Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

SH-SY5Y İnsan Nöroblastom Hücre Hattı Farklılaşma

79.3K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/53193

⸱

17 Şubat 2016

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, The Huck Institutes of the Life Sciences, The Pennsylvania State University

Bu makalede

Özet

Nörobiyoloji ve nörovirolojide, insan nöronlarında in vivo olarak meydana gelenler için translasyonel bir model olarak hizmet eden güvenilir, tekrarlanabilir bir in vitro sisteme sahip olmak kritik öneme sahiptir. Bu protokol, SH-SY5Y insan nöroblastom hücrelerinin in vitro uygulamalarda kullanılmak üzere canlı nöronlara nasıl kültürleneceğini ve ayırt edileceğini açıklar.

Özet

İnsan hastalıkları için translasyonel modeller sağlayan uygun in vivo ve in vitro sistemlere sahip olmak, nörobiyoloji ve sinirbilim araştırmalarının ayrılmaz bir parçasıdır. Nörobiyolojide kullanılan geleneksel in vitro deneysel modeller, sıçan ve farelerden alınan birincil nöronal kültürleri, sıçan B35 ve fare Neuro-2A hücrelerini içeren nöroblastom hücre hatlarını, sıçan PC12 hücrelerini ve kısa süreli dilim kültürlerini içerir. Birçok araştırmacı bu modellere güvenirken, bir insan bileşeninden yoksundurlar ve gözlemlenen deneysel etkiler ilgili türlere özel olabilir ve insanlarda aynı şekilde ortaya çıkmayabilir. Ek olarak, bu hücreler nöronlar olmasına rağmen, kararsız karyotiplere sahip olabilirler, bu da gen ekspresyonu çalışmaları ve hücre sinyalizasyonunun tekrarlanabilir çalışmaları için kullanımlarını sorunlu hale getirir. Bu nedenle, insan nörolojik hastalığının daha tutarlı modellerini geliştirmek önemlidir.

Aşağıdaki prosedür, kromozomal olarak stabil insan nöroblastom hücre hattı SH-SY5Y'yi farklılaştırarak homojen ve canlı insan nöronal kültürleri elde etmek için takip etmesi kolay, tekrarlanabilir bir yöntemi açıklar. Bu yöntem, daha önce açıklanan birkaç yöntem1-4'ü entegre eder ve serumun ortamdan sıralı olarak çıkarılmasına dayanır. Zaman çizelgesi, hücre dışı matriks proteinlerinin ve nörotrofik faktörlerin eklenmesiyle kademeli serum açlığını içerir. Bu, nöronların farklılaşmasına izin verirken, epitel hücreleri seçilir ve homojen bir nöronal kültür ile sonuçlanır. Temsili sonuçlar, SH-SY5Y nöroblastom hücrelerinin başlangıçtaki epitel benzeri hücre fenotipinden daha geniş ve dallı bir nöronal fenotipe başarılı bir şekilde farklılaştığını göstermektedir. Bu protokol, araştırmacılara insan enfeksiyonu ve hastalığının daha doğru bir translasyonel modeli sağlayan, sonraki biyokimyasal ve moleküler analizler için kullanılabilecek homojen nöronal kültür popülasyonları oluşturmak için güvenilir bir yol sunar.

Giriş

Vitro model sistemlerinde kullanma yeteneği büyük ölçüde nörobiyoloji ve nörolojik bilimler alanlarını artırmıştır. kültürde Hücreler hastalık ve enfeksiyon patolojisi anlamak ve ön uyuşturucu testi değerlendirmeleri gerçekleştirmek için, protein işlevsellik ve moleküler mekanizmalar yatan spesifik olayları karakterize etmek verimli bir platform sağlar. Nörobiyolojisinde, hücre kültürü modelleri arasında en önemli tipleri, örneğin, sıçan B35 hücreleri 5, Neuro-2A, fare hücreleri 6 ve sıçan PC12 hücrelerinin 7 gibi sıçan ve fareler ve nöroblastom hücre çizgilerinden türetilen primer nöron kültürleri içerir. Bu hücre çizgilerinin kullanımı önemli ölçüde alanı gelişmiş olmasına rağmen, insan olmayan hücreler ve doku tutulması ile ilgili çok sayıda karıştırıcı faktörler vardır. insanlara kıyasla bu anlayış türe özgü metabolik süreçlerde farklılıkları, hastalık tezahürü ve patogenezi fenotipleri içerir. Dikkat etmek de önemlidirkemirgen modellerinin sınırlamaları ve yollar kemirgenler ve insanlarda 8-11 arasında korunmuştur anlayış önemini vurgulayarak fare ve insan gen ifadesi ve transkripsiyon faktörü sinyalizasyon arasında önemli farklılıklar, yeniden bulunmaktadır. Diğer N-tera-2 (NT2), insan teratokarsinoma hücre hattı ve uyarılabilir pluripotent kök hücreler (iPSCs) dahil olmak üzere insan nöronal hücre çizgilerinin kullanımı kullanmışlardır. Bu hücre hatları in vitro insan sistemler için iyi modeller sunar. Bununla birlikte, retinoik asit (RA) nöronları, astrositler oluşan karışık bir popülasyonda oluşmasına neden ve ek saflaştırma adımı gerektiren radyal glial hücreleri 12 ile NT2 hücre farklılaşması nöronların saf popülasyonları elde edildi. Buna ek olarak, NT2 hücre hücrelerin% 72 daha büyük 60 kromozomlu bir çok değişken karyotipe 13 göstermektedir. iPSCs farklı hücre hatları arasında farklılaşmasında değişkenlik göstermektedir ve farklılaşma etkinliğinde değişiklik gösterebilir 14. Alternatiflerin güzelleştirmek için tutarlı ve tekrarlanabilir bir insan nöron hücresi modeli olması arzu edilen bir durumdur.

