Yüksek verim Mikroplate Solunum Ölçümler Fare İskelet Kası Minimal Miktarları gelen kondriyayı İzole kullanma

Özet

Sunulan yöntemler, minimum miktarlarda fare iskelet kasından izole mitokondri kullanılarak yapılan bir mikroplaka bazlı respirometrik tahliller koleksiyonunun performansı için adım adım talimatlar sağlar. Bu tahliller, yaygın olarak kullanılan bir hayvan modelinde mitokondriyal oksijen tüketimindeki mekanik değişiklikleri/adaptasyonları ölçebilir.

Özet

İskelet kası mitokondrileri birçok hastalık patolojisinde spesifik bir rol oynamaktadır. Bu nedenle, bu dokudaki mitokondriyal fonksiyonun bir göstergesi olarak oksijen tüketiminin ölçümü daha yaygın hale gelmiştir. Çeşitli hücrelerde, dokularda ve türlerde mitokondriyal solunum yollarını ölçen birçok teknoloji ve test mevcut olmasına rağmen, mikroplaka bazlı teknolojilerde kullanılmak üzere fare iskelet kasından izole mitokondri kullanılarak bu testlerin derlenmesi ile ilgili olarak literatürde şu anda bir boşluk bulunmaktadır. Daha da önemlisi, mikroplaka bazlı respirometrik tahlillerin kullanımı, minimum miktarlarda izole mitokondri kullanarak yüksek verimli ölçümlere izin verdiği için mitokondriyal biyologlar arasında artmaktadır. Bu nedenle, yaygın olarak kullanılan bir hayvan modelinde oksijen tüketimindeki mekanik değişiklikleri/adaptasyonları değerlendirebilen bir mikroplaka bazlı respirometrik tahliller koleksiyonu geliştirilmiştir. Burada sunulan yöntemler, bu tahlilleri optimal miktarda mitokondriyal protein ve reaktiflerle ve her bir tahlilin dinamik aralığı boyunca minimum varyans ile kanıtlandığı gibi yüksek hassasiyetle gerçekleştirmek için adım adım talimatlar sağlar.

Giriş

İskelet kası mitokondri ana fizyolojik rolü oksidatif fosforilasyon ¹ ATP üretmektir. Önemlisi, iskelet kası mitokondrinin ^3, dejeneratif hastalıkları ⁴ ve Tip II diyabet ⁵ yaşlanma, egzersiz kapasitesi ² belirli bir rol oynamaktadır. Yaşlanan bir toplum ve Tip II Diyabet ABD'de ⁶ ölüm ^7. önde gelen nedeni olarak, mitokondriyal fonksiyonu değerlendirmek yöntemlere ihtiyaç biyomedikal araştırma ^7,8 giderek daha yaygın hale gelmiştir. Oksidatif fosforilasyon ⁹ fonksiyonel bileşenlerini ifade mitokondriyal ve nükleer genom koordineli fonksiyonunu temsil beri Özellikle, oksijen tüketiminin ölçülmesi mitokondriyal fonksiyon değerlendirilmesinde olağanüstü yarar vardır.

Çeşitli teknolojiler bu sağlam hücrelerde oksijen tüketiminin ölçümü sağlar ve izole bulunmamaktad mitokondri ^7-10. Buna ek olarak, deneyler, birden fazla hücre tipi ve dokusunda için geliştirilen ve mitokondriyal yolları ve solunum kontrolü ^9,11,12 ölçümüne imkan veren türün çeşitli edilmiştir. Bununla birlikte, mikro-tabanlı oksijen tüketimi teknolojileri kullanım için fare iskelet kasından izole mitokondri kullanarak bu tahlillerin tümüne derlenmesine açısından literatürde void vardır. Önemlisi, mikroplate bazlı Respirometrik tahlillerin kullanılması mitokondriyal biyologlar arasında büyüyen ve izole mitokondri ⁹ minimal miktarlarda kullanılarak yüksek verimli ölçümler için izin verir. Bu nedenle, mikroplate bazlı Respirometrik tahliller bir koleksiyon anormallikleri ve / veya uyarlamalar elektron taşıma zinciri (ETC) meydana olabilir nerede saptayarak izin veren geliştirilmiştir. Buna ek olarak, iki ilave mikroplaka göre respirometrik deneyler koordinasyon değerlendirme betwee etkinleştirmek geliştirilmiştirtrikarboksilik asit (TCA) döngüsü ve OGS ve ß-oksidasyon ve VB ile n Önemlisi, sunulan yöntemlerin yaygın olarak kullanılan bir hayvan modelinde mitokondriyal fonksiyon mekanik değişiklikleri ölçmek için bir açık ve özlü bir yol sağlar.

Protokol

NOT: Bir kırmızı iskelet kası mitokondri izole sonra Bu protokol başlar. Kırmızı iskelet kası ^13, 100 mg - daha önce ~ 75 altında tarif edildiği gibi Mitokondri izole edilmiştir. Mitokondriyal protein 10 ug / ul mitokondri için izolasyon tampon ≤50 ul son mitokondriyal pelet (IBM) 2 (Frisard ve ark ¹³ bakınız) resuspending doku bu tutardan ulaşılacaktır - 5 arasında.

