Nörobiyoloji ve nörovirolojide, insan nöronlarında in vivo olarak meydana gelenler için translasyonel bir model olarak hizmet eden güvenilir, tekrarlanabilir bir in vitro sisteme sahip olmak kritik öneme sahiptir. Bu protokol, SH-SY5Y insan nöroblastom hücrelerinin in vitro uygulamalarda kullanılmak üzere canlı nöronlara nasıl kültürleneceğini ve ayırt edileceğini açıklar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
SH-SY5Y İnsan Nöroblastom Hücre Hattı Farklılaşma
Bu makalede
Özet
Özet
İnsan hastalıkları için translasyonel modeller sağlayan uygun in vivo ve in vitro sistemlere sahip olmak, nörobiyoloji ve sinirbilim araştırmalarının ayrılmaz bir parçasıdır. Nörobiyolojide kullanılan geleneksel in vitro deneysel modeller, sıçan ve farelerden alınan birincil nöronal kültürleri, sıçan B35 ve fare Neuro-2A hücrelerini içeren nöroblastom hücre hatlarını, sıçan PC12 hücrelerini ve kısa süreli dilim kültürlerini içerir. Birçok araştırmacı bu modellere güvenirken, bir insan bileşeninden yoksundurlar ve gözlemlenen deneysel etkiler ilgili türlere özel olabilir ve insanlarda aynı şekilde ortaya çıkmayabilir. Ek olarak, bu hücreler nöronlar olmasına rağmen, kararsız karyotiplere sahip olabilirler, bu da gen ekspresyonu çalışmaları ve hücre sinyalizasyonunun tekrarlanabilir çalışmaları için kullanımlarını sorunlu hale getirir. Bu nedenle, insan nörolojik hastalığının daha tutarlı modellerini geliştirmek önemlidir.
Aşağıdaki prosedür, kromozomal olarak stabil insan nöroblastom hücre hattı SH-SY5Y'yi farklılaştırarak homojen ve canlı insan nöronal kültürleri elde etmek için takip etmesi kolay, tekrarlanabilir bir yöntemi açıklar. Bu yöntem, daha önce açıklanan birkaç yöntem1-4'ü entegre eder ve serumun ortamdan sıralı olarak çıkarılmasına dayanır. Zaman çizelgesi, hücre dışı matriks proteinlerinin ve nörotrofik faktörlerin eklenmesiyle kademeli serum açlığını içerir. Bu, nöronların farklılaşmasına izin verirken, epitel hücreleri seçilir ve homojen bir nöronal kültür ile sonuçlanır. Temsili sonuçlar, SH-SY5Y nöroblastom hücrelerinin başlangıçtaki epitel benzeri hücre fenotipinden daha geniş ve dallı bir nöronal fenotipe başarılı bir şekilde farklılaştığını göstermektedir. Bu protokol, araştırmacılara insan enfeksiyonu ve hastalığının daha doğru bir translasyonel modeli sağlayan, sonraki biyokimyasal ve moleküler analizler için kullanılabilecek homojen nöronal kültür popülasyonları oluşturmak için güvenilir bir yol sunar.
Giriş
Vitro model sistemlerinde kullanma yeteneği büyük ölçüde nörobiyoloji ve nörolojik bilimler alanlarını artırmıştır. kültürde Hücreler hastalık ve enfeksiyon patolojisi anlamak ve ön uyuşturucu testi değerlendirmeleri gerçekleştirmek için, protein işlevsellik ve moleküler mekanizmalar yatan spesifik olayları karakterize etmek verimli bir platform sağlar. Nörobiyolojisinde, hücre kültürü modelleri arasında en önemli tipleri, örneğin, sıçan B35 hücreleri 5, Neuro-2A, fare hücreleri 6 ve sıçan PC12 hücrelerinin 7 gibi sıçan ve fareler ve nöroblastom hücre çizgilerinden türetilen primer nöron kültürleri içerir. Bu hücre çizgilerin....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Genel Hususlar
- Gerekli reaktiflerin listesi için Malzemeleri / Ekipman Tablo bakın. sıkı aseptik koşullarda tüm adımları uygulayın.
- FBS içeren tüm ortam preparasyonlar için ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu (hiFBS) kullanın. Isı ile inaktive edilmesi için, her 10 dakikada bir ters çevrilerek 30 dakika için 56 ° C'de FBS, 50 ml'lik bir şişe sıcak (ayrıca Tablo 1 e bakınız).