SH-SY5Y neuroblast benzeri hücreler, ebeveyn nöroblastoma hücre çizgisi SK-N-SH bir alt klon vardır. Parenteral hücre hatları neuroblast benzeri ve epitel benzeri hücreler 15 hem de içeren bir kemik iliği biyopsisinden 1970 üretilmiştir. SH-SY5Y hücreleri 47 kromozom içeren stabil karyotipe sahiptir ve farklı RA kullanımı dahil olmak üzere, mekanizma, forbol esterler ve beyin-türevi gibi belirli nörotrofinlerin çeşitli aracılığıyla, olgun insanlara özgü nöronlar bir neuroblast benzeri durumundan ayırt edilebilir nörotrofik faktör (BDNF). Önceki kanıtlar, farklı yöntemlerin kullanılması gibi adrenerjik, kolinerjik ve dopaminerjik nöronlar 16,17 gibi belirli nöron alt tipleri için seçebileceğiniz düşündürmektedir. Bu ikinci yönü Nörobiyoloji deneyler bir çok yararlı SH-SY5Y hücreleri sağlar.

ontent "> Çeşitli çalışmalar onların farklılaşmamış ve farklılaştırılmış devletlerde SH-SY5Y hücreleri arasındaki önemli farklılıklar kaydetti. Zaman SH-SY5Y hücreleri farklılaşmamış, onlar hızla çoğalır ve çok az, kısa süreçleri, polarize olmayan gözükmektedir. Bunlar genellikle büyümek farklılaştırılmış olgunlaşmamış nöronların 18,19 göstergesidir kümeleri ve ekspres belirteçleri., bu hücrelerin uzun kollara ayrılmış işlemleri, çoğalma azalma uzanır, ve bazı durumlarda 2,18 polarize. farklılaşmış SH-SY5Y hücreleri, daha önce bir ifade gösterilmiştir büyüme-ilişkili protein (GAP-43), nöronal çekirdekleri (Neun), sinaptofizin (SYN), sinaptik vezikül proteini II (SV2), nöron spesifik enolaz (NSE) ve mikrotübül ilişkili protein (MAP) dahil olgun nöronlar farklı belirteçlerin çeşitli 2,16,17,20, ve glial fibriller asidik protein (GFAP) 4 olarak glial markerlerin ifadesi için geçerli değildir. SH-SY5Y hücreleri huk ayırt fazla desteklemeknt homojen bir nöronal nüfus, BDNF kaldırılması hücresel apoptoz 4 sonuçlanır. Bu farklılaşmış SH-SY5Y hücrelerinin hayatta kalma nöronlar olgun benzer trofik faktöre bağlı olduğunu göstermektedir.