1. Kur

1. Sonraki deneyleri için stok çözeltileri (Tablo 1) ve mitokondriyal tahlil çözeltisi (MAS) karışımları (Tablo 2) çalışma hazırlayın.
   Not: En stokları çözeltiler ve MAS saklanabilir gibi tahliller için hazırlık çoğu önceden yapılabilir.
2. 37 ° C 'de olmayan bir _CO2 inkübatör içinde deneyden önce gece 1 mi kalibrasyon çözelti içinde respirometrik deney kartuşu hidratı.
3. Deney, t günlük37 ° C banyo veya inkübatör donmuş stokları (yüzeyler ve mitokondriyal modülatörleri MAS karışımı, MAS BSA o / w, Tablo 1) ve çözülme dışarı ake.
4. Tüm alt-tabaka solüsyon (Tablo 3) ve iğne (Tablo 4-5) hazırlamak ve (pH 7,4), arzu edildiği gibi pH ayarlamak. PH değeri ayarlandıktan sonra, buz üzerinde muhafaza edin.
5. Program, uygun karışımı, bekleyin ve ölçü parametreleri çok iyi oksijen tüketimi ölçüm makine ilk "Standart" modunda ardından analiz yazılımı, girerek ve etiket arka plan ve grup / durumu kuyular (Tablo 6 bakınız).
   1. "Misafir" forumunda giriniz ve "Testi Sihirbazı" üzerine tıklayın. Bir kez "Deney Wizard" olarak, karışımı değiştirmek bekleyin ve parametreleri ölçmek için "Protokolü" üzerine tıklayın. "Geri altında arka plan kuyuları etiketleyin. Düzeltme "sekmesine gidin ve vurgulamak için emin olun" "arka plan düzeltme yapın.
   2. Etiket koşul"Grup Info" sekmesinin ardından "Gruplar ve Etiketler" sekmesine tıklayarak ilk tarafından itions. Bu parametreler girildikten sonra, "Save Template" ardından tıklayın "End".

