç ışığa kullanılacak fiber optiğin kısmıdır.
4. Izopropanol alkol ve ücretsiz silin bir tüy bırakmayan soyulmuş lif temizleyin.
5. Tutucu mıknatıs yapılan bir lif tutucu kullanılarak yerinde lif bu bölümünü tutun.
6. Meltin tarafından ~ 500 nm İnce elimden lifg ve hidrojen meşale ve 60 mm / dak zıt yönlerde hareket eden iki step motorlar kullanılarak çekme. ~ 10 mm boyunda olmalıdır alev üst kısmı, iç fiber optik yerleştirin. Fiber boyunca transmisyon (kapalı fiber yanıp yanal olarak dağılmış ve ışık izleme) veya bir osiloskop bağlanmış bir foto diyot için elyafın bağlanması yoluyla görsel olarak izlenebilir olan dalgalı durduğunda lif çekme durdurma .
7. Fiber optik bir ucunu yarmak ve çıplak fiber adaptöre takın. Foto alıcı girişine içine lif bu ucunu yerleştirin.
8. Fiber çift fiber optik bağlayıcı kullanılarak lazer fiber makaranın diğer ucu.
9. Epoksi veya çift taraflı bant kullanarak bir numune tutucu üstüne microtoroid çip (paslanmaz çelik, 37.8 mm x 6,4 mm x 3,2 mm) yerleştirin.
10. (3 eksenli nano konumlandırma içeren bir konumlandırma kademesinin üzerine numune tutucuyu monte n3 eksenli mikrometre üstünde anocube) aşama (ekipman listesine bakınız). Titreşimleri en aza indirmek için bir pnömatik izole optik masa üzerindeki tüm deneyler.
11. Kaba pozisyon 3 eksenli mikrometre kullanarak örnek çip.
12. Nano-pozisyoner kullanarak optik fiber microtoroid içeren çip paralel hizaya getirin. Not: Giriş ışığı (~ 633 nm) bir dalga boyunun bir mesafede microtoroid hizalayın. Bu sürecin görselleştirme için iki görüntüleme sütunları kullanın üstünde ve çip tarafında konumlandırılmış (objektif lens ve kamera ile boru, ekipman listesine bakınız).
13. Bir in-line polarizasyon kontrolörü kullanarak optik fiber üzerinden yönlendirilen lazer ışığının polarizasyonu Optimize kutuplaşmayı ayarlamak için bir düğme ile (ekipman listesine bakınız). Not: fiber optik iletimi ölçülen dip dar göründüğünde Optimum polarizasyon elde edilir. Bir osiloskop (Daha fazla bilgi için adım 2.2) Bu dalış gözlemleyin.
14. Inşa etmekbir aralama olarak cam mikroskop lamı kullanılarak örnek sahne üzerinde bir cam lamel epoxying bir örnek odası. Not: Tüm kurulum kapsayan pleksiglas muhafaza hava akımları en aza indirmek için yararlı olabilir. Küçük bir açıklık boru kullanılarak pompalanan edilecek çözelti sağlamak için bırakılmalıdır.
15. Isı, bir RT su banyosunda (~ 500 mi) içinde ≥ 1 saat boyunca tanecik süspansiyonlar ya da tek-molekül sulu çözeltileri dengeye getirin. Not: Örnekler üreticiler, örneğin PBS veya HEPES belirtilen ilgili tamponlar kullanılarak mikrosantrifüj tüpleri içinde istenen konsantrasyona seyreltilir. Hiçbir bağlayıcı olay tespit edilirse, tampon tuz konsantrasyonu artırır.
16. ~ 2 sn çözümler (1 ml) kısaca içeren Vortex parçacık.
17. 1 ml numune bölmesine partikül içeren çözeltiler enjekte / 1 ml şırınga pompası kullanılarak Min.
18. Numune odası doldurdu sonra, şırınga pompası kapatın.
19. Kayıt verileri en aza indirmek için önce 30 saniye bekleyinölçümünü etkileyebilecek sıvı akışı kaynaklanan mekanik titreşimler etkileri.