Subclone 1978 3 yılında kurulmuştur beri SH-SY5Y hücrelerinin kullanımı artmıştır. Kullanımlarına bazı örnekler Parkinson hastalığı 17, Alzheimer hastalığı 21 ve poliovirüsün 22 enterovirüs 71 (EV71) gibi viral enfeksiyon patogenezi 23,24 soruşturma dahil , varicella-zoster virüsü (VZV), 1, insan sitomegalovirüs 25, ve herpes simpleks virüsü (HSV) 2,26. Özellikle neurovirology 27-36 alanında, SH-SY5Y hücreleri farklılaşmamış formunda bu hücreleri kullandık kullanarak bu çeşitli çalışmalar dikkat etmek önemlidir. ayırt SH-SY5Y hücrelerinin karşılık farklılaşmamış gözlenen fenotipin fark whe sorusunu gündeme getirmektedirTher enfeksiyon gözlenen ilerleme olgun farklılaştırılmış nöronlar farklı olurdu. Örneğin, farklılaşmış SH-SY5Y hücreleri, HSV bağlanan ve farklılaşmamış SH-SY5Y hücrelerinin 2 giriş modüle yüzeyi reseptörlerinin olmaması olabilir farklılaşmamış, prolifere olan SH-SY5Y hücrelerinin karşı, HSV-1 alımı, daha yüksek bir verimliliğe sahiptir. In vitro nöronları test odaklı bir deney tasarımı, SH-SY5Y hücreleri in vivo modeller için çeviri ve karşılaştırma için en doğru sonuçlar elde etmek için farklılaştırılması gerektiğini bu nedenle önemlidir.

insan nöronal kültürlerin üretmek için güvenilir bir yöntem geliştirme araştırmacılar doğru insan sinir sistemini modellemek öteleme deneyler gerçekleştirmek için izin zorunludur. Burada sunulan protokol farklılaşmış insan nöronlar için zenginleştirmek için önceki yöntemlerden 1-4 türetilen en iyi uygulamaları delineates bir işlemdirretinoik asit.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Genel Hususlar

  1. Gerekli reaktiflerin listesi için Malzemeleri / Ekipman Tablo bakın. sıkı aseptik koşullarda tüm adımları uygulayın.
  2. FBS içeren tüm ortam preparasyonlar için ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu (hiFBS) kullanın. Isı ile inaktive edilmesi için, her 10 dakikada bir ters çevrilerek 30 dakika için 56 ° C'de FBS, 50 ml'lik bir şişe sıcak (ayrıca Tablo 1 e bakınız).
    Not: FBS ısı inaktive edilmeden kullanıldığında, epitel benzeri fenotip SH-SY5Y hücrelerinin kültürleri içinde daha hızlı bir şekilde ilerler.
  3. Kullanımdan önce, ortam ısınmaya bırakılmış ve her adımda önce uygun bir pH dengesini oluşturmak için bir kuluçka makinesi içinde dengelenmeye gelmeye bırakın. Örnek olarak, ortam, 50 ml tam dengelenmeye yaklaşık bir saat sürer (pH 7, 37 ° C,% 5 CO2).
    Not: Bu protokol, tripsinize edilmiş ve yeniden kaplanacak kısmen farklılaşmış SH-SY5Y hücreleri gerektiren iki aşamalı bir ayırma prosedürü kullanılır. Bu stresliBu son derece kırılgan hücreler için süreç. Nedenle, en az zaman miktarı için tripsin hücreleri inkübe etmek önemlidir. Bu hala çanak bağlı epitel benzeri hücreleri bırakarak nöronların tercihli bir hareket başlangıcı sağlayacaktır.
  4. yavaş yavaş hücreleri içeren konik tüp alt karşı ucu ile 10 ml plastik pipet ile farklılaşmış hücrelerin öğütme gerçekleştirin. yukarı ve aşağı hayır, yavaş hızda daha fazla beş kez öğütme gerçekleştirin.

SH-SY5Y Bakım Kültürlerin 2. Passage

  1. Hücreler% 70-80 birikime ulaşmış ve 10 ila 15 pasajlar aşmamaktadır bölünmüş bakım kültürleri. Kültürler, tipik olarak (varsayarak kültürler bölme sırasında 5 kat daha seyreltildi değildir) her 3-5 günde geçirilmiş olması gerekir.
  2. T-75 balonuna geçişin hücreleri, ardından PBS 1X yaklaşık 10 ml ile yıkayın, ortam aspire.
    Not: SH-SY5Y bakım kültürleri fu yarma önermiyoruz1'den rther: 5 Pasajlanması sırasında bu hücreler düşük confluency nedeniyle ölmesine neden olabilir, çünkü.
  3. PBS aspire ve daha sonra 2.5 ml% 0.05 tripsin-EDTA (1 x) ekleyin.
  4. inkübatör 2-3 dakika içinde inkübe ve balonun yüzeyindeki hücrelerin serbest bırakmak için yavaşça ucu.
  5. 10 ml temel büyüme ortamında ekleyin (bakınız Tablo 2) ve 1-2 kez Karışım.
  6. 1000 xg'de 2 dakika aşağı Spin, aspirat medya, daha sonra 5 ml Temel Büyüme Medya pelletini.
  7. T-75 balonuna normal kaplama için 20 ml'lik bir toplam hacim içinde 5 veya farklılaşması (Bölüm 5) saymak ve plaka: 1 ila 3: 1 hücreleri ile seyreltilir.