2. Testi Çalıştır

1. Bir tahlil çalıştırmak kartuşu içine enjeksiyon çözümleri yükleyin ve ilk "Standard" moduna girerek takip analiz yazılımı, girerek kalibrasyonu başlatın. "Misafir" forumunda giriniz. "Şablonlar" sekmesi altındaki "XF" sürücüsünün altında adım 1.5 kaydettiğiniz şablonu açın. Açık kez kalibrasyon başlamak için "Başlat" a tıklayın.
   Not: Tahlil çalıştırmak kartuş alt sol kesik köşesi makinenin içine girilmelidir. Bu yaklaşık 30 dakika sürer. Uygun liman içine enjekte çözüm için özen gösterin. Tablo 4-5 enjeksiyonları yükleme sırasına göre listelenir.
2. Yavaşça, ama iyice karıştırın mitochondnazikçe makas ile ucu ucuna kapalı ~ 3 mm keserek genişletmiştir onun deliği olmuştur 200 ul pipet ile stok triturating ardından 200 ul pipet ile çözüm karıştırılarak ria stok.
3. Mitokondriyal stokunun protein konsantrasyonu belirlemek için bir bisinkoninik asit (BCA) deneyi gerçekleştirmek.
4. Aşama 2.3 elde edilen stok konsantrasyonu kullanarak, / sukinat / rotenon substrat karışımı 200 ul (Tablo 3), mitokondriyal protein 10 ug yeniden süspanse edin. Mitokondriyal protein 14 ug / kalan substrat karışımları 200 ul (Tablo 3) (Bu, her substrat karışımı için yapılmalıdır) tekrar süspansiyon. Tüm mitokondriyal protein / alt-tabaka buz karışımları yerleştirin.
   Not: Önceden ⁹ tarif edildiği gibi her bir deney için oyuk başına mitokondriyal protein optimal miktarı belirlenmiştir. Bu tespit edilmiştir piruvat / malat, palmitoil karnitin / malat, glutamat / malat birsüksinat / rotenone tahlil mitokondriyal protein 2.5 ug başına iyi kullanır iken d elektron akışı deneyleri, mitokondriyal protein 3.5 ug kullanır. Bu nedenle, araştırmacı 4 beri bu adımda çoğaltır için yeterli mitokondriyal protein tekrar süspansiyon gerekiyor ya 2.5 ug veya 50 ul başına 3.5 ug kuyu başına yüklenir (adım 2.6 bakınız).
5. Yavaşça, ama iyice hafifçe sonu ~ 3 mm olmuştur 200 ul pipet ile stok triturating ardından 200 ul pipet ile çözüm karıştırılarak mitokondri / substrat çözümleri karıştırın kesti.
6. Yük 50 ul / oyuk mitokondri / substrat karışımı her biri buz üzerinde ve üç kopya halinde bir hücre kültür plakası yerleştirin. Mikro-bazlı respirometrik tahlilin geliştiriciler, tercihan, hücre kültür plakası üzerine iki tarafında, iki boş (mitokondri) kuyu en az bırakarak önerilir.
7. 4 ° C'de 20 dakika boyunca 2000 g'da hücre kültürü plakası dönerler. Plaka s ikeniğneleme, 37 ° C su banyosunda substrat çözümleri ısınmak.
8. Sıkma işlemi tamamlandıktan sonra, dikkatli bir şekilde, ilgili haznelerin üstüne her bir taban çözeltisi 450 ul yük (örneğin, başlangıçta bu alt-tabaka çözeltisi içinde yeniden süspansiyon haline getirilmiş mitokondri sahip oyuklara piruvat / malat substrat yük). RT'de plaka yüklemek için emin olun. Not: Boş kaplar alt-tabaka 500 ul ile yüklenmiş olması gerekir. Birleştirilmiş bir deney boş oyukları birleştirme deneyi, substrat ile yüklenebilir ise elektron akışı analizi için belirlenmiş Boş kaplar, elektron akışı alt-tabaka (Piruvat / Malat + FCCP) ile yüklenmiş olması gerekir.
   Not: Aynı plaka üzerinde akuple ve elektron akış deneyleri gerçekleştirmek Eğer tahlil çalıştırmak "Enstrüman" sekmesinden "XF Reader" platformu kullanarak tamamlandıktan sonra, araştırmacı ilgili deneyleri arka plan kuyuları yeniden atamanız gerekir. Bir kez "Enstrüman" ortamında, "Administration" linkine tıklayın"Arkaplan Düzeltme" takip sekmesi. Tamamlandığında Hit "Cihaz Kurulumu Mode End". Askorbat / TMPD kombinasyonu böylece ayrı bir arka plan düzeltmesi her tahlil türü için gerekli olan _O 2, tüketmek olmasıdır.
9. Alt-tabakanın 450 ul her bir göze ilave edildikten sonra, mitokondri, tek tek tabaka içinde muntazam bir şekilde dağılmış olduğundan emin olmak için iyi bir mitokondri katmanı görüntülemek (20X büyütme [Rogers ⁹ Bakınız, Şekil 4]). Bir eşit dağıtılmış tek tabaka var görünmüyor Wells sonrası hoc kaldırılabilir.
10. Mitokondriyal bağlılık için kontrol ettikten sonra, respirometrik tahlil aracı haline mikroplağı yerleştirin ve "Tamam" tıklayarak çalıştırın tahlil başlayın.
    Not: run başlayacak önce adım 2.1 kalibrasyon eksiksiz olmalıdır. Araştırmacı "Tamam" tıkladığında, makine kalibrasyonu için kullanılan bir yardımcı programdır plakasını çıkarır.
    1. yarar plakasını çıkarın ve tepsiye mitokondri içerir hücre kültürü plakasını yerleştirin. Hücre kültürü plaka üzerinde mavi çentik kasetin sol alt köşesine yerleştirilmelidir. Tahlil çalışmasını başlatmak için "devam" üzerine tıklayın.
11. Çalışma tamamlandıktan sonra, ekranda "Çıkart" düğmesine basarak hücre kültürü plakasını ve kartuşu çıkarın.
    1. Plaka atılır sonra, kaldırmak ve hücre kültürü plakasını ve kartuşu atmak ve ekranda "Devam" butonuna tıklayınız. Run otomatik olarak "Veri" dosyasında bir .xls dosyası olarak kaydedilecektir.
12. Bu dosyayı açın ve altındaki aşağı ok vurarak "OCR" ile "O2" dan görüntüsünü değiştirmek "Y1:" işaretleyici.
    1. Seçeneği altında: Sonraki değişiklik için "Noktadan Noktaya Oranları" "Middle Point" "Oranı Verileri görüntüleniyor". Bu değişiklikleri uygulamak için "Tamam" düğmesine tıklayın.
13. Birbirine benzer koşullar grup kuyuları için ekranın alt solunda "Eh Grubu Mode" sekmesini tıklayın. Son olarak, sola, ekranın ortasına doğru "Örnek Ortalama / Standart Hata" sekmesine tıklayın. Tahlil "Tahlil Sihirbazı" ayarı başlamadan Alternatif olarak, bu komutlar kurulum olabilir.
    Not: Her koşul her oranda ve her durum için görüntülenen ± standart sapma bir ortalama olacaktır. Durum (Devlet 2 [Kavrama] / State3u [Elektron Akışı] solunum dört enjeksiyonları takiben) başına alınan hızı ölçümleri vardır. , Enjeksiyon oligomycin sonra asgari noktada State 4o belirlemek, ikinci ölçüm Devlet 2 oranının ortalamasını kullanın sırasıyla ADP ve FCCP enjeksiyonu, sonra Devlet 3 ve Devlet 3U için maksimum noktası kullanmak ve Antimycin A için minimum noktası kullanmak Kavrama Tahliller için indüklenen solunum. Minimum kullanmak, piruvat / malat kaynaklı Devlet 3u solunum için maksimum noktası kullanınrotenone kaynaklı solunum için gelin, süksinat kaynaklı Devlet 3u solunum için maksimum noktası kullanmak ve Elektron Akış analizi için Antimycin bir neden olduğu solunum için minimum noktasını kullanın. Bütün deneyler 3 kez yapıldı ve gösterilen veriler temsili bir izleme sonuçlarıdır.