2. Frekans Kilitleme

1. Bağlama sıvısının enjeksiyonu nedeniyle rahatsız olacak çünkü, nanopositioner numune tutucu hareket ettirerek fiber optik için toroid-çift Re.
2. Dalga boyu çeşitli yoluyla bilgisayar kontrollü giriş lazer tarama microtoroid rezonans dalga boyu bulun. Lazerin dalga boyunu düzenleyen lazer denetleyicisi içinde piezoelektrik eleman bir üçgen dalga gerilim sinyali göndererek bu adımı gerçekleştirin. Bu dalga boyunda suyun ışık düşük emme olarak orada görünür ışığı (2.5 nm ± 635 nm) kullanarak deneyler yapın.
3. Oto-dengeli foto alıcı içine fiber optik çıkışını takarak fiber optik aracılığıyla ışık geçirgenliği ölçün. BNC kablosu kullanarak bir osiloskop içine foto alıcı çıkışını takın. O gözlemleyinn osiloskop microtoroid rezonans dalga boyunda optik fiber üzerinden iletim düşer.
4. Bir kablo ile geribildirim denetleyicisi (ekipman listesine bakınız) kilitleme frekansı ana girişine foto alıcı çıkışını takın.
5. 2 kHz titreşim frekansı ve 19 fm dalga boyu titreşim genliği ile kilitleme üstü tepe kullanarak kilitlenme modunda frekans kilitleme geribildirim denetleyicisi çalıştırın. Ampirik Ziegler-Nichols ayar kurallarını ¹⁴ kullanarak yazılım penceresindeki oransal-integral-türev ayarlarını. Not: Bu değerler tüm deneyler başında bir kez ayarlanması yeterlidir.
6. Microtoroid rezonans dalga boyuna lazerin dalga boyu otomatik kilitleyin. Numune odasını doldurduktan sonra bu adımı gerçekleştirin. Not: dalgaboyu kayması çok büyükse, o zaman geri denetleyici kilidi kaybedecek ve otomatik rezonans dalgaboyu yerini bulmak için tarama moduna. Bu ocDalga boyu Curs yaklaşık bir çizgi genişliği (araştırılan tüm sistemler için en az 600 fm) daha büyük kaydırır.
7. 24 bit veri toplama kartı kullanarak 20 kHz geribildirim denetleyicisi çıkışını kaydedin. Veri toplama yazılımı ile bir metin dosyası olarak veri verir.

3. Veri İşleme ve Analiz

1. Fourier MATLAB'da verileri dönüştürmek.
2. Düşük 2 kHz dayatılan taklidinin frekansını çıkarmak için 1 kHz bir kesim ile bir "tuğla duvar" filtre kullanarak veri geçmek (Yan Kod Screenshot 1 Dosya bakınız).
3. Hesaplama çentik 16 Hz pencere boyutunu kullanarak verileri süzmek. Not: Bu, bu durumda, gürültü bilinen kaynaklarını ortadan kaldırmak için yapılır, 60 Hz, elektronik hat gürültüsü ve harmonikleri, (lazer sürücüsünden gelen) yanı sıra, 100 Hz ve harmonik (Yan Kod Screenshot 1 Dosya bakınız).
4. Ters Fourier zaman alanına geri verileri dönüştürmek.
5. Medyan filtre penceresini kullanarak veri1001 örneklerin boyutu (Yan Kodu Screenshot 2 Dosya bakınız).
6. Kerssemakers ve ark., ¹⁵ adım bulma algoritması kullanılarak rezonans dalga adım değişiklikleri bulun.
7. Her bağlama aşamasında genliği histogramları oluşturun.
8. Denklem kullanarak parçacık boyutunu hesaplayın. (1) (Tartışma).

Results

Olayları bağlayıcı Parçacık açıkça zaman (Şekil 2A) üzerinde microtoroid rezonans dalga adım gibi değişiklikler olarak görülmektedir. Bu adımların yükseklikleri. Şekil 2B'de, bir histogram olarak gösterilen 2-4, sırasıyla Örnek eksozom bağlanma izleri (nanovesicles), 5 mil silika boncuklar ve tek bir insan interlökin-2 moleküllerinin Şekil edilir. Adım gibi olaylar parçacık boyutu ile ölçek gerçeği tekniği doğru yapılmış olduğunu gösterir. Aşağıda tartı...

Discussion

Bir parçacık bağlanan olarak, toroid artar rezonans dalgaboyu (λ). Bir parçacık keser ise, rezonans dalga boyu buna (a step-down olayı) azalır. Parçacık çapı (d), her dalga boyunda adım amplitüdü histogramları yoluyla belirlenebilir. Her dalga boyu basamağın yüksekliği bağlı parçacık büyüklüğü varyasyonları nedeniyle partikül bağlayan microtoroid üzerinde konumu nedeniyle değişir. Parçacıklar elektrik alan (E _{0, max)} maksimum olduğu microtoroid ve ekvatorda bağladığınızda r...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ayarlanabilir diyot lazer	Newport	TLB-6300
Lazer denetleyici	Newport	TLB-6300-LN
Frekans kilitleme geri besleme denetleyicisi	Toptica Photonics	Digilock 110
Otomatik dengeli fotoğraf alıcısı	Newport	Model 2007
Hat içi polarizasyon kontrolörü	Genel Fotonik	PLC-003-S-90
24 bit veri toplama kartı	National Instruments	NI-PCI-4461
Rekombinant insan interlökin-2	Pierce Biyoteknoloji	R201520
20 nm polistiren boncuklar	Thermo Scientific	3020A
NanoCube XYZ Piezo Sahne	Fiziği Enstrümant	P-611.3
Optik tablo	Newport	VH3660W-OPT
Görüntüleme sütunu için objektif lens	Navitar Machine Vision	1-60228
Görüntüleme sütunu (adaptör tüpü)	Navitar Machine Vision	1-60228
Görüntüleme sütunu için Yüksek Çözünürlüklü CCD kamera	Edmund Endüstriyel Optik	NT39244