3. Dondurucu SH-SY5Y hücreleri

  1. % 5 (h / h) DMSO ile desteklenmiş temel büyüme ortamında SH-SY5Y nöroblastoma hücrelerinin erken pasajlar dondurun.
  2. Başlangıçta, 24 saat süre ile, -80 ° C'de alikot sonra dondurularak uzun süreli depolama için sıvı azot transfer.
    Not: Başvuru için konfluent (% 75-85), T-75 şişesi beş verecektirdondurma için SH-SY5Y hücrelerinin 1 ml'lik eş payları. Bu alikotları her biri toplam bir yerde 2-5 milyon hücre içermelidir.

4. Çözülme ve Kültür ayrım yapılmamış SH-SY5Y Nöroblastom Hücreleri

  1. Temel Büyüme Medya hazırlayın.
  2. Hızla bir 37 ° C su banyosu (yaklaşık 2 dakika) donmuş hücrelerini eritin.
  3. 15 ml konik bir tüp içinde 9 ml temel büyüme ortamında yeniden süspanse hücreleri ve daha sonra 1,000 x g'de 2 dakika süre ile santrifüjlenir.
  4. Süpernatant aspire 10 ml Temel Büyüme Medya pelet hücreleri, ve yavaşça tekrar süspansiyon hücreleri rahatsız etmemek için dikkatli olurken.
  5. T-25 balonuna veya 60 mm 2 tabağa plaka hücreleri.
  6. Ertesi gün, ölü hücreleri çıkarmak için ortamı değiştirin.

5. Gün: 0 Farklılaşma için Kaplama Hücreler

  1. Farklılaşma programı için Bkz: Şekil 1.
  2. 1x PBS, aspirat ile farklılaşmamış hücreler durulayın ve sonra 1-2 ml ısındı kullanarak trypsinize1x% 0.05 Tripsin-EDTA.
  3. Hücreler tripsin içinde olduğunda, bir kuluçka makinesi içinde, yaklaşık 3 dakika boyunca inkübe edin.
  4. , 10 ml Temel Büyüme Medya ekleyerek tripsin Quench şişeye ya da yemeğin kenarlarını durulayın ve nazikçe 1-3 kez çiğnemek. 15 ml konik tüp içeriği aktarın.
  5. pelet rahatsız etmemek için dikkatli olurken 1,000 xg'de 2 dakika süreyle santrifüj ve medya aspire.
  6. Süspanse 5 ml Temel Büyüme Medya pelet ve 1-3 kez çiğnemek.
  7. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak, sonra / ml 50,000 hücrelere Temel Büyüme Medya kullanarak sulandırmak.
  8. Plaka 2 çanak başına 100,000 hücre toplam 35 mm2 çanak başına hücre ml tekrar inkübatör içine yerleştirin.

6. Gün 1: Değişim Medya (Farklılaşma Medya # 1)

  1. Farklılaşma Ortam # 1 kısım 50 mi (bakınız Tablo 2) ve 37 ° C su banyosu içinde inkübe edilir.
  2. Ortam ısıtıldı olduğunda, (bir kuluçka makinesi içinde dengelenmeye 37 sağlar° C,% 5 CO2), en azından bir saat için, kullanımdan önce uygun bir pH dengesini kurmak.
  3. Retinoik Asit (RA) ekleyin hemen yemekleri medya eklemeden önce ısındı ve dengelenmiş medya (Tablo 1).
    Not: Retinoik asit ışığa duyarlı ve 4 ° C'de koyu renkli şişelerde muhafaza edilmelidir
  4. Yavaşça eski medya aspire ve atın.
  5. 35 mm 2 tabak başına RA 2 ml Farklılaşma Medya 1. ekleyin ve inkübatör dönmek.