Sonuçlar

Şekil 1 piruvat / malat, süksinat / rotenone, palmitoil karnitin / malat ve glutamat / malat deneyler (Kavrama Tahliller) için oksijen tüketimi oranlarını (OCR) temsil eder. Bu tahlil iz, Oksijen Tüketimi Oranı veya OCR, vs zaman olarak gösterilir arka correceted edilir ve noktadan noktaya oranları olarak görüntülenir. Her panel Şans ve Williams ¹⁴ tarafından açıklandığı gibi farklı mitokondriyal devletlerde oksijen tüketimini gösterir. Birinci panel, ADP enjeksiyonundan sonra bazal oksijen tüketimi ya da State 2. ikinci panel, temsil eden oligomycin enjeksiyonu (Karmaşık V inhibitörü) sonra, maksimal birleştiğinde solunum ya da State 3. Üçüncü paneli temsil nedeniyle solunum temsil proton sızıntısı, ya da Devlet 4o için. Dördüncü panel FCCP enjeksiyonundan sonra, maksimum Kuplajsız solunum veya Devlet 3U temsil eder. Son olarak, beşinci paneli Antimycin A enjeksiyonundan sonra, oksidatif solunumun engellenmesini gösterir. Özellikle, arkl mitokondriyal devletler minimal standart sapma var. Bu mitokondriyal stok ve mitokondri / substrat karışımları ve bağlılık dönüş (Adım 2.6) sonra mitokondri tek tek tabaka ulaşma kapsamlı karıştırma kaynaklanmaktadır. Öte yandan, her bir göze olup mikrolevhanın oyuk mitokondri tek tek tabaka elde eşit olmayan mitokondri yükleme Şekil 2 'de gösterildiği gibi, her bir durumda, standart sapma sebep olur.

Her mitokondriyal devlet ve her alt tabaka için Şekil 1 ekran yaylalarda iz. İki ölçüm döngüsünden sonra elde plato iyi mitokondriyal kalitesini göstermektedir ve mitokondri tahlil süresince de uyulması kalması. Bu sayede oluşabilecek önyargı azaltarak, araştırmacı bu mitokondriyal devletlerin ortalama OCR almasına izin veriyor çünkü ek olarak, plato maksimal oranları ulaşılması daha arzu edilebilirkeyfi bir noktaya seçerek.

Oyuk başına mitokondri miktarı optimizasyonu çalışmalarla belirlenmiştir. Oyuk başına mitokondri optimum miktar, State sonuçlanmalıdır 100-200 pmol / dak / oyuk ve devlet 3 oranları <2 ila oranları 1500 pmol / dak / oyuk, bu değerler, çok oyuklu oksijen dinamik oksijen algılama aralıkta olması nedeniyle tüketim ölçüm makinesi. Kuyu başına çok mitokondriyal protein yüklenmesi. Enstrüman (Şekil 3A) dinamik aralığın dışında OCRs neden (3 kuyu başına mitokondriyal protein yüklenmesi 2.5 ug göre kuyu başına mitokondriyal protein (mavi izleme) ve 3.5 ug yükleniyor tasvir kırmızı Şekil olabilir süksinat / rotenone tahlil için) izleme. Kuyu başına çok mitokondriyal protein yüklenmesi de böylece birbirini izleyen ölçümü ⁹ (Şekil 3B doğru ölçümü engelleyen, kuyunun microchamber içinde oksijenin tükenmesi yol açabilir/ strong>). Noktadan noktaya OCR OCR değişim anlık oranıdır. Düz ise, OCR / sabit kararlı olduğunu, ancak azalan, sonra bir biyolojik veya teknik bir sorun olabilir. Devlet 3 Devlet 3u solunum (Şekil 3A) OCR dik düşüş ölçümü (Şekil 3B) sonundan önce oksijen kaynağı yorucu mitokondri neden olur.

Şekil 4, elektron akışı analizi için zamana karşı OCR temsil eder. Şekil 1 için tarif edildiği gibi izleme giderilmiştir ve görüntülenir. Bu deneyde ilk panel ikinci panel, rotenone enjeksiyonundan sonra, kompleks I aracılı solunum inhibisyonu Kompleks I ile piruvat / malat Devlet 3u solunum temsil eder. Üçüncü paneli, süksinat enjeksiyonundan sonra, elektronlar Kompleks II'nin (Site II aracılı solunum) de ETC girerek substrat uyarılan Devlet 3U temsil eder. Antim enjeksiyonundan sonra dördüncü panelgentamisin A, Kompleksi III ve böylece toplam solunum inhibisyonu temsil eder. Son olarak, beşinci paneli, askorbat / TMPD enjeksiyonundan sonra, Kompleks IV aracılı solunum temsil eder. Şekil 1'de traselerine benzer tüm mitokondriyal devletler minimal standart sapma var ve her oran bir plato ulaşmıştır neredeyse vardır ya.