Not: FBS ısı inaktive edilmeden kullanıldığında, epitel benzeri fenotip SH-SY5Y hücrelerinin kültürleri içinde daha hızlı bir şekilde ilerler. - Kullanımdan önce, ortam ısınmaya bırakılmış ve her ad....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Şu anda, bu tür olan optimum viral alımı 2 olarak farklılaşmamış SH-SY5Y hücreleri önemlisi, farklılaşmamış hücreler olmayabilir insan nöronlar 27-36 ve fenotipleri için fonksiyonel bir model olarak kullanılmakta olan nörobiyoloji ve neurovirology alanında birçok örnekleri vardır doğru yorumlanması için gerekli. In vitro nöronal sistem SH-SY5Y hücreleri kullanılarak ya da başka bir zaman, hücreler uygun bir şekilde, in vivo nöron meydana olabilir ne iyi bir şekilde temsil verileri.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Yukarıdaki protokol homojen ve uygun bir insan nöronal kültürler meydana getirmek için basit ve tekrarlanabilir bir yöntem sağlar. Bu protokol teknikleri ve her birinin en iyi uygulamaları tanımlamak için birkaç daha önce yayınlanmış yöntemler 1-4 ve amaçlarını entegre uygulamaları kullanır. SH-SY5Y hücrelerinin farklılaşması kademeli serum yoksunluğu dayanır; retinoik asit, nörotrofik faktörler ve hücre dışı matris proteinlerinin eklenmesi; ve seri yarma farklılaşmış olgun yapışık nöronlar için seçin. Bu hüc.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Teşekkürler
Yolanda Tafuri'nin SH-SY5Y farklılaşması için koşulları optimize etmedeki katkıları ve bu çalışmanın laboratuvarında başlatılan Dr. Lynn Enquist'in desteği için minnettarız. Y. Tafuri, Şekil 3'te gösterilen resimlere katkıda bulunmuştur. Bu çalışma NIH-NIAID Virüs Patojenleri Kaynağı (ViPR), Biyoinformatik Kaynak Merkezi (MLS ve L. Enquist) ve K22 AI095384 (MLS) tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| B-27 | ThermoFisher Scientific | 17504-044 | Hazırlık için Tablo 1 |
| Beyin Kaynaklı Nörotrofik Faktör (BDNF) | Sigma | SRP3014 (10 μ g)/B3795 (5 μ g) | Bkz. Tablo 1 hazırlama için |
| dibutiril siklik AMP (db-cAMP) | Sigma | D0627 | Bkz. Tablo 1 |
| hazırlık için DMSO | ATCC | 4-X-Minimum | |
| Esansiyel Orta Kartal (EMEM) | Sigma | M5650-Fetal | |
| Sığır Serumu (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | Hazırlık için Tablo 1 bakınız |
| GlutamaxI | Yaşam Teknolojileri | 35050-061-Glutamin | |
| Hiklon | SH30034.01-Potasyum | ||
| Klorür (KCl) | Fisher Scientific | BP366-1 | Hazırlık için Tablo 1 |
| MaxGel Hücre Dışı Matris (ECM) çözeltisi | Sigma | E0282 | Protokolün 11. adımına bakın |
| Nörobazal | Yaşam Teknolojileri | 21103-049-Penisilin | |
| / Streptomisin (Kalem / Strep) | Yaşam Teknolojileri | 15140-122-Retinoik | |
| asit (RA) | Sigma | R2625 | Karanlıkta 4 ° C'de saklanmalıdır; C çünkü bu reaktif ışığa duyarlıdır |
| SH-SY5Y Hücreleri | ATCC | CRL-2266-0.5 | |
| % Tripsin + EDTA | Yaşam Teknolojileri | 15400-054-Falcon | |
| 35 mm TC tabakları | Falcon (Bir Corning Markası) | 353001 | - |
Kaynaklar
- Christensen, J., Steain, M., Slobedman, B., Abendroth, A. Differentiated Neuroblastoma Cells Provide a Highly Efficient Model for Studies of Productive Varicella-Zoster Virus Infection of Neuronal Cells. Journal of Virology. 85 (16), 8436-8442 (2011).
- Gimenez-Cassina, A., Lim, F., Diaz-Nido, J.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