7. Gün 3: Değişim Medya (Farklılaşma Medya # 1)

  1. Tekrarlama Bölüm 6 (1-5 adımlar)

8. Gün 5: Değişim Medya (Farklılaşma Medya # 1)

  1. Tekrarlama Bölüm 6 (1-5 adımlar)

9. Gün 7: Hücreleri Böl 1: 1

  1. RA ısındı ekle ve hemen yemekleri medyayı eklemeden önce Farklılaşma Medya 1. dengelenmiş.
  2. Yavaşça eski medya aspire ve atın.
  3. 200 ul ekle35 mm 2 tabak başına% 0.05 1x tripsin EDTA ısındı ve yaklaşık 2-3 dakika ya da hücrelere kadar gözle görülür bir mikroskop altında gözlenen olarak plaka kaldırılır inkübatör sıcak.
  4. 35 mm 2 tabak başına RA 2 ml Farklılaşma Medya 1. ekleyerek tripsin Quench ve plaka kapalı nöronal hücrelerin kalan durulama ortam kullanın. Daha sonra, 50 ml konik tüp içeriğini aktarın.
    Not: trypsinization aşamaları sırasında, aynı anda çok sayıda yemekleri trypsinize yok. Bu sitotoksik olabilir, nöronal kültürler için çok uzun tripsin inkübe değildir sağlamaya yardımcı olur.
  5. 50 ml konik tüp içinde 10 kadar yemekler birleştirin ve yavaşça yukarı ve en fazla beş kez aşağı 10 ml plastik pipet ile yavaş yavaş çiğnemek.
  6. Kısım 2 ml hücre taze 35 mm 2 kaplarına süspansiyon ve inkübatör dönmek.

10. 8. Gün: Değişim Medya (Farklılaşma Medya # 2)

  1. RA ekleyin (bkz Tablo 1) ısıtılır ve hemen yemekleri medyayı eklemeden önce medyayı dengelenmiş için.
  2. Yavaşça eski medya aspire ve atın.
  3. Yavaşça 2 ml farklılaşma medya # 2 (bakınız Tablo 2) ekleyin 35 mm 2 çanak ve inkübatör dönüş başına RA. izin verme nöronlar, hızlı bir şekilde kuru gibi uzun bir süre boyunca havaya maruz.

11. Gün 9: Ekstrasellüler Matrix (ECM) hazırlayın Kaplı Yemekleri

  1. buz üzerinde ECM çözümün bir şişe çözülme ve 1 sulandırmak: 100 soğuk DMEM içine.
  2. Her 35 mm 2 çanak içine karışımı 2 ml dağıtın ve yemeğin tüm baz kaplı olduğundan emin olun.
  3. Bir inkübatör içerisinde yer (37 ° C,% 5 CO2), 1 saat veya gece boyunca.
  4. Aspire karışımı ve başlıkta yaklaşık olarak 1 saat süre ile kurumaya bırakın. en fazla 2 ay boyunca oda sıcaklığında saklayınız.

12. Gün 10: Aktarım Hücreler üzerineECM ile kaplı levhalar 1: 1

  1. RA ekle hemen yemekleri medyayı eklemeden önce ısındı ve dengelenmiş medya (Tablo 1).
  2. Yavaşça medya aspire ve atın.
  3. Her 35 mm2 çanak tripsin ısıtıldı 200 ul ilave edin ve yaklaşık 1-2 dakika boyunca ya da nöronlar gözle mikroskop altında görüldüğü gibi, çanak kaldırılıncaya kadar oda sıcaklığında inkübe edin.
    Not: tripsin ile nöronların aşırı-inkübe ve hasara neden olmamak için oda sıcaklığında bu trypsinization adımı yürütün. Nöronlar bu aşamada epitel benzeri hücreler çok daha hızlı plakaları bırakın.
  4. 35 mm 2 tabak başına 2 ml Farklılaşma Medya 2. ekleyerek tripsin gidermek ve plaka kapalı nöronal hücrelerin kalan durulama ortam kullanın. Daha sonra, 50 ml konik tüp içeriğini aktarın.
  5. 50 ml konik tüp içinde 10 kadar yemekler birleştirin ve yavaşça yukarı ve sahip en fazla beş kez aşağı yavaşça çiğnemek10 ml'lik plastik pipet.
  6. ECM-kaplı 35 mm 2 yemekleri içine 2 ml hücre süspansiyonu koyun ve inkübatör dönmek.

13. Gün 11: Değişim Medya (Farklılaşma Medya # 3)

  1. RA ekle hemen yemekleri medyayı eklemeden önce ısındı ve dengelenmiş medya (Tablo 1).
  2. Yavaşça eski medya aspire ve atın.
  3. Yavaşça 35 mm 2 tabak başına RA 2 ml Farklılaşma Medya 3. (bakınız Tablo 2) ekleyin ve inkübatör dönmek. izin verme nöronlar uzun bir süre boyunca havaya maruz.