Şekil 1. Birleştirme Deneyleri (A). 10 mM piruvat / 5 mM malat, (B), 10 mM süksinat / 2 uM rotenon, (C) 40 uM palmitoil karnitin / 1 mM malat ve (D) 10 mM glutamat / 10 mM oksijen tüketimi, çok oyuklu ölçümü ile tespit edildiği üzere, malat mitokondriyal solunum deney trase bağlanmış. Değerler ortalama ± SD olarak ifade edilir. Kuyu başına yüklenen Mitokondriyal protein süksinat / rot dışındaki tüm analizleri için 3.5 ug oldumitokondriyal protein 2.5 ug göz başına kullanan enon. Veriler, n = 3 eşleştirilmiş biyolojik çoğaltır temsil eder. OCR = Oksijen Tüketim Hızı; ADP = Adenozin difosfat; Oligo = oligomycin A; FCCP = Karbonil siyanür 4 - (triflüorometoksi) fenilhidrazon; Anti-A = Antimycin A; PYR = Piruvat; SUCC = Süksinat; ROT = Rotenone; PAL-C palmitoil karnitin =; GLUT = glutamat. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2. Yüksek derecede Değişken Piruvat / Malat Deneyi. Eksik ve böylece değişken mitokondriyal pro yol alt tabaka / MAS karışımı mitokondriyal stoktan mitokondri karıştırma kaynaklanan yüksek değişken 10 mM piruvat / 5 mM malat tahlilHer oyuktaki tein yükleme. Oyuk başına yüklü Mitokondrial proteini 3,5 ug idi. Veriler, n = 3 eşleştirilmiş biyolojik çoğaltır temsil eder. OCR = Oksijen Tüketim Hızı; ADP = Adenozin difosfat; Oligo = oligomycin A; FCCP = Karbonil siyanür 4 - (triflüorometoksi) fenilhidrazon; Anti-A = Antimycin A; PYR = Piruvat. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Sukinat / Rotenone Testi için Şekil 3. Aşırı Mitokondriyal Protein. (A) kuyu başına mitokondriyal protein (mavi izleme) ve 3.5 ug yükleyerek neden çok iyi oksijen tüketimi ölçüm makinesinin dinamik aralığının dışında Oksijen tüketimi oranları kuyuda (kırmızı izleme) başına mitokondriyal protein yüklenmesi 2.5 ug göre. (B ) Oxyaklaşan gerginlik yGen sıfır ADP ve kuyu başına mitokondriyal protein optimal miktarda (2.5 ug) (kırmızı izleme) yüklenmesi ile karşılaştırıldığında iyi (mavi tracing) başına aşırı mitokondriyal protein (3.5 ug) yükleyerek neden FCCP enjeksiyonlar takip. Veriler mitokondriyal protein miktarı başına n = 3 eşleştirilmiş biyolojik çoğaltır temsil eder. OCR = Oksijen Tüketim Hızı; ADP = Adenozin difosfat; Oligo = oligomycin A; FCCP = Karbonil siyanür 4 - (triflüorometoksi) fenilhidrazon; Anti-A = Antimycin A; SUCC = Süksinat; ROT = Rotenone; O ₂ = oksijen; cıva mm Hg = milimetre. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4. Elektron Akış Testi. 5 mM piruvat / 1 mM malat + 4 iM FCCP, elektron foksijen tüketimi, çok oyuklu ölçülmesi ile belirlendiği üzere, düşük mitokondriyal solunum deneyi takip. Değerler ortalama ± SD olarak ifade edilir. Oyuk başına yüklü Mitokondrial proteini 3,5 ug idi. Veriler, n = 3 eşleştirilmiş biyolojik çoğaltır temsil eder. OCR = Oksijen Tüketim Hızı; Anti-A = Antimycin A; Artan = Askorbat; TMPD = N, N, N ', N' tetrametilsiklopentadienil p -fenilendiamin. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Ayıraç	Hazır Konsantrasyon	MW	Nihai Cilt	Kitle Eklendi	Yorumlar / Açıklama
	(M)	(g / mol)	(mi)	(g veya ml)
EGTA, pH 7.2	0.1	380,35	1 M Tris baz, 100 mi	3,801 g	Mağaza 4 ° C 'de
HEPES	1	238,3	Dihidro 2 O 250 mi	59. 57 g	Mağaza 4 ° C 'de
MgCl2, heksahidrat	1	203,31	Dihidro 2 O 250 mi	50,82 gr	Mağaza 4 ° C 'de
Piruvat pH 7.4	0.1	88,06 (14,11 M solüsyon olarak gelir)	Dihidro 2 O 40 mi	Piruvik asit 0,283 mi	-20 ° C'de 1 ml'lik numuneler hazırlayın ve mağaza sağlayın her iki haftada bir taze yapmak
Süksinat pH 7.4	0.5	118,09	Dihidro 2 O 100 mi	Su 9.4 gccinic asit	-20 ° C'de 1 ml'lik numuneler hazırlayın ve mağaza sağlayın
Malat, pH 7.4	0.5	134,09	% 95 Etanol 100 ml	Malik asit 6.7 g	-20 ° C'de 200 ul alikotları ve mağaza olun
TMPD	0.01	164,25	10 mi	0,0164 g	-20 ° C'de 300 ul alikotları ve mağaza olun; Indirgenmiş TMPD tutmak için askorbat bir eş-molar miktarıyla karıştırılır
Palmitoil L-karnitin klorit	0.01	436,07	% 95 Etanol ve 1.14 mi	0.005 g	-20 ° C'de 40 ul alikotları ve mağaza sağlayın
Oligomycin A	0.006	791,06	% 95 Etanol 0.987 ml	0.005 g	-20 ° C'de 20 ul alikotları ve mağaza sağlayın
FCCP	0.01	254,17	% 95 Etanol ve 3,9 mi	0,01 g	-20 ° C'de 40 ul alikotları ve mağaza sağlayın
Rotenone	0.001	394,4	% 95 Etanol ve 10 ml	0.0039 g	-20 ° C'de de
Antimycin A	0.005	548,63	% 95 Etanol ve 9.12 mi	0.025 g	-20 ° C'de de
K + ADP	0.5	501,32	MHP 2 O 3.9 ml	1.0 g	-20 ° C'de de
Malik asit, pH 7.4	0.5	134,09	40 mi	2.68 g	-20 ° C'de 200 ul alikotları ve mağaza olun

Stok Çözümleri

Ayıraç	Hazır Konsantrasyon	Kitle Eklendi	Final Molarite / Yüzde
	(M)	(g veya ml)
Sakaroz	-	11,98 g	70 mM
Mannitol	-	20.04 gr	220 mM
Potasyum fosfat monobazik	-	0.34 g	5 mM
MgCl2, heksahidrat	1	2,5 mi	5 mM
HEPES	1	1,0 mi	2 mM
EGTA	0.1	5,0 mi	1 mM
Esas yağlı asit, SERBEST BSA	-	1.0 g	% 0.20

. Tablo 2. MAS Mix pH 7.4, 500 ml: Kısım 25 ml ve mağaza -20 ºC * Not at: tahlil enjeksiyonlar için kullanılan MAS karışımı için BSA hariç.