14. Gün 14: Değişim Medya (Farklılaşma Medya # 3)

  1. Tekrarlama Bölüm 13 (1-3 arasındaki adımları)

15. Gün 17: Son Medya Değişimi (Farklılaşma Medya # 3)

  1. Tekrarlama Bölüm 13 (1-3 arasındaki adımları)

16. Gün 18: Kullanıma Hazır Nöronal Kültürleri

  1. Taze Diff bir ortam3 günde RA, farklılık yaratmak Medya 3. nöron sağlığını korumak için.
    Hücreler nöronlar içine ayırt edilmelidir ve nöronal fenotip sergilerler Not:. Kültürler, terminal farklılaşma, aşağıdaki sonra 14 gün boyunca, tipik olarak stabil, nöron canlılığının Ancak süresi farklılaşma başlangıcında farklılaşmamış hücreler geçiş sayısına bağlıdır. Daha yüksek geçiş sayıları kısa kullanım ömrü ile farklı nöronların verim.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Şu anda, bu tür olan optimum viral alımı 2 olarak farklılaşmamış SH-SY5Y hücreleri önemlisi, farklılaşmamış hücreler olmayabilir insan nöronlar 27-36 ve fenotipleri için fonksiyonel bir model olarak kullanılmakta olan nörobiyoloji ve neurovirology alanında birçok örnekleri vardır doğru yorumlanması için gerekli. In vitro nöronal sistem SH-SY5Y hücreleri kullanılarak ya da başka bir zaman, hücreler uygun bir şekilde, in vivo nöron meydana olabilir ne iyi bir şekilde temsil verileri...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Yukarıdaki protokol homojen ve uygun bir insan nöronal kültürler meydana getirmek için basit ve tekrarlanabilir bir yöntem sağlar. Bu protokol teknikleri ve her birinin en iyi uygulamaları tanımlamak için birkaç daha önce yayınlanmış yöntemler 1-4 ve amaçlarını entegre uygulamaları kullanır. SH-SY5Y hücrelerinin farklılaşması kademeli serum yoksunluğu dayanır; retinoik asit, nörotrofik faktörler ve hücre dışı matris proteinlerinin eklenmesi; ve seri yarma farklılaşmış olgun yapışık nöronlar için seçin. Bu hüc...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Yolanda Tafuri'nin SH-SY5Y farklılaşması için koşulları optimize etmedeki katkıları ve bu çalışmanın laboratuvarında başlatılan Dr. Lynn Enquist'in desteği için minnettarız. Y. Tafuri, Şekil 3'te gösterilen resimlere katkıda bulunmuştur. Bu çalışma NIH-NIAID Virüs Patojenleri Kaynağı (ViPR), Biyoinformatik Kaynak Merkezi (MLS ve L. Enquist) ve K22 AI095384 (MLS) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
B-27ThermoFisher Scientific17504-044Hazırlık için Tablo 1
Beyin Kaynaklı Nörotrofik Faktör (BDNF)SigmaSRP3014 (10 μ g)/B3795 (5 μ g)Bkz. Tablo 1 hazırlama için
dibutiril siklik AMP (db-cAMP)SigmaD0627Bkz. Tablo 1
hazırlık için DMSOATCC4-X-Minimum
Esansiyel Orta Kartal (EMEM)SigmaM5650-Fetal
Sığır Serumu (FBS) HycloneSH30071.03Hazırlık için Tablo 1 bakınız
GlutamaxIYaşam Teknolojileri35050-061-Glutamin
HiklonSH30034.01-Potasyum
Klorür (KCl)Fisher ScientificBP366-1Hazırlık için Tablo 1
MaxGel Hücre Dışı Matris (ECM) çözeltisiSigmaE0282Protokolün 11. adımına bakın
NörobazalYaşam Teknolojileri21103-049-Penisilin
/ Streptomisin (Kalem / Strep)Yaşam Teknolojileri15140-122-Retinoik
asit (RA)SigmaR2625Karanlıkta 4 ° C'de saklanmalıdır; C çünkü bu reaktif ışığa duyarlıdır
SH-SY5Y HücreleriATCCCRL-2266-0.5
% Tripsin + EDTAYaşam Teknolojileri15400-054-Falcon
35 mm TC tabaklarıFalcon (Bir Corning Markası)353001-
bakınız bakınız