Yüzey Orta	Nihai Konsantrasyon	Stokta miktarı (ul)	MAS * Miktarı (ml)
Piruvat / Malat	10 mM / 5 mM	Piruvat: 1000	9
		Malat: 100
Succicinate / Rotenone	10 mM / 2 mcM	Süksinat: 200	10
		Rotenone 20
* Piruvat / malat + FCCP	5 mM / 1 mM / 4 uM	Piruvat: 500	10
		FCCP: 4
		Malat: 20
Palmitoil L-karnitin / Malat	40 uM / 1 mM	Palmitoylcarnitine: 40 malat: 20	10
Glutamat / Malat	10 mM / 10 mM	Glutamat: 400	10
		Malat: 200

Tablo 3. Yüzey Çözümleri pH 7.4: Deney gün taze olun. * Elektron akış deneyi çözeltisi.

Enjeksiyon Orta	Konsantrasyon	Stokta miktarı (ul)	MAS Miktarı (ml)	Tutar Kartuş enjekte	Nihai Konsantrasyon
					(İkinci levha enjekte)
ADP	50 mM	300 ul	3	50 ul	5,0 mM
Oligomycin A	20 uM	10 ul	3	55 ul	2,0 uM
FCCP	40 uM	12 ul	3	60 ul	4,0 uM
Antimycin A	40 uM	24 ul	3	65 ul	4,0 uM

TCoupled Tahliller için mümkün 4. Enjeksiyonlar pH 7.4. Deney gün taze olun. * Birleştirme tahlilleri bulunmaktadır (bunlarla sınırlı değildir), piruvat / malat, süksinat / rotenon, palmitoil karnitin / malat ve glutamat / malat.

Enjeksiyon Orta	Konsantrasyon	Stokta miktarı (g veya ul)	MAS Miktarı (ml)	Tutar Kartuş enjekte	(İkinci levha enjekte) nihai konsantrasyon
Rotenone	20 uM	60 ul	3	50 ul	2,0 uM
Sukinat	50 mM	300 ul	3	55 ul	5,0 mM
Antimycin A	40 uM	24 μl	3	60 ul	4,0 uM
TMPD / Ascorabte	1 mM, 100 mM	TMPD: 300 ul	3	65 ul	100 uM, 10 mM
		Askorbat: 0,059 g

Elektron Akış Testi için Tablo 5. Enjeksiyonlar pH 7.4. Deney gün taze olun

Komut	Süre (dk)	Döngü içinde
Kalibre
Bekleyin	10 dakika (plaka uyumu aşamasından ısınmasını sağlamak için)
Karıştırmak	1 dakika	2
Beniaşure	2 dakika
A enjekte
Karıştırmak	1 dakika	2
Tedbir	2 dakika
B enjekte
Karıştırmak	1 dakika	2
Tedbir	2 dakika
C enjekte
Karıştırmak	1 dakika	2
Tedbir	2 dakika
D enjekte
Karıştırmak	1 dakika	2
Tedbir	2 dakika

Tablo 6. Enstrüman çalıştırın Protokolü.

Tartışma

Fare iskelet kası 100 mg - Bu makalede sunulan yöntemler 75 izole edilen mitokondri kullanarak mikroplaka bazlı Respirometrik tahlillerin bir koleksiyon performansı için adım adım yönergeler sağlar. Üç kopya halindeki gözlerin arasında sıkı standart sapma ile kanıtlandığı gibi Bu deneyler, yüksek bir kesinlikle gerçekleştirilebilir. Önemlisi, bu Respirometrik deneyler anormallikler ve / veya uyarlamalar yaygın olarak kullanılan bir hayvan modelinde ETC, TCA döngüsü, β-oksidasyon yolu, alt tabaka taşıyıcılar, vb meydana olabilir nerede saptayarak izin verir.

Bu protokolde kullanılan çeşitli yakıtlar ve inhibitörleri kullanım gerekçesini vurgulamak önemlidir. Piruvat / malat ve glutamat / malat respirometrik deneyler Kompleks I aracılı solunum değerlendirmesi ve aynı zamanda bunların ilgili taşıyıcılar değerlendirilmesi için izin verir ve glutamat durumunda deaminaz ^15. Seçenek olarak ise, kombinerotenone karmaşık I inhibe eder ve süksinat flavin adenin dinükleotid azaltılması yoluyla Kompleks II'nin elektronları sağladığı süksinat / rotenone (FADH ₂₎ ¹⁵ ETC Kompleksi II ile mitokondriyal solunum akının değerlendirilmesini sağlar. Bu deneyler kavrama verimliliği ve maksimal solunum olarak substrat özgü bilgiler sağlar. Elektron akış deneyi substratları ve önleyicilerinin kombinasyonu mitokondriyal solunum akı ⁹ sırasında birden fazla kompleksleri değerlendirilmesi için izin vermesidir eşsizdir. Süksinat ardından rotenone enjeksiyon Kompleksi II tarafından tahrik değerlendirme maksimum solunum için izin verirken piruvat / malat + FCCP ilk substrat karışımı, Kompleks I tarafından yönlendirilen maksimal solunum değerlendirilmesi için izin verir. Askorbat enjeksiyonu takiben Antimycin A enjeksiyonu, Kompleks III inhibitörü, / TMPD Askorbat yana Kompleks IV ile tahrik edilen solunum değerlendirilmesine olanak tanır / TMPD is anSitokrom C / Kompleks IV elektron verici. Bağlama verimliliği hiçbir bilgi elde edilirken, yöntem bağımsız birden fazla alt tabakaları çalışan engel çok küçük örneklem büyüklüğü için idealdir. Son olarak, palmitoil karnitin / malat kullanılması β-oksidasyon ve palmitik asit (β-oksidasyon) oksidasyonu sonucunda ortaya çıkan indirgeme eşdeğer beri ETC arasındaki koordinasyon değerlendirilmesi için izin verir flavoprotein ¹⁵ aktarma elektron yoluyla ETC besleyen. Bu bağlama ve elektron akış deneyleri, aynı zamanda, bazı müdahale nedeniyle (ilaç tedavisi, genetik manipülasyon) mitokondriyal fonksiyon değişiklikleri tespit etmek üzere birbiri ardında olarak kullanılabileceği unutulmamalıdır.