Kaynaklar

  1. Christensen, J., Steain, M., Slobedman, B., Abendroth, A. Differentiated Neuroblastoma Cells Provide a Highly Efficient Model for Studies of Productive Varicella-Zoster Virus Infection of Neuronal Cells. Journal of Virology. 85 (16), 8436-8442 (2011).
  2. Gimenez-Cassina, A., Lim, F., Diaz-Nido, J. Differentiation of a human neuroblastoma into neuron-like cells increases their susceptibility to transduction by herpesviral vectors. Journal of Neuroscience Research. 84 (4), 755-767 (2006).
  3. Biedler, J. L., Roffler-Tarlov, S., Schachner, M., Freedman, L. S. Multiple Neurotransmitter Synthesis by Human Neuroblastoma Cell Lines and Clones. Cancer Research. 38 (11 Pt 1), 3751-3757 (1978).
  4. Encinas, M., Iglesias, M., et al. Sequential Treatment of SH-SY5Y Cells with Retinoic Acid and Brain-Derived Neurotrophic Factor Gives Rise to Fully Differentiated, Neurotrophic Factor-Dependent, Human Neuron-Like Cells. Journal of Neurochemistry. 75 (3), 991-1003 (2000).
  5. Otey, C. A., Boukhelifa, M., Maness, P. B35 neuroblastoma cells: an easily transfected, cultured cell model of central nervous system neurons. Methods in Cell Biology. 71, 287-304 (2003).
  6. LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies. Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).
  7. Shafer, T. J., Atchison, W. D. Transmitter, ion channel and receptor properties of pheochromocytoma (PC12) cells: a model for neurotoxicological studies. Neurotoxicology. 12 (3), 473-492 (1991).
  8. Yue, F., Cheng, Y., et al. A comparative encyclopedia of DNA elements in the mouse genome. Nature. 515 (7527), 355-364 (2014).
  9. Cheng, Y., Ma, Z., et al. Principles of regulatory information conservation between mouse and conservation between mouse and human. Nature. 515 (7527), 371-375 (2014).
  10. Stergachis, A. B., Neph, S., et al. Conservation of trans-acting circuitry during mammalian regulatory evolution. Nature. 515 (7527), 365-370 (2014).
  11. Lin, S., Lin, Y., et al. Comparison of the transcriptional landscapes between human and mouse tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 17224-17229 (2014).
  12. Coyle, D. E., Li, J., Baccei, M. Regional Differentiation of Retinoic Acid-Induced Human Pluripotent Embryonic Carcinoma Stem Cell Neurons. PLoS ONE. 6 (1), e16174(2011).
  13. Mostert, M. M., van de Pol, M., et al. Fluorescence in situ hybridization-based approaches for detection of 12p overrepresentation, in particular i(12p), in cell lines of human testicular germ cell tumors of adults. Cancer Genetics and Cytogenetics. 87 (2), 95-102 (1996).
  14. Hu, B. -Y., Weick, J. P., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4335-4340 (2010).
  15. Biedler, J. L., Helson, L., Spengler, B. A. Morphology and growth, tumorigenicity, and cytogenetics of human neuroblastoma cells in continuous culture. Cancer Research. 33 (11), 2643-2652 (1973).
  16. Påhlman, S., Ruusala, A. I., Abrahamsson, L., Mattsson, M. E., Esscher, T. Retinoic acid-induced differentiation of cultured human neuroblastoma cells: a comparison with phorbolester-induced differentiation. Cell Differentiation. 14 (2), 135-144 (1984).
  17. Xie, H., Hu, L., Li, G. SH-SY5Y human neuroblastoma cell line: in vitro cell model of dopaminergic neurons in Parkinson’s disease. Chinese Medical Journal. 123 (8), 1086-1092 (2010).
  18. Kovalevich, J., Langford, D. Considerations for the use of SH-SY5Y neuroblastoma cells in neurobiology. Methods in Molecular Biology. 1078, Clifton, N.J. 9-21 (2013).
  19. Påhlman, S., Hoehner, J. C., et al. Differentiation and survival influences of growth factors in human neuroblastoma. European Journal of Cancer. 31 (4), 453-458 (1995).
  20. Cheung, Y. -T., Lau, W. K. -W., et al. Effects of all-trans-retinoic acid on human SH-SY5Y neuroblastoma as in vitro model in neurotoxicity research. Neurotoxicology. 30 (1), 127-135 (2009).
  21. Agholme, L., Lindström, T., Kågedal, K., Marcusson, J., Hallbeck, M. An in vitro model for neuroscience: differentiation of SH-SY5Y cells into cells with morphological and biochemical characteristics of mature neurons. Journal of Alzheimer's disease: JAD. 20 (4), 1069-1082 (2010).