Bu tahliller için elde yüksek hassasiyetli protein tayini, ya da alt-tabaka çözeltiler ile önceden olup, mitokondri iyice karışması yatmaktadır. Bu doğrultuda, mitokondri kez substrat solutio içinde resuspendend edilirns, bu genişletilmiş bir menfez pipet ile Aşama 2.2 de tarif edildiği gibi hücre kültür plakası yüklemeden önce iyice Bu çözelti karıştırmak için kritik öneme sahiptir. Mitokondri karıştırmak için Başarısızlık iyice tahlil içinde büyük değişime yol açacaktır. Buna ek olarak, mitokondri karıştırma ve süre kesme kuvvetleri yaratacak dar delikli bir pipet kullanarak yapışma adım (2.7) de bu protokolü önemli bir adımdır mitokondriyal membranlar ve Sitokrom C salınımını zarar potansiyelini artırır. Uzun / yeterince hızlı yüklenen hücre kültürü plakasını dönmeye Başarısızlık böylece kuyu ve ölçümler arasında artan değişkenliği lider, kuyuya mitokondri eksik bağlılık neden olacaktır.

Hisse senedi ve yüzey çözümleri yapmak için doğru konsantrasyonları / hazırlama yöntemleri kullanılarak, başına iyi mitokondriyal protein optimum miktarda yükleme tahlil çalıştırmak değiştirerek mitokondriyal devlet pla sağlamak için: açıklanan protokol içerecek şekilde optimize edilmiştirteaus ve mitokondriyal stok ve mitokondriyal / substrat karışımları uygun karıştırma. Bu optimizasyon çalışmalarından önce, yazarlar tahlil vadede tuzaklar karşılaştı. Aşağıdaki sorun giderme yöntemlerini / bu protokolü optimize yararlı değişiklikleri tartışıyor. Microchamber içindeki oksijeni dışarı atmasını sağlar ve ölçümde yol açacaktır çok mitokondri yüklenirken optimal yüklenmesi ile ilgili olarak, yükleme çok az mitokondri, güçlü bir yanıt ortaya çıkarmak olmaz. Rogers ve diğerleri ⁹ mikroplaka göre respirometrik deneyleri için oyuk başına mitokondri optimal yükleme miktarını belirlemek örnekleri sağlar. Daha sık, çok fazla mitokondri başına yüklenen sıra devlet tarafından kanıtlanan 2 oranlarını 100-200 pmol / dakika boyunca / kuyu ve devlet 3 oranlar> 1500 pmol / dak / kuyu olduğunu. (. - 10 ug, örneğin 1 arasında) dinamik r içindeki OCRs ortaya çıkarmak için üzerinde yükleme oluşursa, mitokondriyal protein konsantrasyonu değişen bir deneyi gerçekleştirmekoksijen tüketimi ölçüm makinesinin ange. Hazırlanması ve yüzeylerde ve stokların doğru konsantrasyonları kullanılarak büyük önem taşımaktadır. Her alt-tabakalar / enjeksiyon asit formunun kullanımı ve potasyum hidroksit ya da HCI ile pH ayarlamak; Sodyum tamponları / çözüm tavsiye edilmez. Buna ek olarak, resuspending yüzeyler / DMSO veya% 100 etanol içinde stokları ölçüm hatası veya hata neden olur. Not nerede% 95 etanol kullandığınızdan emin olun. Bu palmitoil karnitin ve böylece büyük bir değişkenlik neden dondurulmuş stok çözündürüldükten sonra% 95 etanol içinde çökelmeye yaygındır. Kullanmak için iyi önce palmitoil karnitin stok ve girdap ısınmak emin olun. Buna ek olarak, bir çok değişken piruvat / malat tahlil sonucu nedeniyle 2 hafta eski piruvat stok varlığa> olabilir. Pirüvat dondurulmuş alikotları 2 haftada yeniden emin olun. Tahlil çalıştırmak mitokondriyal devlet yaylaları sağlamak için 2-min ölçümlerine güncellenmiştir. ADP tüketilmesi gözlem isteniyorsa, araştırmacı olabilir"Deney Sihirbazı" forumun altında "Protokol" sekmesi altında ölçüm süresini uzatmak. Son olarak, büyük değişkenlik mitokondriyal hisse senedi ve mitokondrinin artı alt tabakanın çözümleri yükleme tam öncesinde homojenize değildir oluşur. Kuyular arasındaki değişkenlik tahlil çalıştırdıktan sonra yüksek ise, tam öncesinde bir sonraki deneyde substrat çözüm karıştırmak emin olun. Asla mitokondri / substrat çözümleri vorteks yerine, püre karıştırın ve nazikçe genişletilmiş menfez pipet ile çiğnemek.

Fazlalaştı olan bu tekniğin bazı sınırlamalar vardır. İlk olarak, bu deneyler için kullanılan hücre kültürü levha üzerindeki kuyu sayısı nispeten düşüktür (yani., 24 kuyu ve boş kuyu için belirlenmiş en az 2). Bu bir plaka üzerinde, bu tahlillerde tüm 5 gerçekleştirmek için arzu edildiği takdirde, araştırmacı bir seferde sadece bir fare yanıtları incelemek edebilmektedir. Bununla birlikte, 96 gözlü araçlar highe için uygun olduğuna dikkat edilmelidirr çıktı. İkincisi, bozulmamış hücrelere ¹ ile karşılaştırıldığında izole mitokondri mitokondriyal disfonksiyon değerlendirilmesi doğasında güçlü ve zayıf yönleri vardır. Bazı zayıflıklar bozulmamış hücreler ve izolasyon süreci uyaran eserler ile karşılaştırıldığında daha az fizyolojik alaka sahip bulunmaktadır. Son olarak, bu yöntemin başarısı mitokondriyal izolasyon sürecinin kalitesi bağlıdır.

Bu deneylerin bir kısmını ya da farklı sistemlerde geliştirilmiştir ve diğer hayvan modellerinde doğrulanmıştır olmasına rağmen, burada sunulan metotlar, bir çok-çukurlu oksijen tüketimi ölçüm makinesi kullanılarak farede en iyi kullanım için yukarıda bahsedilen deneylerde tüm sentez ilk sırada iskelet kas. Böylece çok az malzeme ile yüksek verim sağlayan bir fare iskelet kasının 100 mg - Daha da önemlisi, bu tahlillerin tümüne 5 ~ 75 izole mitokondri miktarı ile gerçekleştirilebilir. Büyük öneme, çok çukurlu yeteneği arasındaoksijen tüketimi teknolojileri optimize edilmiş bir izolasyon yönteminin ile birleştirilmiş mitokondri minimal miktarlarda ile analizi gerçekleştirmek için, bir araştırmacı, iskelet kas dokusunda geri kalan diğer deneyler (örneğin., Western lekeleme çok sayıda gerçekleştirmek için olanak sağlar, RT-PCR, enzimatik deneyler, sık sık bu hayvan modeli ile bir mücadele vb).

Sonuç olarak, burada sunulan yöntemler fare iskelet kası minimal miktarlarda kullanılarak mikroplaka bazlı Respirometrik tahlillerin bir koleksiyon performansı için adım adım yönergeler sağlar. Önemli olarak, sunulan yöntemler doku ve mitokondri az miktarlarda gerektirir. Hakim sonra, burada tarif edilen teknikler araştırmacılar sıklıkla kullanılan bir hayvan modeli mitokondriyal oksijen tüketimi bir bileşik ya da bir gen ürünün muhtemelen mekanizmasını belirlemek için izin verir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Sucrose	Sigma Aldrich	S7903	RT
D-Mannitol'de	Sigma Aldrich	63559	RT'de saklayın
Potasyum fosfat monobazik, minimum% 99.0	Sigma Aldrich	P5379	RT'de saklayın
Magnezyum klorür heksahidrat, ACS reaktifi,% 99.0-102.0	Sigma Aldrich	M9272	RT HEMES'te saklayın
minimum% 99.5 titrasyon	RT'de Sigma Aldrich	H3375	Mağazası
EGTA	Sigma Aldrich	E4378	RT'de
Mağaza Esasen Yağlı	Sigma Aldrich	A6003	Mağazası 4 > C
Asit İçermez - BSA
Pirüvik Asit,% 98	Sigma Aldrich	107360	4 & ° C'de saklayın; C
Süksinik Asit	Sigma Aldrich	S9512
L (-) Malik Asit, BioXtra, vb.'de saklayın; %95	Sigma Aldrich	M6413	RT'de saklayın
L-Glutamik asit	Sigma Aldrich	G1251	RT'de saklayın
N,N,N′,N′-Tetrametil-p-fenilendiamin	Sigma Aldrich	T7394	RT'de saklayın
%99, toz [TMPD]
Palmitoil L-karnitin klorür	Sigma Aldrich	P1645	-20 °C'de saklayın; C
Oligomisin A, ≥% 95 (HPLC)	Sigma Aldrich	75351	-20 ° C'de saklayın; C
Karbonil siyanür 4- (triflorometoksi)	Sigma Aldrich	C2920	2 - 8 ° C'de saklayın; C
fenilhidrazon
≥ % 98 (TLC), toz [FCCP]
Streptomyces sp.'den antimisin A.	Sigma Aldrich	A8674	Mağazası -20 > C
Adenozin 5&asal;-difosfat monopotasyum tuzu dehidrat [ADP]	Sigma Aldrich	A5285	-20 °C'de saklayın; RT
trade'de	Rotenone	Sigma Aldrich	R8875
; BCA Protein Test Kiti	Termo Bilimsel	23225	N / A