  22. La Monica, N., Racaniello, V. R. Differences in replication of attenuated and neurovirulent polioviruses in human neuroblastoma cell line SH-SY5Y. Journal of Virology. 63 (5), 2357-2360 (1989).
  23. Cordey, S., Petty, T. J., et al. Identification of Site-Specific Adaptations Conferring Increased Neural Cell Tropism during Human Enterovirus 71 Infection. PLoS Pathog. 8 (7), e1002826(2012).
  24. Xu, L. -J., Jiang, T., et al. Global Transcriptomic Analysis of Human Neuroblastoma Cells in Response to Enterovirus Type 71 Infection. PLoS ONE. 8 (7), e65948(2013).
  25. Luo, M. H., Fortunato, E. A. Long-term infection and shedding of human cytomegalovirus in T98G glioblastoma cells. Journal of Virology. 81 (19), 10424-10436 (2007).
  26. Sun, Z., Yang, H., Shi, Y., Wei, M., Xian, J., Hu, W. Establishment of a cell model system of herpes simplex virus type II latent infection and reactivation in SH-SY5Y cells. Wei Sheng Wu Xue Bao = Acta Microbiologica Sinica. 50 (1), 98-106 (2010).
  27. Yun, S. -I., Song, B. -H., et al. A molecularly cloned, live-attenuated japanese encephalitis vaccine SA14-14-2 virus: a conserved single amino acid in the ij Hairpin of the Viral E glycoprotein determines neurovirulence in mice. PLoS pathogens. 10 (7), e1004290(2014).
  28. Garrity-Moses, M. E., Teng, Q., Liu, J., Tanase, D., Boulis, N. M. Neuroprotective adeno-associated virus Bcl-xL gene transfer in models of motor neuron disease. Muscle & Nerve. 32 (6), 734-744 (2005).
  29. Kalia, M., Khasa, R., Sharma, M., Nain, M., Vrati, S. Japanese Encephalitis Virus Infects Neuronal Cells through a Clathrin-Independent Endocytic Mechanism. Journal of Virology. 87 (1), 148-162 (2013).
  30. Haedicke, J., Brown, C., Naghavi, M. H. The brain-specific factor FEZ1 is a determinant of neuronal susceptibility to HIV-1 infection. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (33), 14040-14045 (2009).
  31. Xu, K., Liu, X. -N., et al. Replication-defective HSV-1 effectively targets trigeminal ganglion and inhibits viral pathopoiesis by mediating interferon gamma expression in SH-SY5Y cells. Journal of molecular neuroscience: MN. 53 (1), 78-86 (2014).
  32. Oh, J., Fraser, N. W. Temporal association of the herpes simplex virus genome with histone proteins during a lytic infection. Journal of Virology. 82 (7), 3530-3537 (2008).
  33. Stiles, K. M., Milne, R. S. B., Cohen, G. H., Eisenberg, R. J., Krummenacher, C. The herpes simplex virus receptor nectin-1 is down-regulated after trans-interaction with glycoprotein D. Virology. 373 (1), 98-111 (2008).
  34. Thomas, D. L., Lock, M., Zabolotny, J. M., Mohan, B. R., Fraser, N. W. The 2-kilobase intron of the herpes simplex virus type 1 latency-associated transcript has a half-life of approximately 24 hours in SY5Y and COS-1 cells. Journal of Virology. 76 (2), 532-540 (2002).
  35. Handler, C. G., Cohen, G. H., Eisenberg, R. J. Cross-linking of glycoprotein oligomers during herpes simplex virus type 1 entry. Journal of Virology. 70 (9), 6076-6082 (1996).
  36. Nicola, A. V., Hou, J., Major, E. O., Straus, S. E. Herpes Simplex Virus Type 1 Enters Human Epidermal Keratinocytes, but Not Neurons, via a pH-Dependent Endocytic Pathway. Journal of Virology. 79 (12), 7609-7616 (2005).
  37. Korecka, J. A., van Kesteren, R. E., et al. Phenotypic characterization of retinoic acid differentiated SH-SY5Y cells by transcriptional profiling. PloS One. 8 (5), e63862(2013).
  38. Presgraves, S. P., Ahmed, T., Borwege, S., Joyce, J. N. Terminally differentiated SH-SY5Y cells provide a model system for studying neuroprotective effects of dopamine agonists. Neurotoxicity Research. 5 (8), 579-598 (2004).
  39. Qiao, J., Paul, P., et al. PI3K/AKT and ERK regulate retinoic acid-induced neuroblastoma cellular differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 424 (3), 421-426 (2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

SH-SY5Y Diferansiyasyonuİnsan Nöronal KültürüSerum AçlığıHücre Dışı Matriks ProteinleriNörotrofik FaktörlerTrypsin EDTADiferansiyasyon MedyumuECM Kaplı KaplarTerminal Diferansiyasyon
SH-SY5Y İnsan Nöroblastom Hücre Hattı Farklılaşma
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.